Ce travail est soutenu par la biotechnologie et du Conseil de recherche en sciences biologiques (BBSRC), la Royal Society et l&#39;Université de Nottingham.

1 Détermination de l&#39;Intensité de fluorescence lors de la liaison de changement Mant nucleotide marqué. <ol><li> Ajouter 1 uM mant nucleotide marqué à une kinésine uM (concentrations finales) dans un tampon de réaction approprié. Typiquement, un tampon qui profite la croissance des microtubules et la stabilité est utilisé (voir la discussion). Un tampon couramment utilisé contient 80mm pipérazine-bis-2-éthanesulfonique (TUBES) pH6.9, 1 mM MgCl2 et 1 mM d&#39;éthylène glycol bis-2-amino-éther tétraacétique (EGTA). Remarque: La concentration de la kinésine indiqué dans tous les protocoles renvoie à la concentration des sites de liaison de nucléotides (c.-à-domaines à moteur). Différents kinésines existent sous forme de monomères, de dimères ou de tétramères et ainsi peuvent contenir plus d&#39;un site de liaison de nucléotide-par molécule. </li><li> Après une période d&#39;incubation (1-3 min) et à l&#39;aide d&#39;un fluorimètre standard, mesurer le spectre d&#39;émission du complexe de nucléotides-mant kinésine marqué. Utilisez une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm etmesure la lumière émise 400-500 nm par incréments de 1 nm. </li><li> Ajouter une solution de 1 mM de nucléotides mant marquée dans le même tampon de réaction utilisé à l&#39;étape 1.1. </li><li> Mesurer le spectre d&#39;émission de l&#39;échantillon seulement mant de nucleotides, comme décrit précédemment (voir étape 1.2). </li><li> Normaliser le spectre du signal à la longueur d&#39;onde de pic d&#39;intensité de fluorescence du spectre de nucléotides mant en solution (à savoir, sans kinésine) en divisant par le biais de cette valeur. </li><li> Tracer le spectre normalisé (par exemple, la figure 2B) pour observer les différences d&#39;intensité de fluorescence entre le mantATP lié et / ou mantADP lié kinésine et mant nucléotides en solution. </li></ol> 2 Mesure des constantes d&#39;association et de dissociation Taux de mantATP <ol><li> Pour une solution de jusqu&#39;à 20 uM kinésine (voir la discussion) dans toute Mg 2 + tampon approprié exempt (par exemple, 80 mm TUYAUX pH6.9, 1 mM EGTA, 0,1% de Tween 20), ajouter 1acide mM (concentration finale) éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 1 mM (concentration finale), le dithiothréitol (DTT). Remarque: L&#39;addition de Tween 20 à la mémoire tampon est déconseillé car il réduit / empêche la perte de la protéine kinésine sur la colonne utilisée pour l&#39;échange de tampon (étapes 2.3 et 3.3) </li><li> Incuber la solution à 25 ° C pendant 15 min. </li><li> Nucléotides séparé libre et EDTA de la kinésine en utilisant une colonne écoulement par gravité de filtration G-25 de gel de Sephadex selon les instructions du fabricant (voir la liste des matériaux). <ol><li> Equilibrer la colonne avec au moins 3 volumes de colonne d&#39;un tampon exempt de Mg2 + approprié (voir étape 2.1). Charger la solution contenant kinésine sur la colonne. Préparer un tube collecteur par l&#39;addition d&#39;un volume approprié de solution 100 mM de chlorure de magnésium dans le tube vide, de telle sorte que la concentration finale en chlorure de magnésium est de 1 mm après la collecte de la solution de kinésine. Plus immédiate de chlorure de magnésium aide stabiliSE kinésine libre nucléotides. </li><li> Eluer la kinésine au moyen d&#39;un tampon exempt de Mg2 + approprié. Les kinésines sont instables quand il est libre de nucléotides, il est important de travailler rapidement. Rangez la kinésine libre nucléotides sur la glace et utiliser dans les 1-2 heures. </li></ol></li><li> Pendant ou avant la préparation de la kinésine libre nucléotides, de préparer une série de concentrations de mantATP dans le même tampon de réaction que la solution finale de la kinésine-nucléotides libres. Déterminer la gamme de concentrations de mantATP nécessaires en fonction de la concentration disponible de la kinésine avec une série typique allant de 0,1 à 50 um (voir l&#39;étape 2.5 et discussion). </li><li> Préparer une série de concentrations de la kinésine libre nucléotides. Pour chaque concentration de mantATP (étape 2.4), une concentration de la kinésine-nucléotide libre doit être préparé de telle sorte que le nucléotide marqué est-mant dans 5 à 10 fois en excès molaire de plus de sites de liaison de nucleotides kinésine. </li><li> Réglez la longueur d&#39;onde d&#39;excitation sur le-flo arrêtéw fluorimètre à 365 nm et collecter la lumière émise à&gt; 400 nm en utilisant un filtre passe-temps. </li><li> En commençant par la plus faible concentration de mantATP, mélanger le mantATP avec une concentration appropriée de la kinésine libre nucléotides dans un rapport de 1: 1 v / v en utilisant un fluorimètre stopped-flow (figure 3A et 3B encadré). Remarque: Les réactifs sont dilués par 50% lors du mélange. Prenez note de la concentration en nucléotides fois avant et après mélange (à savoir, 3,0 / 1,5 M) pour éviter toute confusion. </li><li> Mettre en place la variation d&#39;intensité de fluorescence mesurée à chaque concentration de mantATP à une fonction exponentielle et une ligne de pente constante négative pour tenir compte de photoblanchiment du groupe de formants (c&#39;est à dire, A = Fluorescence 0 exp (k .t obs) + (m. t + c), où A 0 est l&#39;amplitude, k obs est la constante de vitesse et t le temps, voir la figure 3B et discussion). De ces accès déterminer untaux constant (k obs) à chaque concentration de mantATP. Chaque obs k est une convolution d&#39;une constante d&#39;association et de dissociation taux (Figure 1, k 1 et k-1). </li><li> Déconvolutionner les constantes d&#39;association et de taux de dissociation en traçant k obs contre la concentration mantATP (par exemple, la figure 3C). Monter ces données à une fonction linéaire (c&#39;est-à-obs k = k 1 [mantATP] + k-1) pour obtenir le point d&#39;intersection de la pente et de l&#39;axe y. La pente représente la constante de vitesse d&#39;association mantATP (figure 1, k 1), les unités M -1 s -1. L&#39;ordonnée représente la constante de vitesse de dissociation (Figure 1, k -1) avec des unités de s -1 (voir la discussion). Remarque: Cette approche peut également être appliquée pour déterminer l&#39;association et la dissociation ADPLes constantes de vitesse de la figure 1 (k, k 4 et -4) en utilisant mantADP comme le nucléotide. </li></ol> 3 Mesure de la vitesse constante de dissociation pour mantADP <ol><li> A une solution de 2 uM de kinésine dans un tampon de réaction approprié (par exemple, 80 mM de PIPES pH6.9, 1 mM de MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1% de Tween 20), ajouter 50 uM mantADP (concentration finale). </li><li> Incuber à 25 ° C pendant 30 min. </li><li> Enlever l&#39;excès de mantADP et d&#39;autres nucléotides libres par tampon échanger la kinésine dans le tampon de réaction choisie en utilisant une colonne de Sephadex G-25 (voir la liste des matériaux) selon les instructions du fabricant. Le domaine moteur de la kinésine devrait maintenant être chargé avec mantADP. </li><li> Régler la longueur d&#39;onde d&#39;excitation sur le fluorimètre stopped-flow à 365 nm et de collecter la lumière émise à&gt; 400 nm en utilisant un filtre passe-long. </li><li> Mélanger le complexe mantADP.kinesin (~ 1 uM) avec un facteur 50 ou plus molar excès d&#39;ATP non marqué dans un rapport de 1: 1 v / v à l&#39;aide d&#39;un fluorimètre stopped-flow (Figure 4A et 4B encadré). </li><li> Monter la diminution de l&#39;intensité de fluorescence observée au fil du temps à une fonction exponentielle unique et une ligne de pente négative constante pour tenir compte de photoblanchiment du groupe de Mant (c.-à-fluorescence = A 0 exp (k .t obs) + (m.t + c), où A 0 est l&#39;amplitude, k obs est la constante de vitesse et t est le temps, voir la figure 4B et discussion). Le k obs déterminée à partir de cette forme est la constante de vitesse de dissociation de l&#39;ADP (Figure 1, k 4) avec des unités de s -1 (voir la discussion). </li></ol>

<ol>
	<li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+kinesin+motor+proteins.">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation:+one+engine,+many+machines.">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li><li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase.">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li><li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules.">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li><li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors.">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li><li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors.">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+analogues+at+a+glance.">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization.">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li><li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin.">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li><li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase.">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li><li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+interaction+of+2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1:+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes.">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li><li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity.">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li><li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor.">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li><li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke.">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li><li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin.">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li><li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, 69-97 (2006).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li><li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro.">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li><li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules:+a+brief+historical+perspective.">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li><li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase.">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li><li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism.">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li><li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins.">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Ici, nous présentons des protocoles d&#39;observation et d&#39;analyse de la cinétique de transitions entre états nucléotidiques pour une kinésine. Ces protocoles utilisent la méthode de mélange stopped-flow rapide en conjonction avec des nucléotides marqués par fluorescence. Des procédés de ce type ont été utilisés dans l&#39;étude de liaison nucléotidique et la dissociation pour une variété de kinésines 9-11,13-16. Les méthodes décrites ne permettent pas l&#39;observation de la libération de phosphate (Figure 1, étape 3). Cependant, stopped-flow fluorescence peut être utilisée pour observer la transition en utilisant une protéine phosphate de détection de couple de la production de phosphate à un changement d&#39;intensité de fluorescence 17. Les méthodes présentées nucleotides marqués d&#39;utilisation avec le petit methylanthraniloyl fluorophore (d&#39;mant), qui présentent généralement une augmentation de l&#39;intensité de fluorescence lorsqu&#39;il est lié à la protéine. En outre, le fluorophore mant, lorsqu&#39;ils sont conjugués soit à la position 2 &#39;ou 3&#39; de la ribose, a souvent peu ou pas d&#39;effet sur ​​la liaison, dissociation ou hydrolyse du nucléotide 9-12. Nucléotides Mant-étiquetés sont facilement disponibles auprès de sources commerciales (voir la liste des matériaux) et sont fournis sous forme de mélanges de 2 &#39;et 3&#39; conjugué comme ils ont rapidement rééquilibrer lorsqu&#39;il est purifié à un seul isomère 8. nucléotides de Mant marqué font d&#39;excellents molécules reporters qui la cinétique de nucléotides de liaison et de dissociation peuvent être observées. L&#39;utilisation de nucleotides marqués par fluorescence signifie que la lecture sur les essais décrits est un véritable changement dans le temps de l&#39;intensité de fluorescence. Cela rend idéal pour ces dosages fluorescence stopped-flow, ce qui permet un mélange rapide des réactifs et observation du temps réel de variations de fluorescence associées à la réaction suivante. La combinaison de l&#39;arrêt d&#39;écoulement comme la technique de mélange et de la fluorescence en tant que procédé de détection produit un système qui est relativement ef échantillonficient. Par exemple, afin d&#39;acquérir des données représentées sur la figure 3C nécessite 0,8 à 1,0 mg de kinésine-13 purifiée, MCAK, et d&#39;acquérir les données de la Figure 4B nécessite ~ 0,3 mg de kinésine-13 purifiée, MCAK. Un inconvénient de l&#39;utilisation d&#39;mant comme un fluorophore est qu&#39;il est sujet à des photoblanchiment. Ceci peut être observé de manière isolée à partir de kinésine cinétique de réaction en mélangeant une solution du nucléotide marqué mant avec le tampon de réaction, en l&#39;absence de kinésine, dans la stopped-flow. Une diminution lente de l&#39;intensité de fluorescence est observé que le groupe de formants est blanchie. Sur la plage des échelles de temps utilisées dans les protocoles photoblanchiment du groupe mant décrites est bien décrite par une fonction linéaire. Par conséquent, un moyen simple de corriger les données de photoblanchiment est de s&#39;adapter à une fonction exponentielle avec une ligne de base décrite par une fonction linéaire (c.-à-c + m) au lieu de la ligne de base plus plat commun, décrit par un seul paramètre. liaison mantATP Lors de la mesure des constantes de vitesse d&#39;association et de dissociation de mantATP (Section 2) l&#39;ADP, qui reste associé avec le site de liaison nucléotidique kinésine en l&#39;absence de microtubules, doit être retiré. Cela permet association mantATP et dissociation (Figure 1, étape 1) à observer dans l&#39;isolement de la dissociation ADP. Pour atteindre cet objectif la kinésine est incubé avec au moins un excès de 50 fois de l&#39;EDTA sur les sites de liaison de nucleotides (étape 2.1). L&#39;EDTA séquestre des ions Mg 2 + provoque Mg2 + se dissocier de la poche de nucléotides contraignant, ce qui entraîne la libération du nucléotide 11. Par conséquent, lors de la réalisation étapes 2.1 à 2.3, il est essentiel d&#39;utiliser un tampon sans Mg 2 +. La protéine kinésine libre nucléotide est un échange de tampon pour séparer les deux de nucléotide libre et de l&#39;EDTA. Pour réaliser cette séparation, un ge d&#39;écoulement par gravité jetablecolonne l de filtration est suffisante et il est simple et rapide à utiliser (voir la liste des matériaux). L&#39;interaction avec les nucléotides de la kinésine mantATP libre est réalisé à une gamme de concentrations mantATP (étape 2.4) pour permettre une déconvolution des constantes d&#39;association et de dissociation (taux étape 2.8). La théorie derrière expériences de ce type est bien décrit dans la référence 18 Dans l&#39;exercice de ces expériences, on commence avec la plus faible concentration de mantATP. Cela supprime la nécessité d&#39;étapes de lavage entre les différentes concentrations. Il sera probablement nécessaire d&#39;ajuster la sensibilité du fluorimètre stopped-flow que la concentration mantATP est augmentée. La concentration mantATP doit toujours être au moins 5 fois plus élevées que sur la concentration des sites de liaison kinésine nucléotidiques de maintenir pseudo conditions de premier ordre. Toutefois, comme la concentration de mantATP est augmentée, le changement de signal peut devenir submergé comme la fraction de nucléotides qui se lie à la kinésine diminue. Therefore, la concentration de la kinésine est également augmentée pour chaque nouvelle concentration de mantATP de telle sorte que la concentration de mantATP n&#39;est jamais plus grande que l&#39;excès molaire de 10 fois plus de sites de liaison de nucleotides (étape 2.6). mantADP dissociation Bien que les constantes d&#39;association et de taux de dissociation pour mantADP peuvent être déterminées par la méthode décrite pour mantATP (Section 2). La dissociation de l&#39;ADP à partir d&#39;une kinésine peut être directement observé par le préchargement du site de liaison nucléotidique de mantADP (étapes 3.1 à 3.3) Le complexe mantADP.kinesin est ensuite mélangée avec un excès d&#39;ATP non marqué (étape 3.5). L&#39;excédent non marqué ATP empêche reconsolidation de mantADP à la kinésine et permet ainsi la réaction de dissociation (Figure 1, k 4) à observer dans l&#39;isolement de l&#39;association de mantADP. Dans cet essai, la concentration de l&#39;ATP non marqué doit être d&#39;au moins un excès molaire de 50 fois de nucleotide sites de liaison. La théorie derrière ce test est bien décrit dans la référence 18 Cette méthode directe donne une valeur plus précise de la constante de vitesse de l&#39;extrapolation à l&#39;axe des y décrit à l&#39;étape 2.8 dissociation. Inclusion des microtubules Les méthodes décrites peuvent également être utilisées pour déterminer la cinétique de liaison et la dissociation nucléotidique en présence de microtubules. Les microtubules sont introduits à la seringue contenant nucleotide avant le mélange dans la stopped-flow: la seringue inférieur sur la figure 3B et 4B (Encarts). Dans cette configuration, la kinésine rencontrera le nucléotide en même temps qu&#39;il remplit les microtubules. Microtubules stabilisés sont utilisés, où la durée de vie du polymère de la tubuline est prolongée par l&#39;utilisation soit d&#39;un stabilisant chimique, tel que le taxol ou un analogue de GTP non-hydrolysable, tels que la guanosine-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] triphosphate (GMPCPP, voir la liste des matériaux). Il est possible d&#39;utiliser deux cycles de polymérisation de la tubuline avec GMPCPP faire microtubules qui peuvent être stockés pendant de nombreux mois à 9,19 d&#39;azote liquide. L&#39;utilisation de microtubules préparés à l&#39;avance permet de réduire considérablement les difficultés pratiques rencontrées dans l&#39;exécution de ces tests. Pour inclure des microtubules dans les essais, il est important d&#39;utiliser un tampon de réaction approprié pour la stabilité des microtubules. Le tampon de choix est TUYAUX base, avec le tampon le plus couramment utilisé contenant 80 mM PIPES pH 6,9, MgCl2 1 mM et 1 mM d&#39;EGTA (connu sous le nom BRB80) 20,21. Les procédés décrits ne sont pas limités à une utilisation avec des kinésines, mais peuvent être adaptées et appliquées à n&#39;importe quelle protéine de liaison nucléotidique. Par exemple, des procédés similaires ont été appliqués pour le cycle de renouvellement de l&#39;ATP des membres de la famille de la myosine de moteurs moléculaires 12,22 et l&#39;utilisation de nucleotides marqués mant de guanosine s&#39;étend en outreméthodes de ce type de GTP hydrolyser les protéines 23,24.

Les kinésines sont une superfamille de protéines caractérisées par un domaine moteur hautement conservée 1. Le domaine moteur de la kinésine interagit avec les microtubules d&#39;une manière dépendant de nucléotides. Les membres de la famille de kinésine affichent une gamme de fonctions de kinésines translocation, qui transportent des marchandises d&#39;une manière dirigée le long des microtubules, à kinésines finaux de liaison non-translocation microtubules, qui régissent la dynamique des microtubules 2,3. Kinésines utilisent le chiffre d&#39;affaires de adensosine-5&#39;-triphosphate (ATP) pour réguler leur interaction avec le cytosquelette de microtubules 4-6. La conformation du domaine moteur de la kinésine et donc son affinité pour les microtubules dépend de son état ​​de nucléotides: ATP, ADP, ou ADP.Pi aucun nucleotide peuvent être liés (figure 1). Pour comprendre le mécanisme moléculaire d&#39;une kinésine, une compréhension de la relation entre le chiffre d&#39;affaires de l&#39;ATP et de l&#39;interaction des microtubules est nécessaire. Lerefore, un objectif majeur dans le domaine de la kinésine est de caractériser les propriétés fonctionnelles de différents états de nucleotides et la cinétique de la transition entre les deux, en présence et en l&#39;absence de microtubules. <img alt="Figure 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> Figure 1: Le plus simple du cycle de renouvellement de l&#39;ATP pour une kinésine se compose de quatre états possibles: (Φ) gratuit nucléotides, liée à l&#39;ATP, ADP.P i liØes et l&#39;ADP lié Chacun des quatre transitions se caractérise par un avant et. constante vers l&#39;arrière de taux (k x et k-x respectivement). Pour comprendre comment le cycle de produit chimique de renouvellement de l&#39;ATP est couplée au cycle de l&#39;interaction mécanique des microtubules, il faut déterminer quelle étape dans le cycle de renouvellement de l&#39;ATP est la limitation de débit en l&#39;absence de Microtubules et ensuite déterminer comment le cycle est modifié par la présence de microtubules. Le plus simple cycle de renouvellement de l&#39;ATP se compose de quatre étapes chimiques différents: (1) liaison de l&#39;ATP sur le site vide (Φ désigne le site vide, c&#39;est à dire, la kinésine libre nucléotides); (2) le clivage de l&#39;ATP; (3) la dissociation du phosphate et (4) la dissociation ADP (figure 1). L&#39;étape limitant la vitesse règle la constante de vitesse pour la durée du cycle de renouvellement de l&#39;ATP. Par conséquent, afin de déterminer qui est l&#39;étape limitant la vitesse de chacune des transitions individuelles doit être mesuré et comparé à la constante de vitesse pour l&#39;ensemble du cycle. Méthodes pour mesurer le chiffre d&#39;affaires de l&#39;ATP constante du taux global de cycle ne sont pas décrits ici, mais peuvent être trouvés dans la référence 7 Ici, nous décrivons les méthodes par lesquelles les constantes de vitesse pour différentes étapes chimiques peuvent être déterminées. Il existe un certain nombre de méthodes pour étudier les transitions individuelles dans le cycle de rotation d&#39;une protéine nucléotidique d&#39;hydrolyse. Les méthodes présentées ici prennent Advantage des propriétés de nucleotides marqués avec le fluorophore methylanthraniloyl, généralement désigné sous le nom mant, qui présentent un changement de l&#39;intensité de la fluorescence lors de la liaison à la protéine 8. Le groupe de Mant est utilisé parce que sa petite taille signifie que, lorsqu&#39;il est couplé à la ribose (figure 2A), il a généralement peu ou pas d&#39;effet sur ​​la cinétique de liaison nucléotidique ou hydrolyse 9-12. Ici, nous présentons des protocoles décrivant l&#39;utilisation de nucléotides de Mant marqué, en collaboration avec la fluorescence stopped-flow, pour permettre l&#39;observation de nucléotides de liaison et de dissociation dans le cycle de renouvellement de l&#39;ATP d&#39;une kinésine.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;triphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-202</td>
			<td style="width:279px;">mantATP</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-201</td>
			<td style="width:279px;">mantADP</td>
		</tr>
		<tr height="134">
			<td height="134" style="height:134px;width:220px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:147px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;"># 10519979001</td>
			<td style="width:279px;">The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&#160;mM in 100&#160;mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260&#160;nm (e = 15400&#160;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&#160;oC.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP120-500</td>
			<td style="width:279px;">0.5&#160;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:220px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:147px;">Melford</td>
			<td style="width:136px;">MB1015</td>
			<td style="width:279px;">1&#160;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">NAP-5 column</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;"># 17-0853</td>
			<td style="width:279px;">G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:220px;">GMPCPP</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-405</td>
			<td style="width:279px;">nonhydrolysable analogue of GTP</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:220px;">Stopped-flow fluorimeter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Applied Photophysics</td>
			<td style="width:136px;">SX20</td>
			<td style="width:279px;">A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&#160;-&#160;100&#160;s to be monitored.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

La superfamille des protéines de kinésine de moteur associées aux microtubules part un domaine caractéristique du moteur qui s&#39;hydrolyse à la fois d&#39;ATP et lie les microtubules. Kinésines présentent des différences à travers la superfamille tant en chiffre d&#39;affaires de l&#39;ATP et de l&#39;interaction des microtubules. Ces différences adapter kinésines spécifiques à diverses fonctions telles que le transport de fret, microtubules coulissant, la dépolymérisation des microtubules et la stabilisation des microtubules. Pour comprendre le mécanisme d&#39;action d&#39;une kinésine il est important de comprendre la façon dont le cycle de produit chimique de renouvellement de l&#39;ATP est couplée au cycle de l&#39;interaction mécanique des microtubules. Pour disséquer le cycle de renouvellement de l&#39;ATP, une approche consiste à utiliser des nucléotides marqués par fluorescence de visualiser les différentes étapes du cycle. La détermination de la cinétique de chaque transition de nucleotides dans le cycle de renouvellement de l&#39;ATP permet l&#39;étape de limitation de vitesse ou les étapes du cycle complet de l&#39;identifier. Pour une kinésine, il est important de connaître l&#39;étape limitant la vitesse, àl&#39;absence de microtubules, comme cette étape est généralement accélérée plusieurs milliers de fois lorsque la kinésine interagit avec les microtubules. Le cycle en l&#39;absence de microtubules est ensuite comparé à celui en présence de microtubules pour bien comprendre le cycle de renouvellement de l&#39;ATP de la kinésine. La cinétique de transitions nucléotidiques individuelles sont généralement trop rapide pour observer en mélangeant les réactifs à la main, en particulier en présence de microtubules. Dispositif de mélange rapide, par exemple un fluorimètre stopped-flow, qui permet d&#39;observer la cinétique sur des échelles de temps d&#39;aussi peu que quelques millisecondes, peut être utilisée pour contrôler de telles transitions. Ici, nous décrivons les protocoles dans lesquels un mélange rapide des réactifs par stopped-flow est utilisé en conjonction avec des nucléotides marqués par fluorescence pour disséquer le cycle de renouvellement de l&#39;ATP d&#39;une kinésine.

Une augmentation de l&#39;intensité de fluorescence du groupe de formants est généralement observé lors de la liaison de nucléotide marqué mant à une kinésine. Cependant, l&#39;amplitude de ce changement de signal dépend de la kinésine particulier en question. Par conséquent, il est utile d&#39;effectuer des mesures d&#39;équilibre pour confirmer à la fois la présence et l&#39;amplitude d&#39;un changement d&#39;intensité de fluorescence avant de passer à des essais cinétiques. Spectres de fluorescence Représentant pour mantATP et mantADP, à la fois en solution et en complexe avec la kinésine-13, MCAK, sont présentés dans la figure 2B. Ces données mettent en évidence l&#39;augmentation de l&#39;intensité de fluorescence affichée par les deux mantATP et mantADP lors de la liaison à MCAK. Le changement d&#39;intensité de fluorescence lors de la liaison de nucléotides mant à une kinésine est utilisé pour rendre compte de l&#39;association et de la dissociation des deux ATP et ADP (articles 2 et 3). Dans le cas de MCAK, une différence d&#39;intensité de la fluorescence est observée entre mantATP.kinesin et mantADP.kinesin <sup&gt; 9. La figure 3A représente la réaction qui se produit lors du mélange avec mantATP kinésine libre nucléotides. Les données représentatives illustrant l&#39;augmentation de l&#39;intensité de la fluorescence qui se produit lors de la liaison de mantATP à la kinésine-13, MCAK est représenté sur la figure 3B. Les données du type représenté sur la figure 3B sont collectées dans une plage de concentrations mantATP. Une parcelle des constantes de vitesse (k obs) déterminés en fonction de la concentration mantATP est illustré à la figure 3C. Montage de ces données à une fonction linéaire (c&#39;est-à-obs k = k 1 [mantATP] + k-1) permet la déconvolution des constantes de vitesse qui contribuent à k obs (étape 2.8). Par conséquent, permettant de déterminer à la fois l&#39;association et la constante de vitesse de dissociation pour mantATP (Figure 1, k 1 et k <em&gt; -1 respectivement). La figure 4A représente la réaction qui se produit lors du mélange mantADP.kinesin avec un excès d&#39;ATP non marqué. Les données sur la figure 4B montre la diminution de l&#39;intensité de fluorescence observée pour mantADP lors de la dissociation de la kinésine-13, MCAK. En adaptant ces données à une fonction exponentielle (étape 3.6), la constante de vitesse de dissociation de mantADP est déterminée directement. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> Figure 2 nucléotides marqués à la methylanthraniloyl fluorophore (de Mant) sont utilisés pour isoler les différentes étapes du cycle de renouvellement de l&#39;ATP. (A) La structure de mantATP montrant la position du fluorophore mant soit conjugué à la position 2 &#39;ou 3&#39; du ribose sur la position (B). Spectres de fluorescence normalisée pour mantATP mantADP et en solution (maxp) et un mantATPd mantADP dans un complexe avec la kinésine MCAK (MATP + MCAK et MADP + MCAK). Les spectres mantATP sont normalisées à la fluorescence au max pour mantATP en solution et les spectres mantADP sont normalisées à la fluorescence au max pour mantADP en solution. Les spectres des nucléotides mant mélangés avec MCAK sont collectées au poste mélange 1 min. La concentration des réactifs et des paramètres fluorimètre sont tels que décrits dans le protocole les étapes 1.1 et 1.2. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> Figure 3 La mesure de la constante de vitesse d&#39;association de mantATP. (A) Schéma représentant la réaction qui a lieu après mélange par stopped-flow: mantATP (MATP) se lie au nucléotide sans kinésine. L&#39;intensité de fluorescence des groupes de Mant augmente lors de la liaison de la protéine. (B) variation du signal de fluorescence (noir) observé lors du mélange mantATP (25 M) avec MCAK (5 M nulibre cleotide,). Ces données sont en forme (tirets rouges) à une fonction exponentielle unique et une ligne de pente négative constante, qui représente photoblanchiment du fluorophore mant (voir la discussion) Encart:. Contenu des seringues avant le mélange sur le fluorimètre stopped-flow. (C) Les constantes de vitesse (k obs) déterminées pour la réaction de mantATP avec MCAK libre nucléotides fonction de la concentration de mantATP. Cette parcelle aura une région linéaire avec le gradient étant la constante de vitesse d&#39;association (Figure 1, k 1) avec des unités de M -1 s -1 et l&#39;ordonnée à l&#39;origine est la constante de vitesse de dissociation (figure 1, k-1) avec unités de s -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> . Figure 4 Mesure de la constante de vitesse de dissociation pour mantADP (A) Schéma représentant la réaction qui a lieu après mélange par stopped-flow: kinésine préchargé avec mantADP est dilué dans un excès d&#39;ATP non marqué. Dissocier mantADP est remplacé par non marqué ATP, empêchant ainsi la réaction inverse d&#39;association mantADP (voir la discussion). L&#39;intensité de fluorescence du groupe de formants diminue lors de la dissociation de la protéine. Diminution (B) de fluorescence observé sur la dissociation de la kinésine à partir de mantADP MCAK. Le signal de fluorescence (noir) est apte (tirets rouges) à une seule exponentielle et une ligne de pente négative constante pour tenir compte de photoblanchiment du groupe de Mant (voir la discussion). La constante de vitesse déterminée est la constante de vitesse de dissociation de mantADP (Figure 1, k4) En médaillon:.. Contenu des seringues avant de les mélanger sur un fluorimètre à flux arrêté <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins at JoVE.com

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Les kinésines sont caractérisées par une interaction dépendant de nucléotides avec les microtubules: un cycle de renouvellement de l&#39;ATP couplée à un cycle d&#39;interaction des microtubules. Ici, nous décrivons les protocoles d&#39;analyser la cinétique de la transition de nucleotides individuels dans le cycle de renouvellement de l&#39;ATP à l&#39;aide d&#39;une kinésine nucleotides marqués par fluorescence et la fluorescence stopped-flow.

L&#39;utilisation de nucléotides stopped-flow fluorescence et marqués d&#39;analyser les Chiffre d&#39;affaires Cycle ATP de kinésines

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.4K vues.  University of Nottingham.  Les kinésines sont caractérisées par une interaction dépendant de nucléotides avec les microtubules: un cycle de renouvellement de l'ATP couplée à un cycle d'interaction des microtubules. Ici, nous décrivons les protocoles d'analyser la cinétique de la transition de nucleotides individuels dans le cycle de renouvellement de l'ATP à l'aide d'une kinésine nucleotides marqués par fluorescence et la fluorescence stopped-flow. 

Vidéo: Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

Préparation et utilisation de samarium diiodure (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) In Organic Synthesis: Le rôle mécanistique de HMPA et Ni (II) Sels dans la réaction Samarium Barbier

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

Recherche

Chimie

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

L&#39;état d&#39;équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d&#39;affaires de l&#39;activité de ADNglycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

Détermination des plans de liaison à la glace des protéines antigel par affinité du plan de glace basée sur la fluorescence

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

L&#39;utilisation de la chromatographie en phase gazeuse pour l&#39;analyse compositionnelle modifications des acides gras dans les tissus de foie de rat pendant la grossesse

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

Préparation et utilisation des carbènes carbonyle décorées dans l&#39;activation de phosphore blanc

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

La bioconjugaison et radiosynthèse de<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorps Zr-DFO-étiquetés

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

Visualisation de Ambient Spectrométrie de masse à l&#39;utilisation de Schlieren Photographie

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Un protocole optimisé pour le radiomarquage efficace de nanoparticules d&#39;or à l&#39;aide d&#39;un<sup&gt; 125</sup&gt; I-étiqueté Azide prothétique Groupe

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Préparation et évaluation des<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marquée tridenté chélates de pré-ciblage utilisant Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...