Ce protocole peut être utilisé pour analyser les mécanismes de la division cellulaire dans le contexte des tissus vivants intacts à l’aide de microscopie de fluorescence. Le principal avantage de cette technique est que les environnements physiologiques indigènes des cellules sont préservés, tout en permettant l’imagerie en direct sur de longs cours de temps. La partie la plus importante de cette technique est de s’assurer que les testicules ne sont pas endommagés pendant la dissection ou le montage.
C’est une compétence qui est acquise avec un peu de temps et de pratique. La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car elle montre comment identifier et isoler les testicules, et comment les monter pour l’imagerie sans endommager le tissu. Préparez des animaux, des outils et des supports tels que décrits dans le manuscrit.
Avant de commencer la dissection, utilisez la seringue de filtre remplie de médias pour expulser trois gouttes de médias chacun 50 microlitres en haut, au milieu et au bas d’une glissière en verre. À l’aide d’une sonde disséquante, transférer de cinq à dix larves de troisième stade ou des nymphes précoces vers la goutte supérieure des médias sur la lame. Agitez doucement les larves et les pupes dans les médias avec la sonde disséquante pour enlever toute nourriture ou débris.
Utilisez la sonde disséquante pour tourner une seule larve ou une pupe sur le côté. Recherchez les deux testicules bilatéraux qui apparaissent comme des structures ovales translucides sur le tiers postérieur du corps. Les animaux qui n’ont pas de testicules sont des femelles et doivent être jetés.
Lorsqu’une larve ou une pupe mâle est trouvée et propre, déplacez-la vers la deuxième goutte de médias. Répéter jusqu’à ce que trois ou quatre larves mâles ou pupes aient été transférées à la deuxième goutte de médias. Puis en travaillant dans la deuxième goutte de médias, saisir un seul animal avec une paire de forceps à sa mi-région, juste antérieur aux testicules.
Utilisez une deuxième paire de forceps pour déchirer doucement l’animal en deux. À l’aide d’une paire de forceps, maintenez l’extrémité postérieure de l’animal vers le bas sur la glissière en verre. En commençant juste à côté des forceps, poussez vers le bas sur la cuticule en utilisant le bord du scalpel.
Déplacez le scalpel vers l’extrémité coupée de l’animal. Ceci expulsera les organes internes de l’animal, qui incluent les tripes, les corps gras, et les testicules. Les testicules sont des organes ovales incolores et presque transparents intégrés dans des rubans de graisse corporelle.
Taquiner doucement les testicules du reste des organes. Pour transférer les testicules un à la fois, insérez le bord du scalpel sous le corps gras, soulevez le tissu hors des médias, et déplacez-le rapidement à la troisième goutte. S’il n’y a pas assez de graisse corps encore attaché aux testicules pour soulever le tissu avec le scalpel utiliser une pipette pasteur en verre qui a été préwetted avec milieu de dissection.
En travaillant dans la troisième goutte de milieu, utiliser l’extrémité pointue du scalpel pour couper doucement l’excès de graisse du corps des testicules, laissant juste un petit bord de gros corps autour des bords. Tout d’abord, utilisez la seringue filtrante pour déposer une seule goutte du milieu de Schneider d’environ 30 microlitres au centre d’un plat de culture perméable au gaz de 50 millimètres. À l’aide de l’outil scalpel ou d’une pipette Pasteur pré-préparée, transférer jusqu’à cinq des testicules préparés à la goutte sur le plat.
Ensuite, utilisez l’outil scalpel pour pousser doucement les testicules vers le bas sur la membrane perméable au gaz, et dans le centre de la goutte de milieu. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, placez quatre gouttes d’huile d’halocarbone sur la membrane perméable au gaz entourant la chute du milieu. L’emplacement des gouttes doit correspondre aux quatre coins d’une couverture de classe de 22 millimètres.
Alignez ensuite les coins d’un couvercle en verre de 22 millimètres avec les quatre gouttes d’huile d’halocarbone et abaissez doucement le coverslip sur le média et l’huile. Laissez le coverslip s’installer, et pour les supports contenant les testicules la propagation entre les gouttes d’huile. Placer le plat de culture sous un microscope disséquant.
Pour éliminer l’excès de supports, insérez le coin d’un chiffon de tâche délicat sous le coverslip. Wick loin assez de médias pour le coverslip en verre pour juste entrer en contact avec la surface du plus grand testicules. N’enlevez pas trop de supports et abaissez trop le coverslip.
Cela exercera une pression sur les testicules et peut les provoquer une rupture. Enfin, placez une goutte d’huile d’immersion sur le couvercle en verre juste au-dessus des testicules. Retournez le plat et placez-le au microscope.
Déplacez l’objectif du microscope 40 ou 60 X dans l’huile jusqu’à ce qu’il soit juste en dessous des testicules. Utilisez la lumière transmise pour trouver un seul testicules et le mettre au point. Placer 0,5 millilitres de paraformaldéhyde de 8 % dans le PBSTx dans un puits d’un plat de neuf puits disséquant.
Utilisez une pipette Pasteur en verre pour transférer jusqu’à 10 testicules au puits. Assurez-vous que les testicules sont couchés sur le fond du puits. Après 20 minutes, transférer les testicules dans un puits contenant 0,5 millilitres de PBSTx.
Laver les testicules en agitant doucement pendant cinq minutes. Lavez-vous deux fois de plus dans de nouveaux puits avec du PBSTx frais. Préparez une dilution de l’anticorps primaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre tel que décrit dans le manuscrit.
Ensuite, transférez les testicules des neuf puits en verre disséquant le plat au tube. Incuber le tube toute la nuit à quatre degrés Celsius avec un basculement doux ou nutation. La procédure de coloration des testicules avec l’anticorps secondaire est similaire.
Voir le manuscrit pour plus de détails. Tout d’abord, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les testicules de la plaque de neuf puits sur une toboggan en microscopie en verre. Si nécessaire, utilisez le bord du scalpel pour pousser les testicules vers le bas sur la surface de la glissière.
Ensuite, utilisez le coin d’un chiffon tâche délicate pour évacue l’excès de liquide des testicules. Retirer le plus de liquide possible. Appliquez ensuite une goutte de 30 à 50 microlitres de support de montage de microscopie sur les testicules.
Enfin, placez un coverslip de 22 millimètres sur la chute du milieu de montage. Laissez le coverslip s’installer, et le milieu de montage s’étendre sous le coverslip. Si nécessaire, appliquez une pression douce sur le coverslip pour presser l’excès de montage moyen et laisser le coverslip reposer sur la surface des testicules.
Lorsque ce protocole est exécuté avec succès, l’organisation cellulaire des testicules est préservée, et la progression de la différenciation cellulaire d’une extrémité du testicules à l’autre est visible. Spermatocytes sur le point de commencer la méiose et ceux dans la métaphyse peuvent être identifiés. Dans les testicules préparés à l’aide de ce protocole, l’analyse d’imagerie en direct montre la réorganisation dynamique du réticulum endoplasmique et des micro tubules dans la division des spermatocytes.
Comme décrit dans le protocole, il faut prendre grand soin de ne pas appliquer de pression qui provoque l’éclatement des testicules. Les kystes des spermatocytes s’écoulent rapidement d’un testicule rompu, rendant l’imagerie de laps de temps vivant difficile. Ce protocole est optimisé pour l’imagerie divisant les spermatocytes dans les tissus vivants et intacts.
Par conséquent, il est essentiel que les testicules ne soient pas endommagés pendant la dissection ou le montage. Notre méthode devrait également convenir aux techniques d’imagerie à super résolution, telles que la microscopie d’éclairage structuré, fournissant de nouvelles informations sur les processus sous-cellulaires dynamiques qui régissent la division cellulaire.
