뇌는 신체에서 가장 복잡한 기관 중 하나이므로 신경 과학자들은 종종 실험 적 조작 및 관찰을위한 간단한 시스템이 필요합니다. 세포 배양은 살아있는 뉴런에 쉽게 접근할 수 있는 시스템 중 하나입니다. 일반적으로, 배양 세포는 멸균, 제어 가능한 환경 - 일반적으로 따뜻한 인큐베이터 내에서 배양 매체에게 불린 특별한 해결책에서 그(것)들을 증가시키는 관련시킵니다. 1 차적인 문화는 유기체에서 해부된 조직에서 생성되는 것입니다. 1 차적인 신경 문화의 다른 모형은 동물의 각종, 발달 단계 및 신경계 조직에서 만들 수 있습니다.

이 비디오는 일반적으로 이 세포를 사용하는 1 차적인 신경 배양 및 실험의 몇몇을 생성하는 방법에 소개를 제공할 것입니다.

신경 과학 연구에 중요 한 동물 모델의 많은 기본 신경 문화를 준비 하는 데 사용할 수 있습니다. 생의학 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 포유류 중 두 마리인 마우스와 쥐를 사용하면 배아, 신생아 새끼 및 성인이 배양을 위해 해부될 수 있습니다. 태아와 주산기 새끼는 뇌 세포가 미숙하고 손상에 덜 취약하기 때문에 일반적으로 선호됩니다.

다양 한 신 경계 조직 격리 하 고 기본 신경 문화의 다른 종류를 생산 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 뇌의 특정 부분은 소뇌, 피질 및 해마와 같은 해부 될 수 있습니다. 등대 뿌리 신경과 같은 말초 신경계의 척수 또는 구성 요소는 특정 유형의 뉴런을 성장시키기 위해 해부되고 배양될 수 있습니다.

조직 원에 관계없이, 1 차적인 신경 배양을 생성하는 일반적인 방법은 몇 가지 주요 단계로 요약 될 수있다: 해부, 해실, 도금, 및 유지 보수.

첫 번째 단계인 해부로 이러한 단계에 대한 심층 검토를 시작해 보겠습니다. 해부 및 배양 단계를 준비하는 과정에서 배양이 오염되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 공구는 알코올로 살균되어야 하며, 라미나르 플로우 후드는 종종 공기 중 오염 물질을 제거하는 데 사용됩니다.

설치류 뉴런을 배양하기 위해, 조직은 차갑고 완충된 소금 용액으로 갓 안락사된 동물에서 제거되어야 합니다. 해부 현미경을 사용하여, 조직의 작은 부분 - 해마와 같은 - 추가 처리를 위해 주의 깊게 격리될 수 있습니다.

다음으로, 해리라고 하는 프로세스에서 샘플을 셀룰러 구성 요소로 분해할 필요가 있습니다. 해부 된 조직은 메스 또는 가위를 사용하여 먼저 다진다. 결과 조직 조각은 다음 새로운 용기로 전송됩니다. 트립신 이나 papain 와 같은 프로테오리틱 효소는 세포를 함께 결합하는 세포 외 매트릭스 단백질을 소화하기 위해 첨가됩니다. 따뜻한 인큐베이터 나 수조에서 짧은 인큐베이션에 이어, 조직 조각은 부드럽게 효소를 제거하기 위해 버퍼로 세척됩니다.

연화 된 조직 조각은 이제 세포가 단일 세포 현탁액으로 풀려날 수 있도록 파이프를 여러 번 통해 조직을 통과하는 것을 포함하는 삼각에 의해 해리 될 수 있습니다. 이 시점에서, 세포는 농도계산하고 Trypan blue와 같은 얼룩을 사용하여 생존가능성을 검사할 수 있으며, 이는 성공적인 성장을 위해 현탁액을 희석해야 하는 양을 결정하는 데 도움이 됩니다.

마침내, 뉴런은 문화에 대한 준비가되어 있습니다! 살아 있고 건강하게 유지하기 위해 취해야 할 몇 가지 중요한 조치를 검토해 보겠습니다. 뉴런을 성장시키는 데 사용되는 배양 매체의 구성은 매우 중요합니다. 신경 생존과 성장을 지원하는 특별한 보충제는 일반적으로 미디어에 추가됩니다. 다른 첨가제는 신경교 세포와 같은 비 신경 세포의 분열을 억제하는 약물을 포함할 수 있다.

신경 세포 현탁액이 미디어와 혼합된 후, 세포는 원하는 용기에서 도금될 준비가 되어 있다. 여기에는 문화 접시와 접시 또는 유리 커버립이 이러한 용기 안에 배치되어 포함될 수 있습니다. 뉴런은 유리에서 직접 성장할 수 없기 때문에 커버립은 세포 부착 및 성장을 위한 더 나은 표면을 만들기 위해 미리 처리됩니다. 이러한 치료는 합성 세포 외 매트릭스 단백질코팅을 포함할 수 있습니다. 예를 들어, 폴리 리신 및 라미닌; 또는 표면을 거칠게 하는 산 에칭.

일단 도금되면, 뉴런은 따뜻하고 가습된 인큐베이터 내부에서 재배됩니다. 신경 과정의 성장은 몇 시간에서 일 안에 관찰 될 수있다. 문화를 유지하기 위해 문화 미디어의 일부는 일주일에 한 번 정도 신선한 미디어로 대체됩니다. 전형적으로, 1 차적인 신경 배양은 도금 후에 며칠에서 5 주에 어디에서든지 실험에 이용됩니다.

이제 배양에서 성장하는 뉴런이 생겼으니, 이 세포로 무엇을 할 수 있을까요?

일반적으로 신경 배양에 적용 되는 한 가지 기본 방법은 트랜스 페이션 또는 바이러스 성 트랜스 포에 의해 유전 조작. 유전 물질 인코딩, 예를 들어, 돌연변이 단백질은, 신경 기능을 바꾸기 위하여 배양된 뉴런으로 소개될 수 있다. 대안적으로, 이중 좌초 RNA를 가진 형질은 단백질 발현을 차단하는 효과적인 기술이다. 유전 조작을 위한 다중 방법 및 시약의 가용성은 이것을 연구 질문의 다양한 특히 귀중한 응용 프로그램합니다.

신경 배양에 있는 전염으로 해결될 수 있는 예시 질문은: 특정 단백질 또는 단백질 복합체가 뉴런의 각종 형태학적 구조에 인신매매되는 방법과 어디에 있습니까? 해답을 얻으려면 뉴런은 관심있는 단백질을 코딩하는 DNA로 전감염되며, 이는 녹색 형광 단백질 또는 GFP와 같은 형광 단백질과 융합 될 수 있습니다. 형광 태그 단백질의 운동 패턴 및 국소화는 살아있는 화상 진찰로 그 때 감시될 수 있습니다. 이 방법은 예를 들어, 세포 표면에 신경 전달 물질 수용체의 인신 매매를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

1 차적인 신경 배양은 또한 단하나 세포의 전기 활동이 마이크로 전극을 사용하여 측정될 수 있는 전기 생리학 연구 결과에 매우 유용합니다. 배양에 있는 뉴런의 단하나 층은 개별 세포가 표적으로 하기 쉽다는 것을 의미하고, 약리학적 인 처리와 같은 조작은 신속하고 균등하게 적용됩니다. 예를 들어, 단일 뉴런의 활동에 대한 테스트 화합물의 효과는 배양 된 뉴런의 패치 클램프 기술로 측정 될 수있다.

당신은 방금 주요 신경 문화에 대한 JoVE의 소개를 지켜보았습니다. 이 비디오에서는 이러한 문화권이 어떻게 준비되어 있는지, 그리고 일반적으로 사용되는 실험 유형을 시연했습니다. 1 차적인 신경 배양은 전형적으로 해부를 관련시키는 방법을 사용하여, 세포 현탁액으로 해조하고, 인큐베이터에서 배양 매체에서 성장하는 다양한 조직 근원에서 만들어질 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다!