This work has been supported by the German Cancer Research Center (DKFZ), the EU-consortium &#8220;Tolerage&#8221;, the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 938) and the Landesstiftung Baden-W&#252;rttemberg.

Cette étude a été approuvée par le comité d&#39;éthique de la Regierungspräsidium Karlsruhe. Tous les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d&#39;organismes pathogènes spécifiques du Centre de recherche allemand sur le cancer (DKFZ). Pour tous les petits expériences de culture de souris allant de 1 à 7 jours d&#39;âge ont été utilisés. 1. Isolement de mTECs de Thymus REMARQUE: Les étapes de digestion suivantes ont été réalisées comme décrit précédemment 1 dans des conditions stériles avec quelques modifications comme suit. <ol><li> Décapiter les souriceaux et retirer le thymus. Placez le thymus sur de la glace dans une boîte de Pétri contenant du milieu RPMI 1640 (contenant 5% de FCS). </li><li> Couper le thymus en fines, de petits morceaux et les mettre dans un tube à fond rond avec ~ 5-30 ml du milieu RPMI et remuer doucement en utilisant un aimant pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Par la suite, décanter le surnageant contenant principalement thymocytes et digérer séquentiellement de tissu restant avec un tour de Collagenasoi de type IV (0,2 mg / ml et 57 U / ml concentartion finale) pendant 15 minutes chacun à 37 ° C, suivi par de la collagénase / dispase (0,2 mg / ml et la concentration finale de 1,2 U / ml) pendant 25 minutes chaque à 37 ° C dans un bain d&#39;eau sous agitation magnétique jusqu&#39;à ce que le thymus est complètement digéré. Utilisez 1 ml enzyme par deux à trois thymus. </li><li> Agiter le tissu une fois tous les 7 à 10 min avec une pipette Pasteur. Réunir les fractions de la collagénase / dispase et filtrer à travers une gaze de 70 um. </li><li> Enrichir les mTECs par la cellule tri magnétique (MACS). Effectuer la purification de mTECs par tri cellulaire magnétique 11 tel que décrit précédemment, et représenté sur la figure 1. NOTE: Pour tri magnétique des mTECs nous avons utilisé les anticorps suivants: anti-CD80-PE (16-10A1, utilisation à dilution 1: 100) et anti-EpCAM-bio (G8.8, l&#39;utilisation à dilution 1: 100) 12. MTECs immatures et matures utilisant MACS ont été définies comme suit: CD45 - EpCAM + CD80 - et CD45 - CD80 + respectivEly. </li><li> Après MACS purification (pureté de mTECs immatures = 83,1 ± 6,3% et mTECs matures = 79,23 ± 3,42%), ensemencer les mTECs sur les cultures organotypiques comme décrit ci-dessous (section 2.3). </li><li> Alternativement, tri mTECs par FACS (en utilisant 100 buse de um) après CD45 MACS appauvrissement utilisant les anticorps suivants: anti-CD45-PerCP (30-F11, l&#39;utilisation à dilution 1: 100), anti-Ly51-FITC (6C3, utiliser au 1 : 100 dilution), anti-EpCAM-Alexa647 (G8.8, l&#39;utilisation à dilution 1: 500) et l&#39;utilisation anti-CD80-PE (16-10A1, au dilution 1: 100). Exclure les cellules mortes en utilisant l&#39;iodure de propidium (1: 5000) (Jour 4). MTECs immatures et matures utilisant FACS ont été définies comme suit: PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 - et PI - CD45 - Ly51 - EpCAM + CD80 +, respectivement. </li></ol> 2. 3D organotypiques Co-cultures (OTSC) NOTE: Les constructions 3D-cutanée pour la culture organotypique de keratinocytes ont été préparés comme décrit ci-dessus 9,13. A toutes les étapes cellules ont été incubées à 37 ° C et 5% de CO 2. Les médicaments en vente libre en utilisant mTECs ont été préparés avec de légères modifications comme suit. <ol><li> Préparation des fibroblastes humains REMARQUE: Les fibroblastes dermiques humains ont été obtenus à partir de cultures d&#39;explants de dé-épidermisé derme comme décrit précédemment neuf. <ol><li> En bref, couper des bandes de peau humaine (~ 5 cm de longueur) et traiter avec la thermolysine (0,5 mg / ml dans une solution saline avec 10 mM Hepes pH 7,4) O / N à 4 ° C. </li><li> Par la suite, séparer l&#39;épiderme du derme à l&#39;aide de forceps. </li><li> Coupez finement le derme en petits morceaux, dans une plaque de 10 cm de Pétri et laisser sécher pendant 1-2 heures sous flux d&#39;air stérile. Compléter les explants régulièrement avec DMEM contenant 20% de FBS. </li><li> Diviser les fibroblastes sur plus quand confluentes (généralement autour de 3 semaines) en utilisant 0,1% de trypsine faire en sorte que les explants continuent à adhérer à la plaque pour plus contours consécutifs de l&#39;excroissance. </li><li> Développer les fibroblastes provenant de la même explants pour un maximum de trois fois dans du DMEM avec 10% de FBS et cryo-préservation eux 14. Utiliser le même lot de fibroblastes pour chaque série expérimentale. NOTE: Les fibroblastes ont pas été irradiées pendant le set-up des équivalents de derme. </li></ol></li><li> Préparation de la Échafaudages <ol><li> Couper les 0,4-0,6 mm d&#39;épaisseur de viscose, matériau fibreux non tissé (des détails du produit à soutenir feuille Excel) dans les cercles bien délimitées en utilisant une forte 11 mm de diamètre perforateur métallique pour correspondre exactement en 12 inserts bien-filtre. Ensuite, placer dans le puits 12 insert de filtre (polyester membrane capillaire des pores, 3 um de taille de pores) comme échafaudage. Placez la configuration complète de filtre dans une plaque de 12 puits stérile. </li><li> Préparer le gel de fibrine en utilisant un kit de colle de fibrine pour la chirurgie constitué d&#39;une combinaison de fibrinogène et de thrombine. Pré-diluer le fibrinogène et la thrombine en tant que composants du kit à 8 mg / ml et 10unités / ml, respectivement. Pour un seul puits d&#39;une plaque de 12 puits, procéder comme suit. <ol><li> Diluer 100 ul de fibrinogène (8 mg / ml) avec 100 ul de phosphate saline tamponnée (PBS) sans Ca2 + et Mg2 +, pH 7,0. Diluer 100 ul de thrombine (10 unités / ml) avec 100 ul de FCS contenant 270.000 fibroblastes. </li><li> Distribuer 200 pl de la thrombine contenant des fibroblastes de cellules se mélangent sur l&#39;échafaudage, ce qui ajoute à 200 ul de fibrinogène (mélange 1: 1), ce qui entraîne une concentration finale de fibrinogène de 2 mg / ml de thrombine et de 2,5 unités / ml. Mélangez bien et répartir uniformément sur toute la surface de l&#39;échafaudage par pipetage doux (jour 1). Remarque: Au bout de 30 min à 37 ° C renfermant un caillot les fibroblastes se sera formée, remplissant complètement les espaces internes de l&#39;échafaudage et en formant une surface supérieure lisse. </li></ol></li></ol></li><li> Co-culture avec mTECs <ol><li> Pour pré-culture, plonger les cultures d&#39;organes enDMEM avec 10% de FBS, 50 ng / ml d&#39;acide L-ascorbique et de 1 ng / ml de TGF-β1 avec un changement de milieu tous les deux jours pendant 4-5 jours. </li><li> Le jour de l&#39;ensemencement mTEC, remplacer le milieu par du milieu FRDA (1: 1 de DMEM + DMEM / F12) avec 10% de FBS, 10 -10 M toxine du choléra, 0,4 mg / ml d&#39;hydrocortisone, 50 pg / ml d&#39;acide L-ascorbique, RANK ligand (0,1 pg / ml) et 500 unités / ml d&#39;aprotinine, empêchant ainsi la fibrinolyse précoce par des serine proteases sécrétées par les fibroblastes. </li><li> 7-8 heures plus tard, les co-cultures mis en place par l&#39;ensemencement 250.000 mTECs (soit mTECs complets, ou CD80 lo et hi CD80 sous-ensembles), dans un volume de 100 l par puits sur le dessus de l&#39;échafaudage des fibroblastes. Compter les cellules en utilisant un Neubauer (Jour 4). NOTE: En tout temps les cultures organotypiques 3D thymus sont immergés dans les médias, contrairement OTC de la peau qui sont air-levée. </li><li> Après 24 heures d&#39;incubation, fournir les cultures avec un milieu (de change moyen total) comme mentionné ci-dessus (étape 2.3.2) maintenant containing réduit les montants de l&#39;aprotinine, 250 unités / ml (Jour 5). </li><li> Afin d&#39;évaluer l&#39;activité proliférative des mTECs, ajouter EdU (6,7 uM / ml, soit 10 uM / puits) de médicaments en vente libre pendant 4 heures avant la fin des cultures. Effectuer la coloration de gré à gré cryo-sections comme décrit dans le Kit EdU imagerie combinée avec le co-coloration de la kératine 14. Déterminer les indices de prolifération de mTECs, soit par les cellules de la K14 + Edu + comptage dans deux sections de chaque spécimen de culture ou de débit cytométrie (EdU cytométrie de flux, la section 1.7, mais au lieu de Ly51-FITC utilisent CDR1-PB 15 à une dilution de 1: 100 et 2.3.6.4). </li><li> Après 4-7 jours de co-culture, de résilier les OTC et le processus d&#39;isolement de l&#39;ARN, cryo-sectionnement ou analyse FACS (jour 8-11). <ol><li> Mettre fin à la culture à l&#39;aide d&#39;une pince, en séparant l&#39;équivalent échafaudage / dermique à partir du filtre de l&#39;insert de puits. </li><li> Pour cryo-sectionnement, intégrer l&#39;ensemble de gré à gré dans le composé PTOM et geler en livapeur d&#39;azote quid avant cryo-sectionnement. Préparer 5-7 sections um d&#39;épaisseur de gré à gré en utilisant un cryostat et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. Pour immuno-histochimie des OTC de cryo-coupe utiliser anti-kératine 14 (AF64, l&#39;utilisation au 1: 1000 dilution), et anti-vimentine (gp53, l&#39;utilisation au 1: 100 dilution) anticorps. Effectuer la coloration immuno-histochimie indirecte utilisant des anticorps secondaires respectifs. </li><li> Pour l&#39;isolement de l&#39;ARN, ajouter 1 ml de solution (contenant du phénol et de guanidinium thiocyanate) dans un bouchon à vis d&#39;un tube 2 ml sans RNase de dénaturation. Couper l&#39;ensemble de gré à gré en morceaux avec un scalpel et ajouter dans le tube contenant la solution de dénaturation. Mécaniquement déchiqueter les médicaments en vente libre avec l&#39;instrument FastPrep deux fois pendant 30 secondes à une vitesse de 6,0, se placent entre sur la glace pendant 2 min (l&#39;échantillon peut être conservé à -80 ° C après ce point). Si congelé à -80 ° C, dégel sur la glace. Centrifuger les tubes à 11,500-13,000 rpm pendant 10 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un tube frais, incuber pendant 5 minutes à température ambiante et fprotocoles d&#39;isolement d&#39;ARN en utilisant l&#39;acide uivez guanidinium thiocyanate-extraction au phénol-chloroforme comme décrit par le fabricant. </li><li> Pour l&#39;analyse FACS, retirez l&#39;échafaud et séparer la membrane de la / des fibroblastes gel de fibrine / mTEC. Finement coupé le gel avec un scalpel et digérer dans un tube FACS pour ~ 20 minutes, ou jusqu&#39;à complètement digéré avec 2 ml de collagénase / dispase à 37 ° C dans un bain d&#39;eau sous agitation magnétique. Agiter la solution d&#39;enzyme avec une pipette Pasteur, une fois toutes les 5 min. Après digestion complète, on filtre la suspension de cellules à travers un filtre de 70 um; tacher la suspension de cellules individuelles en utilisant les anticorps tels que décrits en 1.7 et analysent par cytométrie de flux. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self.">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li><li>Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+role+for+central+tolerance.">A central role for central tolerance.</a> Annual review of immunology. 24, 571-606 (2006).</li><li>Bonfanti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+reprogramming+of+thymic+epithelial+cells+to+skin+multipotent+stem+cells.">Microenvironmental reprogramming of thymic epithelial cells to skin multipotent stem cells.</a> Nature. 466, 978-982 (2010).</li><li>Kont, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Aire+regulates+the+expression+of+tissue-restricted+antigens.">Modulation of Aire regulates the expression of tissue-restricted antigens.</a> Molecular Immunology. 45, 25-33 (2008).</li><li>Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. 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A., Polychronakos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+proinsulin-producing+medullary+thymic+epithelial+cell+clones.">Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones.</a> Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).</li><li>White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reaggregate+thymus+cultures.">Reaggregate thymus cultures.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).</li><li>Stark, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Authentic+fibroblast+matrix+in+dermal+equivalents+normalises+epidermal+histogenesis+and+dermoepidermal+junction+in+organotypic+co-culture.">Authentic fibroblast matrix in dermal equivalents normalises epidermal histogenesis and dermoepidermal junction in organotypic co-culture.</a> Eur J Cell Biol. 83, 631-645 (2004).</li><li>Schoop, V. M., Mirancea, N., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+organization+and+differentiation+of+HaCaT+keratinocytes+in+organotypic+coculture+with+human+dermal+fibroblasts.">Epidermal organization and differentiation of HaCaT keratinocytes in organotypic coculture with human dermal fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112, 343-353 (1999).</li><li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells.">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 36, 1511-1517 (1988).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit financier ou d&#39;intérêt commercial.

Parallèlement RTOCs, l&#39;OTC 3D ont été de loin supérieur en termes de différenciation des TEC et pGE entretien / induction (tableau 1) par rapport aux autres (i) «cultures 3D simplifiées &#39;aide - fibroblastes seul, sans l&#39;échafaud; (Ii) les systèmes 2D utilisant - cellules fibroblastes / nourricier co-cultivées avec les TEC 10, (iii) les cellules 3T3-J2 dans laquelle clones TEC développent, mais pGE est perdu, (iv) matrigel ou (v) les composants de l&#39;ECM (données non...

Thymocytes en voie de développement représentent environ 98% du thymus, tandis que les 2% restants se compose d&#39;une variété de cellules qui composent collectivement le stroma thymique (c.-à cellules epitheliales, les cellules dendritiques, les macrophages, les cellules B, les fibroblastes, cellules endothéliales). Les cellules épithéliales corticales extérieures (CTEC) procurent immigration de cellules pro-T de la moelle osseuse, T lignée cellulaire induction dans les cellules multipotentes pré-T et la sélection positive de soi-CMH limités thymocytes immatures. Les cellules médullaires thymiques épithéliales internes (mTECs) sont impliqués dans l&#39;induction de tolérance de ces thymocytes avec une haute affinité pour les complexes TCR auto-peptide / CMH soit par induction sélection négative ou leur déviation dans la lignée de cellules T régulatrices. Dans le cadre de la tolérance centrale induction, mTECs sont uniques en ce qu&#39;ils expriment un large spectre des auto-antigènes tissulaires restreint (EMR) reflétant ainsi l&#39;auto périphérique. Ce phénomène est appelé l&#39;expression du gène de promiscuité (PGE)1,2. La plupart des études actuelles sur ce type de cellule fascinante comptent sur ​​ex vivo des cellules isolées, que divers systèmes de culture 2D à court terme invariablement entraîné la perte de PGE et des molécules régulatrices clés comme le CMH de classe II, Foxn1 et Aire dans les 2 premiers jours 3-6 . Il restait toutefois incertaine, les composants et caractéristiques de la maillage 3D intacte du thymus particuliers étaient manquantes dans les modèles 2D. La culture d&#39;organe thymique ré-agrégation (RTOC) a été jusqu&#39;à présent le seul système 3D qui permet l&#39;étude du développement des lymphocytes T, d&#39;une part, et de la biologie des cellules stromales, d&#39;autre part, dans un microenvironnement thymique intacte 7. Cependant, RTOCs ont certaines limites, à savoir, ils contiennent déjà un mélange complexe de cellules, exiger l&#39;entrée de cellules stromales fœtales et supporter une période de culture maximal de 5 à 10 jours. Le manque de réductionniste dans les systèmes de culture in vitro a entravé l&#39;étude deplusieurs aspects du développement des cellules T et thymique organogenèse pas moins la régulation moléculaire de pGE et sa relation à la biologie du développement de mTECs. En raison de la proximité-apparentement de l&#39;organisation structurée des cellules épithéliales de la peau et du thymus, nous avons opté pour un système 3D culture organotypique (OTC) qui avait été développé à l&#39;origine pour émuler la différenciation des kératinocytes in vitro et donc de créer un équivalent dermique. Le système se compose d&#39;un OTC matrice inerte recouvert d&#39;échafaudage avec des fibroblastes dermiques qui sont piégés dans un gel de fibrine, sur lequel les kératinocytes sont ensemencés 8,9. Ici, nous avons remplacé les kératinocytes avec mTECs purifiés. Tout en gardant les caractéristiques de base de ce modèle, nous avons optimisé certains paramètres. Dans le modèle de gré à gré adoptée mTECs proliféré, a subi une différenciation terminale et maintenu identité mTEC et PGE, imitant ainsi étroitement vivo développement des mTECs dans <sup&gt; 10. Cette note technique fournit un protocole détaillé permettant la mise en place progressive d&#39;OTC thymus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pregnant C57BL/6 mice&#160;</td>
			<td>Charles River WIGA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Microbeads, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-052-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)</td>
			<td>Ref. 12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD80-PE antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PerCP antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly51-FITC antibody</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDR1-Pacific Blue</td>
			<td>Ref. 15</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 14 antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-155P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vimentin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>106-546-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Molecular Probes (Invitrogen GmbH)</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10339">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</a></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10339">C10339</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10425">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit</a></td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C10425">C10425</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well filter inserts (thincerts)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>665180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jettex 2005/45</td>
			<td>ORSA, Giorla Minore, Italy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen TISSUECOL-Kit Immuno</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin TISSUECOL-Kit Immuno</td>
			<td>Baxter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47302.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-049&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Gold</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>A11-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aprotinin (Trasylol)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>4032037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera toxin</td>
			<td>Biomol</td>
			<td>G117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Seromed (Biochrom)</td>
			<td>K3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-&#223;1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG9214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>462-TR-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;T-7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Compound</td>
			<td>TissueTek</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol (aka. Denaturing solution - Acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep FP120</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV&#160;</td>
			<td>CellSystems</td>
			<td>LS004189</td>
			<td>0.2 mg/ml and 57U/ml final conc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrale Protease (Dispase)</td>
			<td>CellSystems</td>
			<td>LS002104</td>
			<td>0.2 mg/ml and 1.2U/ml final conc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 284 932 001</td>
			<td>25 &#181;g/ml final conc.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d organotypic co-culture model supporting medullary thymic epithelial cell proliferation, differentiation and promiscuous gene expression

Le développement des cellules T intra-thymique nécessite un maillage tridimensionnel complexe composé de diverses cellules stromales, à savoir, les cellules non-T. Thymocytes traversent cette échafaudage dans un ordre temporel et spatial très coordonnée en passant séquentiellement points de contrôle obligatoires, à savoir, l&#39;engagement de la lignée de cellules T, suivie par récepteur des cellules T génération et la sélection du répertoire avant leur exportation vers la périphérie. Les deux types de cellules résident principaux formant ce échafaudage sont des cellules épithéliales thymiques corticales (CTEC) et médullaires (mTECs). Une caractéristique clé de mTECs est l&#39;expression que l&#39;on appelle la promiscuité de nombreux antigènes tissulaires restreint. Ces antigènes de tissus soumis à des restrictions sont présentés pour les thymocytes immatures directement ou indirectement par mTECs thymiques ou les cellules dendritiques, ce qui entraîne respectivement à une auto-tolérance. Appropriés modèles in vitro imitant les voies de développement et les fonctions du CTEC et mTECs sont actuellement lacroi. Ce manque de modèles expérimentaux adéquats a entravé par exemple l&#39;analyse de l&#39;expression génique promiscuité, qui est encore mal comprise au niveau cellulaire et moléculaire. Nous avons adapté un modèle organotypique 3D co-culture à la culture ex vivo mTECs isolés. Ce modèle a été conçu à l&#39;origine pour cultiver des kératinocytes de manière à produire un équivalent de peau in vitro. Le modèle 3D conservé des caractéristiques fonctionnelles clés de mTEC biologie: (i) la prolifération et la différenciation terminale des CD80 lo, Aire-négatif en CD80 salut, Aire-positif mTECs, (ii) la réactivité de RANKL, et (iii) l&#39;expression soutenue de Foxn1, Aire et les gènes de tissus restreinte dans CD80 mTECs hi.

Nous avons adopté une organotypique modèle de co-culture 3D (3D OTC) qui avait été développé à l&#39;origine pour une longue terme de culture in vitro de kératinocytes 9. MTECs MACS-enrichis (voir MACS enrichissement régime Figure 1) ont été ensemencées sur un échafaudage comprenant un gel de fibrine et de fibroblastes piégées. Les fibroblastes fournissent la matrice extracellulaire essentiel (ECM) supportant mTECs in vitro. MTECs ont été cultivées dans OTC...

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3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.6K vues.  German Cancer Research Center (DKFZ). Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression. 

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Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Culture et co-culture de souris ovaires et follicules ovariens

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Recherche

Biologie du développement

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to tissue and cell-type specific regulation of gene expression during the cellular differentiation. Thus, their identification and further investigation is important in order to understand how cell fate is determined. Integration of gene expression data (e.g., microarray or RNA-seq) and results of chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based genome-wide studies (ChIP-seq) allows large-scale identification of these regulatory regions. However, functional validation of cell-type specific enhancers requires further in vitro and in vivo experimental procedures. Here we describe how active enhancers can be identified and validated experimentally. This protocol provides a step-by-step workflow that includes: 1) identification of regulatory regions by ChIP-seq data analysis, 2) cloning and experimental validation of putative regulatory potential of the identified genomic sequences in a reporter assay, and 3) determination of enhancer activity in vivo by measuring enhancer RNA transcript level. The presented protocol is detailed enough to help anyone to set up this workflow in the lab. Importantly, the protocol can be easily adapted to and used in any cellular model system.

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

Prédiction et validation des éléments de réglementation gène activé Pendant l&#39;acide rétinoïque induit la différenciation des cellules souches embryonnaires

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adénovirus thérapie génique diabétique Kératopathie: Effets sur la cicatrisation des plaies et des cellules souches Marker Expression dans Human cornées Organ-culture et de cellules épithéliales limbiques

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Commande temporelle des données d&#39;expression dynamique d&#39;expression spatiale détaillée Plans

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended effects that extrinsic patterning factors might introduce into human pluripotent stem cell (hPSC) models of brain development or pathophysiology, such as masking disease phenotype. Here, we present two cerebellar differentiation protocols for hPSCs, designed with simpler startup method, fewer patterning factors, and less material requirements than previous protocols. Recently, we developed culture procedures, which generate free-floating 3-dimensional (3D) products consistent with other brain &#34;organoid&#34; protocols, including morphologies relevant to modeling brain development such as sub/ventricular zone- and rhombic lip-like structures. The second uses an adherent, 2D monolayer procedure to complete differentiation, which is shown capable of generating functional cerebellar neurons, as products are positive for cerebellar-associated markers, and exhibit neuron-like calcium influxes. Together, these protocols offer scientists a choice of options suited to different research purposes, as well as a basic model for testing other types of streamlined neural differentiations.

We describe a simplified 3D differentiation protocol for hPSCs, using defined medium and reduced growth factors, capable of generating cell aggregates with early neuroepithelial structures and positive for cerebellar-associated markers, as well as an optional 2D modification for differentiating cells as a monolayer to generate functional neurons.

Protocole de différenciation cérébelleux 3D simplifiée avec Modification 2D facultative

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Analyse clonale des précurseurs embryonnaires de cellules souches hématopoïétiques à l’aide de cellule unique Index tri combinée avec Niche de cellules endothéliales co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of hematological pathologies. Despite the most relevant data that can be acquired using in vivo models or primary cultures, the low abundance of hematopoietic stem and progenitor cells considerably restricts the pool of suitable techniques for their investigation. Therefore, the use of cell lines allows sufficient production of biological material for the performance of screenings or assays that require large cell numbers. Here we present a detailed description, readout, and interpretation of proliferation and differentiation assays which are used for the investigation of processes involved in myelopoiesis and neutrophilic differentiation. These experiments employ the 32D/G-CSF-R cytokine dependent murine myeloid cell line, which possesses the ability to proliferate in the presence of IL-3 and differentiate in G-CSF. We provide optimized protocols for handling 32D/G-CSF-R cells and discuss major pitfalls and drawbacks that might compromise the described assays and expected results. Additionally, this article contains protocols for lentiviral and retroviral production, titration, and transduction of 32D/G-CSF-R cells. We demonstrate that genetic manipulation of these cells can be employed to successfully perform functional and molecular studies, which can complement results obtained with primary hematopoietic stem and progenitor cells or in vivo models.

Here detailed protocols for culturing the murine myeloid precursor 32D/G-CSF-R cell line, performing viral infections, and carrying out proliferation and differentiation assays are presented. This cell line is suitable for studying myeloid cell development, and the role of genes of interest in myeloid cell growth and neutrophilic differentiation.

Prolifération et la différenciation des précurseurs myéloïdes Murine 32D/G-CSF-R cellules

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Reprogrammation hémogénique des fibroblastes humains par expression forcée des facteurs de transcription

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing to the transparent embryonic body of zebrafish, it is convenient for us to study the effect of one chemokine on the behavior of a certain type of cells in vivo. Here we provided a workflow to investigate the function of a chemokine on macrophage migration in vivo. We constructed a tissue-specific overexpression plasmid to overexpress IL-34 and injected the plasmid into one-cell stage transgenic fish embryos whose macrophages were specifically labeled by a fluorescent protein. We then used whole mount fluorescent in situ hybridization and immunostaining to detect the pattern of the chemokine expression and the number or location of macrophages. The injected WT embryos were raised to generate a stable transgenic line. Finally, we used confocal live imaging to directly observe macrophage behavior in the stable transgenic fish to study the function of IL-34 on macrophages in vivo.

To test the effect of a chemokine on macrophage recruitment in vivo, the whole mount in situ hybridization was used to detect the ectopic expression of the chemokine, and immunostaining was used to label macrophages. Live imaging was used for real-time observation of macrophage migration.

Un modèle d'expression ectopique de chemokine pour tester le recrutement de macrophage in Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...