Ce travail a été soutenu par les subventions Deutsche Forschungsgemeinschaft HI-698 / 10-1 et RU-1652 / 1-1. Nous remercions Doreen mai pour une excellente assistance technique et la société Dyomics GmbH, Jena pour leur soutien en nature.

NOTE: Toutes les procédures sont approuvées par le comité régional et des animaux conformément aux lignes directrices internationales sur l&#39;utilisation éthique des animaux. 1. Préparation des matériaux et instruments <ol><li> Préparation d&#39;une dispersion de vésicules formées spontanément (SFV) <ol><li> Dissoudre et préparer des solutions d&#39;achat d&#39;actions des phospholipides suivants: 214 mg / ml phosphatidylcholine d&#39;oeuf (EPC), 134 mg / ml de cholestérol, 122 mg / ml de 1,2-distearoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [méthoxy (polyéthylène glycol) -2000] (sel d&#39;ammonium) (mPEG 2000 -DSPE) et 2 mg / ml de 1,2-dioleoyl- sn-glycéro-3-phosphoethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4 yl) (sel d&#39;ammonium) (NBD-DOPE) dans le chloroforme et stocker dans des flacons de verre. </li><li> Fournir environ 3 ml de chloroforme dans un ballon à fond rond et de transférer le volume approprié de la solution mère de phospholipides dans le ballon à fond rond pour préparer des liposomes composés de EPC: Chol: mPEG 2000 -DSPE à un rapport molaire de 6,5: 3: 0,5. Pour le double marquage de fluorescence des liposomes ajouter 0,3% en moles NBD-DOPE à la solution de lipide. </li><li> On évapore le chloroforme de la solution de phospholipide organique sous pression réduite (300 mbar) à 55 ° C en utilisant un évaporateur rotatif. </li><li> Après un film de phospholipides homogène est formé, de réduire la pression à 10 mbar pendant 1-2 heures pour enlever le dépôt de chloroforme résiduel. </li><li> Bien que le chloroforme se évapore, on dissout DY-676-COOH (6,181 uM) dans du tampon Tris 10 mM pH 7,4 et remplir un vase de Dewar d&#39;azote liquide. Allumez un bain à ultrasons et réglé à 50 ° C. </li><li> Transférer un volume approprié (0,5 à 1 ml) de DY-676-COOH (6,181 uM) solution dans le ballon à fond rond pour hydrater le film de phospholipide sec et vortexer vigoureusement jusqu&#39;à une vésicule formée spontanément (SFV) forme de dispersion. Assurez-vous que tous les phospholipides sont dispersés pour éviter la perte de lipides. </li><li> Tra soigneusementnsfer le ballon à fond rond contenant la dispersion SFV dans l&#39;azote liquide et congeler la dispersion de 3-5 min. Placez le ballon dans un bain à ultrasons à 50 ° C pour dégeler la dispersion puis la dispersion vortex vigoureusement pendant 1-2 min. Répétez cette procédure six fois, soit un total de sept cycles gel et de dégel. </li></ol></li><li> Extrusion du sFv de former des vésicules de liposomes homogènes <ol><li> Transférer la dispersion SFV dans une seringue de 1 ml (seringue-a) et extruder la dispersion à travers une membrane de polycarbonate de 100 nm en utilisant une extrudeuse à LiposoFast-base-b dans la seringue. </li><li> Extruder la dispersion de la seringue-b, de retour dans la seringue-a, puis répéter le cycle dix fois. Du fait de l&#39;extrusion, la solution dans la seringue passe d&#39;un aspect trouble à une dispersion limpide avec le temps. Après dix cycles (vingt étapes simples d&#39;extrusion) retirer la seringue-b de l&#39;appareil et extruder la dispersion pour la dernière fois de la seringue-un directement dans un stérile1,5 ml du tube de réaction. </li></ol></li><li> Purification des liposomes encapsulés DY-676-COOH à partir de colorant libre <ol><li> Préparer une colonne de Chromatographie sur gel G25 en utilisant des perles trempées dans du Tris 10 mM de tampon pH 7,4 (colonne de longueur 28 cm, diamètre 0,8 cm). </li><li> Transférer 0,5 ml de dispersion de vésicules extrudé sur le lit de gel et de laisser l&#39;évacuation de l&#39;échantillon dans la matrice de gel. </li><li> Éluer les liposomes avec Tris 10 mM pH 7,4 (figure 1A) et laver la colonne jusqu&#39;à ce que les drains de colorant libre complètement hors de la colonne. Si besoin est, collecter et recycler le colorant libre par dessalage et de déshydratation selon les instructions du fabricant. </li><li> Concentrer les liposomes éluées par ultracentrifugation (200 000 x g, 2 heures à 8 ° C) puis de les disperser dans un volume adéquat de tampon stérile 10 mM de Tris pH 7,4. </li></ol></li><li> Quantification de la concentration encapsulé DY-676-COOH <ol><li> Préparer une courbe d&#39;étalonnage en dissolvant DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 nM) dans du tampon Tris 10 mM, pH 7,4 contenant 0,1% de Triton X100. </li><li> Dissoudre 2 pi (100 nmol de lipide finale de 50 mmol / L stock) des liposomes pendant 5 min à température ambiante dans du tampon Tris 100 pi contenant 1% de Triton X100 pour détruire les vésicules et la libération du colorant encapsulé. Puis diluer les échantillons avec du tampon Tris 10 mM, pH 7,4 jusqu&#39;à une concentration finale de Triton-X100 à 0,1% (v / v) faire un volume total de 1 ml. Préparer tous les échantillons en double. </li><li> Mesurer l&#39;absorption et l&#39;émission de tous les échantillons (libre DY-676-COOH et le Triton-X100 traitée liposomes) à une excitation λ = 645 nm et une émission λ = 700 nm. Établir et utiliser une courbe d&#39;étalonnage du colorant libre de déterminer la concentration de colorant encapsulé. </li></ol></li><li> Liposome caractérisation <ol><li> Déterminer la taille et le potentiel zêta de liposomes par diffusion dynamique de la lumière. Diluer les échantillons de liposomes avec filtre stérilisé (0,2 um) Tris 10 mM pH 7,4 à aconcentration de 100 à 300 pM (lipide). Transférer les échantillons dilués dans une cuvette jetable de faible volume et de mesurer l&#39;échantillon selon les instructions du fabricant. </li><li> Caractériser les liposomes par microscopie électronique à étayer la taille, l&#39;intégrité et l&#39;homogénéité des vésicules liposomiques selon des protocoles standards. </li></ol></li></ol> 2. Validation de la fluorescence-trempe et activation des liposomes préparés <ol><li> L&#39;analyse physico-chimique de la fluorescence et l&#39;activation <ol><li> Préparer deux tubes de 1,5 ml pour le Lip-Q et deux tubes pour la libre DY-676-COOH. Transfert 100 nmol lipides totaux (2,38 de pi d&#39;un / L Lip-Q solution stock de 42 mmol, contenant 138 pg / ml de la encapsulé DY-676-COOH) dans les tubes correspondants. Transfert Gratuit équivalent DY-676-COOH à la teneur en colorant de Lip-Q (0,38 pg qui résulte par exemple de 138 ug / 1000 pi x 2,38 pi Lip-Q utilisé). Incuber une baignoiree de chaque sonde à 4 ° C et congeler le second tube à -80 ° C pendant une nuit (16 h). </li><li> Chauffer un bloc chauffant à 30 ° C. Remplir une boîte de refroidissement avec de la glace pilée et équilibrer une aliquote de tampon Tris 10 mM pH 7,4 à température ambiante. </li><li> Retirer sondes de 4 ° C et équilibrer à température ambiante (enveloppé dans une feuille d&#39;aluminium pour le protéger de la lumière) et rapidement dégeler sondes de -80 ° C à 30 ° C pendant 5 min. Refroidir les sondes décongelés sur de la glace pendant 1 min avant de les transférer à la température ambiante (également enveloppé dans une feuille d&#39;aluminium pour le protéger de la lumière). </li><li> Ajouter tampon Tris 10 mM (pH 7,4) à chacune des sondes à 100 ul volume final et équilibrer toutes les sondes à la température ambiante pendant 10 min. </li><li> Pipette 80 ul de chaque sonde dans une cuvette de verre à faible volume et mesurer l&#39;absorption de chaque sonde de 400 à 900 nm sur un spectromètre. Retour à la sonde de leurs tubes correspondants. </li><li> Transférer 80 pi de chaque sonde dans une cuvette en verre appropriéet mesurer l&#39;émission de fluorescence sur un spectrofluorimètre en excitant les sondes à 674 nm et en mesurant la fluorescence de 694 à 800 nm. </li></ol></li><li> L&#39;absorption cellulaire et l&#39;activation de fluorescence <ol><li> Obtenez et la culture les lignées cellulaires suivantes dans leurs milieux de culture correspondante en fonction des conditions standard (37 ° C, 5% de CO 2 et 95% atmosphère humidifiée). Ici, en utilisant ce J774A.1 de la lignée cellulaire de macrophage murin (modifié par Dulbecco du milieu de Eagle additionné de 10% (en volume) de sérum / fœtal de veau), la lignée cellulaire de glioblastome humain U-118 mg (MEM contenant des vitamines essentielles et 10% (v / v) de sérum de veau foetal) et la lignée de cellules de fibrosarcome humain HT-1080 (RPMI avec 5% de FCS). </li><li> Manteau de 8 puits diapositives de chambre avec poly-L-lysine (ajouter 100 ul 0,001% de poly-L-lysine dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 10 min. Solution Aspirer et laisser les diapositives de la chambre à sécher pendant au moins quatre heure à température ambiante sur un établi stérile. Rincer les lames de la chambre 3fois avec la solution saline tamponnée 200 pi de Hank puis les sceller avec de la paraffine et de feuille d&#39;aluminium et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;emploi. </li><li> Alors que les diapositives de la chambre se tarissent, filtre stériliser les liposomes et solution de colorant et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;emploi. </li><li> Pour l&#39;analyse d&#39;absorption de sonde avec l&#39;ensemble du corps in vivo NIR Système d&#39;imagerie par fluorescence, 5 préparer de petits flacons de culture de chacun des trois lignées de cellules de test (15 flacons au total). Graine 2 x 10 6 J774A.1, U-118 mg et des cellules HT-1080 par flacon de culture avec 5 ml de milieu de culture respectif (dans quintuples) et poussent de 16 à 24 heures. Parallèlement aux flacons de culture, ensemencer 30 000 cellules de chaque lignée cellulaire (J774A.1 et HT-1080) ou 20 000 cellules (U-118 mg) à 2 puits de la glissière de la chambre respectivement, et croître dans un milieu de culture de 500 ul pendant 16 à 24 h . </li><li> Le lendemain, ajouter 100 nmol (montant de finale en lipides) de Lip-Q pour deux flacons par lignée cellulaire et à un puits de chaque ligne de cellules sur la lame de la chambre.Immédiatement transférer 1 flacon par ligne cellulaire à 4 ° C et le second flacon revenir à l&#39;incubateur. REMARQUE: Le volume des sondes ajouté dans les flacons et les diapositives de la chambre sont les mêmes, ce qui rend la concentration sur des lames de la chambre 10 fois plus élevé (5 ml est de 500 pi de milieu de culture). Cela est nécessaire parce que la détection microscopique est moins sensible que le système d&#39;imagerie par fluorescence NIR où culots cellulaires dans les fioles sont imagés. </li><li> Ajouter la libre DY-676-COOH à une concentration équivalente à la teneur en colorant de Lip-Q pour les cellules dans deux flacons par lignée cellulaire et à un puits de chaque ligne de cellules sur la lame de la chambre, puis transférer immédiatement 1 flacon par ligne cellulaire à 4 ° C (d&#39;épuisement de l&#39;énergie) et l&#39;autre ballon avec le coulisseau de la chambre arrière à l&#39;incubateur. Incuber les cellules pendant 24 heures dans les conditions correspondantes. Les cellules dans le ballon sans sonde de servir de témoin non traité. </li></ol></li><li> NIRF l&#39;imagerie et l&#39;analyse semi-quantitative <ol><li> Après 24 heures la durée d&#39;incubation, récolter les cellules dans des flacons en lavant les cellules deux fois avec une solution tamponnée de Hanks de sel (HBSS), puis racler les cellules dans 500 ul de HBSS et culot par centrifugation (5 min à 200 x g) dans 500 ul de tubes. </li><li> Placer les tubes avec les culots cellulaires (HBSS) et dans un imageur NIRF et image en utilisant des filtres pour excitation (615-665 nm) et d&#39;émission (coupe à&gt; 700 nm). </li><li> Déduire autofluorescence et d&#39;évaluer l&#39;intensité de la cible par rapport autofluorescence selon les instructions du fabricant. Cela vous donnera les niveaux semi-quantitatives de l&#39;intensité de fluorescence en signal moyen (compte échelle / sec), qui représente les niveaux de comptage après calibrage pour le temps de l&#39;exposition, gain de la caméra, binning et la profondeur de bits, de sorte que les mesures sont comparables entre eux. </li></ol></li><li> Analyse microscopique confocale <ol><li> Après 24 heures d&#39;incubation, récolter les cellules sur des lames de chambre en lavant deux fois avec 500 ul HBSS. </li><li> Fixer la CElls avec 200 ul de HBSS contenant 3,7% (v / v) de formaldehyde pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Alors que la fixation se passe, diluer la tache d&#39;ADN, Hoechst-33258 1:50 avec une solution de montage. </li><li> Après fixation, laver les cellules deux fois avec du HBSS puis séparer les chambres des lames de verre. Ajouter la solution de montage de 50 ul contenant l&#39;ADN-tache sur chaque spot correspondant aux puits des diapositives de la chambre. Couvrir les cellules avec des lamelles de verre, sceller les bords avec vernis à ongles transparent et sécher à l&#39;air pendant 10 min à température ambiante (foncé). </li><li> cellules image sur un microscope à fluorescence approprié ou microscope confocal. Utilisez les excitation et d&#39;émission paramètres suivants pour la visualisation des composants correspondants: noyaux (Hoechst-33258: excitation 405 nm, émission 420 à 480 nm). NBD-DOPE (lipide liposomique: excitation 488 nm, émission 530 nm). DY-676-COOH (NIR de colorant fluorescent: excitation 633-645 nm, émission 650 à 700 nm). NOTE: Assurez-vous que le microscope à fluorescence d&#39;unevailable est équipé de filtres appropriés qui permettent excitation et d&#39;émission de longueurs d&#39;onde supérieure à 630 nm. </li></ol></li></ol> Base-liposome 3. In Vivo imagerie par fluorescence de l&#39;inflammation <ol><li> Préparation des animaux et des matériaux <ol><li> Maison 8-12 semaines, âgé de souris NMRI mâles pesant environ 36 g dans des conditions standard avec de la nourriture et de l&#39;eau ad libitum. </li><li> Sept jours avant le début des expériences, donner toutes les souris d&#39;un régime alimentaire faible en phéophorbide afin de réduire l&#39;autofluorescence des tissus. </li><li> Vingt-quatre heures avant le début de chaque expérience, de se raser la souris à la zone souhaitée (par exemple, toute la zone arrière si l&#39;imagerie de la jambe arrière de l&#39;œdème est souhaitée). </li><li> Peser les animaux et de calculer la quantité de sonde doit être injecté par souris (Lip-Q et Lip-dQ à 10 pmol (concentration de lipides) par kg de poids et sans DY-676-COOH (équivalent à teindre contenu de Lip-Q utilisé) . </li><li> Image les animauxun corps de fluorescence NIR imageur avec les mêmes paramètres utilisés pour les culots cellulaires. Cette mesure fournit autofluorescence des animaux. </li><li> Dissoudre 10 mg de zymosan A dans 1 ml de solution saline isotonique et de stocker toute une nuit à 4 ° C. </li></ol></li><li> L&#39;induction de l&#39;inflammation in vivo et l&#39;imagerie NIRF <ol><li> Préparez 3 seringues par souris contenant les solutions suivantes. Remplir une seringue avec 50 ul de solution zymosan A (10 mg / ml) et de la seconde seringue avec 50 ul de solution saline isotonique. Remplissez la troisième seringue avec les sondes, lequel Lip-Q et Lip-DQ (10 pmol / kg de poids (lipides)) sont désignés pour les animaux d&#39;essai et d&#39;une connexion DY-676-COOH (concentration que dans Lip-Q) pour les animaux de contrôle. Assurez-vous que les sondes sont dilués avec HBSS stérile à 150 volume final ul. </li><li> Appliquer la crème des yeux sur les yeux des animaux pour éviter la sécheresse et anesthésier les animaux avec 2% d&#39;isoflurane jusqu&#39;à ce qu&#39;ils sont profondément endormis et ne réagit pas au toucher sur les pattes (cela prend environ 2 minutes). </li><li> Placez la souris sur une natte chaude (toujours sous anesthésie) et injecter le zymosan A voie sous-cutanée de la solution sur la patte arrière droite et la solution saline sur la patte arrière gauche. Injectez immédiatement la sonde par voie intraveineuse et de l&#39;image de l&#39;animal par la suite, puis un temps record d&#39;injection / mesure (que t = 0 h). Enregistrez les images résultantes que l&#39;image cubes et répéter les étapes ci-dessus pour tous les autres animaux et les sondes respectives. </li><li> Image les animaux tous les 2 h pour le post-injection de 10 h et post-injection puis à 24 h, en se assurant que le stade de la chambre de mesure est chaude (par exemple, en plaçant sous un tapis chaud), afin d&#39;éviter l&#39;hypothermie. Après chaque mesure, placer les animaux dans une cage avec de la nourriture et de l&#39;eau ad libitum et placer la cage dans une chambre animale tempéré. Euthanasier les animaux par les premier anesthésiant avec 2% d&#39;isoflurane jusqu&#39;à ce que les animaux ne réagissent plus à toucher, puis euthanasier avec du dioxyde de carbone pour 5 à 10 min, ce qui rendassurer que les animaux cessent de respirer complètement et la rigidité cadavérique. </li><li> Disséquer les souris selon des protocoles standards qui peuvent être évalués en ligne (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) et l&#39;image des organes. </li><li> Évaluer les résultats de mesure selon les instructions du fabricant d&#39;abord déduisant la fluorescence globale des animaux (démixage) puis des régions attribution d&#39;intérêt pour autofluorescence (de gauche patte arrière avec une solution saline) et la cible fluorescence de zone enflammée (de patte arrière droite avec zymosan-A). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Étant donné que les liposomes peuvent également servir de systèmes de délivrance pour des colorants fluorescents, ils permettent l&#39;imagerie des maladies cibles. L&#39;encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF, DY676-COOH utilisé ici, conduit à un niveau élevé de l&#39;extinction de fluorescence du colorant piégé. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration peut être exploitée dans plusieu...

Les liposomes ont été intensivement étudiée et servir comme l&#39;un des systèmes les plus biocompatibles de délivrance de médicaments pour des applications biomédicales cliniques 1,2. Ils sont principalement constitués de phospholipides et de cholestérol, qui sont tous deux composés biocompatibles imitant des parties de membranes cellulaires naturelles. Considérant que les substances hydrophiles peuvent être piégés dans l&#39;intérieur aqueux, agents lipophiles peuvent être incorporés dans la bicouche liposomale trois phospholipides. L&#39;encapsulation de substances dans l&#39;intérieur aqueux des liposomes confère une protection contre la dégradation in vivo et empêche également le système hôte contre les effets toxiques des médicaments cytotoxiques utilisés pour la thérapie de maladies, par exemple des agents chimiothérapeutiques visant à détruire les cellules tumorales. La modification de la surface liposomique avec des polymères comme le polyethylene glycol (pégylation) se étend en outre le temps de circulation sanguine des liposomes in vivo en raison de la stabilisation stérique 4. Moreover, les liposomes peuvent séquestrer des concentrations élevées de plusieurs substances telles que les protéines, 5,6 substances hydrophiles 7,8 et 9 enzymes. Ils servent donc des outils thérapeutiques et diagnostiques cliniques fiables qui méritent leur approbation pour la livraison de médicaments cytotoxiques tels que la doxorubicine pour le traitement du cancer 4. En raison de leur souplesse, les liposomes peuvent également être chargées avec des fluorochromes à usage chirurgical et de diagnostic par imagerie. imagerie de fluorescence fournit un coût-efficace et non invasive outil de diagnostic in vivo qui, cependant, exige certaines exigences de base. Il pourrait être démontré que fluorochromes qui conviennent le mieux pour l&#39;imagerie in vivo ont absorption caractéristique et maxima d&#39;émission dans la gamme où la dispersion de la lumière et de diffusion ainsi que autofluorescence de tissu provenant de l&#39;eau et de l&#39;hémoglobine est faible. Ainsi, de telles sondes ont leurs maxima abs / em entre 650 et 10 900 nm.<html> En outre, la stabilité de fluorochromes la fois in vitro et in vivo est critique, opsonisation et le dédouanement rapide peuvent considérablement limiter leur application pour l&#39;imagerie in vivo 11. D&#39;autres effets tels que la mauvaise stabilité et une faible sensibilité ou des effets cytotoxiques sur les organes cibles comme on le voit avec le vert d&#39;indocyanine (ICG) 12-16, sont indésirables et doivent être pris en considération lors de la conception des sondes pour l&#39;imagerie in vivo. Ces observations ont conduit au développement actif de plusieurs fluorochromes NIR précliniques, des nanoparticules ainsi que de nouvelles techniques pour l&#39;imagerie in vivo de processus inflammatoires, le cancer et pour la chirurgie guidée par l&#39;image 17-20. En dépit de la stabilité de la plupart (fluorescence dans le proche infrarouge) NIRF colorants préclinique in vitro, leur perfusion rapide et de la clairance par le foie et les reins empêchent leur utilisation dans l&#39;imagerie optique in vivo de maladies et de processus inflammatoires. MÉNAGEMENT &quot;&gt; Nous présentons donc un protocole d&#39;encapsulation de fluorochromes tels que le bien caractérisé proche infrarouge colorant fluorescent DY-676-COOH, connu pour sa tendance à l&#39;auto-trempe à des concentrations relativement élevées 21 dans des liposomes. A des concentrations élevées H- la formation de dimères et / ou pi-empilement interactions entre les molécules de fluorophore situées dans la suite de rayon de Förster les uns des autres dans Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET) entre les molécules de fluorochrome. A faible concentration de l&#39;espace entre les molécules de fluorophore augmente, empêchant de ce fait l&#39;interaction de pi-empilement et H-formation de dimères et aboutissant à forte émission de fluorescence. Le commutateur entre la concentration haute et basse et la fluorescence trempe accompagnement et l&#39;activation est une stratégie prometteuse qui peut être exploitée pour l&#39;imagerie optique 22. À cet égard, l&#39;encapsulation de fortes concentrations du colorant NIRF DY-676-COOH dans l&#39;intérieur aqueux de liposomes est plus favorable pour l&#39;imagerie in vivo que le colorant libre. Le défi de la méthode réside d&#39;abord dans la bonne encapsulation et d&#39;autre part, à la validation des avantages résultant de l&#39;encapsulation de fortes concentrations du colorant. En comparant les propriétés de formation d&#39;image pour traitement de liposomes avec celle du colorant libre et également avec une formulation non trempé liposome avec de faibles concentrations de colorant est indispensable. Nous montrons par un protocole simple, mais très efficace hydratation du film et extrusion combinée avec le gel et de dégel des cycles alternés que l&#39;encapsulation des concentrations de trempe de DY-676-COOH dans des liposomes est possible. D&#39;autres procédés utilisés pour préparer des liposomes, tels que le procédé d&#39;evaporation en phase inverse 23 ainsi que la méthode d&#39;injection d&#39;éthanol 24 permettent la préparation de liposomes avec des rendements élevés d&#39;encapsulation de nombreuses substances hydrophiles. Cependant, la nature de la substance à encapsuler peut influer sur l&#39;efficacité d&#39;encapsulation. En effet,l&#39;hydratation du film et de l&#39;extrusion protocole présenté ici a révélé la plus grande efficacité pour l&#39;encapsulation de DY-676-COOH. Pour illustrer les avantages de l&#39;encapsulation liposomale de DY-676-COOH, un modèle de l&#39;oedème induit par le zymosan, ce qui permet l&#39;étude des processus inflammatoires dans les quelques heures, a été utilisé. Ici, il est démontré que les liposomes avec des concentrations élevées de la DY-676-COOH encapsulés sont plus appropriés pour le corps entier en imagerie optique in vivo de processus inflammatoires que le colorant libre ou la formulation liposomale non trempé avec de faibles concentrations de colorant. Ainsi, le protocole sous-jacent fournit un procédé simple et rapide pour produire des liposomes fluorescents pour traitement et la validation de l&#39;activation et leur potentiel imagerie à la fois in vitro et in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Materials and equipments for preparation of liposomes</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">egg phospahtidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880120P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810145P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)</td>
			<td>Sartorius AG</td>
			<td>Research RC 210 P</td>
			<td>used for weighing the phospholipids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Rotavapor</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-114</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Waterbath</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-481</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacuum Controller</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-720</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacobox</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-177</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Circulation Chiller</td>
			<td style="width:179px;">LAUDA DR. R. WOBSER 
			GMBH &#38; CO. KG</td>
			<td>WKL 230</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DY-676-COOH</td>
			<td>Dyomics GmbH</td>
			<td>676-00</td>
			<td>Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1086</td>
			<td>buffer 10 mM, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichlormethan</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>Y015.2</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>Merck Eurolab GmbH</td>
			<td>USR 170 H</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td>
			<td>Scientific Industries Inc.</td>
			<td>SI-0256</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex G25 medium&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Europe GmbH</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td>used for liposome purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X100</td>
			<td>Ferak Berlin GmbH</td>
			<td>505002</td>
			<td>used to destruct liposomes&#160; for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiposoFast-Basic</td>
			<td>Avestin Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluostar Optima</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the determination of liposome size and zetapotential</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">XL 80</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Rotor</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">SW 55 TI</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:309px;">Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z4250-250MG</td>
			<td>used for induction of inflammation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isotonic Saline (0.9)</td>
			<td style="width:179px;">Fresenius GmbH</td>
			<td style="width:119px;">PZN-2159621</td>
			<td>used for the dilution of Zymosan-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Ohmeda Isotec 4</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for anesthesizing animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane</td>
			<td>Actavis GmbH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PZN-7253744</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Mat Pro 20 W</td>
			<td style="width:179px;">Lucky Reptile</td>
			<td style="width:119px;">61202-HTP-20</td>
			<td>used to keep animals warm during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Omnican-F (1 ml injection)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3115465</td>
			<td>used for subcutaneous and intravenous application of probes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Panthenol eye cream</td>
			<td style="width:179px;">Jenapharm</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3524531</td>
			<td>used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Hanks buffered saline solution</td>
			<td style="width:179px;">PAA Laboratories /Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">L2045</td>
			<td>w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">8-Well chamber slides</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354108</td>
			<td>used for cell culture followed by microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Cell culture flasks</td>
			<td style="width:179px;">Greiner BioOne</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture media</td>
			<td colspan="2">Gibco (life technologies GmbH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-Lysine solution (0,01% - 50&#160;ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4832</td>
			<td>used to coat cell culture chamber slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mountant Permafluor</td>
			<td>ThermoScientific&#160;</td>
			<td>S21022-3</td>
			<td>Mounting solution for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hoechst-33258</td>
			<td style="width:179px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA stain for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hera-Safe</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile work bench used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HERA cell</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Incubator used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">LSM510-Meta</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system</td>
			<td style="width:179px;">CRi, Woburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for whole body fluorescence imaging of small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of absorption</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)</td>
			<td style="width:179px;">Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of fluorescence emission</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Animals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMRI mice (8-12 weeks old, male)</td>
			<td style="width:179px;">Elevage Janvier, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for inflammation trials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-quenching of a liposomal-encapsulated near-infrared fluorophore as a tool for in vivo optical imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

L&#39;encapsulation des concentrations élevées de colorants fluorescents tels que le colorant NIRF DY676-COOH utilisé ici dans l&#39;intérieur aqueux des liposomes entraîne un niveau élevé de l&#39;extinction de fluorescence. Extinction de la fluorescence, un phénomène observé avec de nombreux fluorophores à forte concentration, peut être exploitée dans plusieurs applications d&#39;imagerie in vivo où une grande sensibilité et une détection fiable de la région cible sont demandés. L&#...

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Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescence-trempe d&#39;un proche infrarouge fluorophore encapsulée dans des liposomes comme outil de<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie optique

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

16.1K vues.  Jena University Hospital. The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity. 

Vidéo: Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

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Bio-ingénierie

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Une approche recombinaison Cre-Lox P pour la détection de la fusion cellulaire In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Les nanoparticules virales pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des tumeurs

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

Imagerie collagène dénaturé Strands<em&gt; In vivo</em&gt; Et<em&gt; Ex vivo</em&gt; Par photo-déclenchée hybridation de Caged collagène Mimetic peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selective Cellule élimination de Mixed Culture 3D en utilisant une technique proche infrarouge Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

Préparation de la 3D collagène Gels et microcanaux pour l&#39;étude des interactions 3D<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

La Synthèse des RGD-fonctionnalisé hydrogels comme un outil pour les applications thérapeutiques

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted Plasma Membrane Livraison d&#39;un Hydrophobe Cargo encapsulé dans un cristal liquide Nanoparticules Transporteur

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

Nanotubes d’ADN comme un outil polyvalent pour l’étude des polymères semi-flexibles

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.