The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

NOTE: Toutes les procédures de collecte de sang décrites dans cette méthode ont été menées conformément à la Déclaration d&#39;Helsinki et approuvés par l&#39;examen UNT carte institutionnelle (IRB) pour les sujets humains. Tous les sujets ont donné leur consentement écrit pour la collecte de sang, qui a été utilisé dans le présent procédé pour se assurer qu&#39;elles étaient apparemment en bonne santé, de poids normal, et les maladies. 1. Réactif Source &amp; Préparation <ol><li> Utilisation CD66b-APC (clone # G10F5; DF = 1: 50) et CD45-APCeFluor780 (clone # 2D1, DF = 1: 50) pour cet essai. REMARQUE: Avant l&#39;étude, les anticorps CD45 et CD66b ont été titrés pour déterminer la dilution optimale qui granulocytes clairement résolus (CD45 + / 66b) de + d&#39;autres leucocytes (CD45 + / 66b-) 11. Lors de l&#39;addition de l&#39;anticorps dilué pour la coloration de la dilution finale dans le tube était de 875. </li><li> Achetez et dégeler stocks S. aureus bioparticules marqué avec pHrodo colorant rouge. Suspendre à une concentration de 1 mg de particules biologiques par ml dans du PBS stérile. Bioparticules aliquotes diluées et de magasin congelés à -20 ° C jusqu&#39;à leur utilisation dans le dosage. </li><li> Dissoudre dihydroethidium (DHE), qui est converti en bromure d&#39;éthidium fluorescent en présence de radicaux libres de l&#39;oxygène (par exemple, le burst oxydatif), dans du DMSO à une concentration finale de 10 g / ml. </li><li> Mélanger le N-éthylmaléimide (utilisée pour prévenir la phagocytose supplémentaire après la durée d&#39;incubation de dosage spécifié) avec du PBS stérile dans une dilution de l&#39;étape 2 de 200 mg / ml et 17,5 mg / ml, respectivement. Dans l&#39;essai, en utilisant une concentration finale de 15 mM. Lors de la décongélation N-éthylmaléimide, utiliser un bloc C de chaleur de 37 °, que le N-éthylmaléimide ne reste pas en solution. </li><li> Après l&#39;étape de fixation finale, utiliser 7AAD pour colorer l&#39;ADN nucléaire. Avant l&#39;addition, diluer stocks 7AAD 01h10 avec du PBS stérile. </li></ol> 2. Prélèvement d&#39;échantillons de sang <ol><li> Demandez sujets pour arriver à la suite d&#39;un laboratoire O / N rapide (&gt; 8 h) et abstentisur l&#39;activité physique (&gt; 12 h). </li><li> Après le nettoyage de la peau avec un tampon de préparation de l&#39;alcool, insérer une aiguille de collecte de sang stérile dans un bras veine périphérique. </li><li> Prélever le sang dans des tubes sous vide qui sont commercialement remplis d&#39;héparine de sodium. </li><li> Après la collecte, appliquer un pansement adhésif pour le bras du sujet. </li><li> Inversez tubes de sang de mélanger 10 fois et ensuite placer sur une bascule jusqu&#39;à l&#39;analyse. </li></ol> 3. La phagocytose Assay Technique <ol><li> Bioparticules dégel S.aureus (RT), DHE (RT), et de N-éthylmaléimide (37 ° C). </li><li> Ajouter 20 L de bioparticules S.aureus 4 individuels 1,2 ml tubes tout en travaillant dans la hotte stérile. </li><li> Ajouter 40 l de DHE pour chaque tube contenant les particules biologiques. </li><li> Tapoter doucement les tubes sur la surface du banc pour recueillir les réactifs dans le fond du tube. </li><li> Ajouter 100 L de sang entier mélangé pour que chaque tube a été rempli de particules biologiques et DHE. </li><li>Essuyer le bord intérieur des tubes avec un coton-tige pour enlever toute trace de sang contaminer. </li><li> Mélanger le sang et réactifs avec une pipette électronique doté de mélanger le sang et réactifs pour les trois cycles après l&#39;addition de sang. </li><li> Placez les tubes à essai dans un seau à glace et couvrir pour protéger de la lumière. </li><li> Incuber les tubes à essai à 10, 20 et 40 min. Commencer par le tube de 40 min pour se assurer que tous les tubes à essai terminent en même temps. </li><li> Thaw N-éthylmaléimide dans 37 ° C bain de perles. </li><li> Pipeter 15 L de N-éthylmaléimide (décrit ci-dessus en 1.4) dans chaque tube à essai, incuber pendant 30 min. </li><li> Pipet 10 L de CD66b-APC et 10 L de CD45-APCeFluor780 des anticorps dilué (décrites ci-dessus en 1.1), incuber pendant 60 min. </li><li> Pipet 750 L de solution de lyse WBC fixe / RBC dans chaque tube à essai, incuber pendant 60 min. </li><li> Centrifugeuse (10 min à 400 x g) des tubes à essai pour recueillir le culot cellulaire. </li><li> Vide aspirer la solution lyse WBC / fix RBC, laissant un fl résiduellevolume de fluide (100 L) au-dessus du culot cellulaire. </li><li> Pipeter 10 L de solution diluée de 7AAD (décrit ci-dessus en 1.5) et 50 L de PBS dans chaque tube à essai. </li><li> Ajouter une goutte de billes de calibration (~ 25 L) à chaque tube à essai, placer des bouchons sur les tubes à essai, des tubes à envelopper dans du papier, et le placer dans un réfrigérateur. </li><li> Chargez le tube de l&#39;échantillon dans le flux à base d&#39;images cytomètre et de recueillir un minimum de 3000 événements de granulocytes en utilisant des paramètres prédéfinis: passeur d&#39;échantillons, bleu (488 nm; 60 mW), rouge (640 nm; 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers (figure 1). </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> Figure 1. Méthode d&#39;acquisition et gabarit. Les échantillons ont été acquis sur un flux à base d&#39;images cytomètre (A). Lors de l&#39;acquisition, tracés de points de Bright Champ Aspect Ratio vs CD66b-APC ont été générés aux granulocytes séparés de billes de calibration dopés USINlogiciel g INSPIRE v. 100.2.292.0 (B). Un minimum de 5000 granulocytes ont été acquis pour chaque échantillon en utilisant un passeur d&#39;échantillons, bleu (488 nm; 60 mW), rouge (640 nm; 100 NW), SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers. Se il vous plaît noter qu&#39;un certain nombre d&#39;histogrammes sont présents lors de l&#39;acquisition de surveiller les paramètres de laser et d&#39;autres aspects des données recueillir. Tous ces histogrammes sont facultatifs et seulement nécessaire si les procédures d&#39;exploitation normalisées de laboratoire nécessite comme contrôle de la qualité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Acquisition et analyse 4. échantillon <ol><li> Utilisez l&#39;assistant de compensation de logiciel automatisé du logiciel IDEAS d&#39;appliquer une matrice de compensation à des fichiers d&#39;images brutes (FRR) et de créer des fichiers de compenser imagées (CIF). </li><li> Charger des fichiers CAF individuels dans le logiciel des idées et générer les parcelles suivantes pour identifier les sous-ensembles de granulocytes: </li&gt; <li> Établir portes initiales pour identifier les cellules qui ont été considérés comme la mise au point en utilisant un histogramme de vives RMS de gradient de champ (figure 2A). Faire de cette détermination pour chaque échantillon de patient en utilisant le contrôle non stimulées comme norme de référence. </li><li> Utilisez intrigues secondaires à cellules singlet distinctes de débris et doublets utilisant une dot plot lumineux de rapport d&#39;aspect de champ (rapport entre la hauteur de la cellule par rapport à la largeur) vs. lumineuse zone de champ (figure 2B). Faire de cette détermination pour chaque échantillon de patient en utilisant le contrôle non stimulées comme norme de référence. </li><li> Une fois une population de cellules propres avait été identifié, établir une dot plot de CD45 contre CD66b (figure 2C) pour identifier positivement granulocytes (CD45 + / 66b +). Créez un nuage de fille (figure 3) de l&#39;intensité lumineuse de détail pour S. aureus (x de l&#39;axe) vs. lumineuse intensité de détail pour oxydatif (DHE, axe y) pour identifier des sous-ensembles de granulocytes activés. Recueillir brimages de terrain ight dans le canal 1 et 9, bioparticules dans le canal 2, DHE à Channel 4, Channel 5 au 7AAD, CD66b dans le canal 11, et CD45 dans le canal 12. </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> Figure 2. Modèle d&#39;analyse. Ce chiffre de la série d&#39;emplacements qui ont été générés pour identifier des cellules qui ont été mis au point (A), des cellules individuelles (B), les granulocytes (C). Parcelles supplémentaires ont été utilisés pour identifier les trois sous-ensembles de granulocytes activés contre granulocytes inactifs. Toutes les analyses de fichiers d&#39;images acquises a été achevée en utilisant un logiciel IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

<ol>
	<li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes.">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li><li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response.">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li><li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis,+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms.">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li><li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li><li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-year+school-based+diet/exercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children.">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status.">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li><li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderate-intensity,+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults.">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li><li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise:+implications+for+infection+risk.">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li><li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst.">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li><li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes.">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li><li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative.">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li><li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes.">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li><li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus.">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li><li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis:+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections.">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li><li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro.">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li><li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay.">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baker's+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold/Flu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise.">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li><li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain.">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Le présent procédé représente un raffinement des méthodes existantes pour l&#39;évaluation de la fonction des granulocytes en utilisant la cytométrie de flux 1,3,4,12-14. Les étapes essentielles de ce dosage ont tendance à être liée à un bon mélange de l&#39;échantillon de sang avec les particules biologiques et DHE. Un mélange incomplet entraînera des résultats inexacts. Bien que le mélange complet est critique, la méthode de mélange doit être doux dans la nature. Il est suggéré que le mélange est effectué en utilisant une pipette électronique avec une fonction de mélange plutôt que d&#39;un mélangeur vortex. Une autre étape critique dans l&#39;essai est de se assurer qu&#39;il n&#39;y a pas toujours de contaminer le sang moitié supérieure du tube de dosage. Ce sang résiduel peut être retiré à l&#39;aide d&#39;un coton-tige stérile. L&#39;élimination complète est important parce que l&#39;échec de le faire peuvent contaminer la préparation d&#39;essai final avec les globules rouges non lysées. Avant d&#39;utiliser cette méthode de contrôle de compensation appropriées devraient être ajoutés à contrôler spchevauchement ectral parmi les réactifs utilisés pour identifier les différents aspects de la fonction de granulocytes. Pour cette méthode, les contrôles de compensation impliquent recueillir des échantillons de sang qui ont été proposées le 40 min dosage incubation puis marquage avec un marqueur unique (ce est à dire, E. coli, DHE, etc.). Après marquage, les événements positifs simples sont collectées et une matrice de compensation est généré à l&#39;aide d&#39;un assistant automatisé dans le logiciel d&#39;analyse des idées. Il est essentiel que si ce test est utilisé, les contrôles de compensation appropriées pour se assurer de la bonne performance du dosage. L&#39;analyse est réalisée en utilisant la fonction finder et co-localisation des assistants pour identifier cette lumineuse intensité de détail est la meilleure variable pour séparer les populations et identifier aussi combien il existe un chevauchement entre burst oxydatif et les signaux de phagocytose. Plus précisément, l&#39;utilisation de la cytométrie à base d&#39;image à condition que la capacité de séparer les granulocytes activés en trois sous-ensembles. Tsa dépression de sous-ensemble a été déterminée en utilisant l&#39;intensité lumineuse de détail de la phagocytose vs oxydatif. En plus de l&#39;examen de ces fonctions cellulaires singulières, les cellules qui présentaient ces deux événements dans le même temps dans le même emplacement anatomique (co-localisation) ont été identifiés. Granulocytes qui sont tombées dans le sous-ensemble &quot;de haute activité&quot; étaient le seul phénotype qui a démontré la co-localisation cohérente entre oxydatif phagocytose et. Cette identification de sous-ensembles de granulocytes activés est la plus grande zone où dépannage est nécessaire. Il est très important pour un nouvel utilisateur de prendre le temps de comprendre le workflow du processus de l&#39;échantillon dans les idées et de comprendre les mécanismes de séparer les populations de cellules en utilisant le composant d&#39;imagerie. D&#39;autres modifications que l&#39;utilisateur peut chercher à faire comprennent la sélection de fois dosage incubation alternatives ou supplémentaires. La méthode actuelle suggère l&#39;utilisation de durées de 10 à 40 min; Toutefois, selon le modèle expérimental où cette méthode estdoit être utilisé, il peut être nécessaire de choisir des durées plus dosage. Une telle modification devrait être évalué sur une base individuelle. En outre, il a été déterminé que la durée de l&#39;incubation de dosage a un effet significatif sur l&#39;apparition des trois sous-ensembles activés. L&#39;approche décrite dans le présent rapport représente une extension de ce que l&#39;information pourrait être obtenue précédemment en ce qui concerne la fonction des granulocytes 3,4,13,15. D&#39;autres laboratoires ont démontré l&#39;importance de l&#39;évaluation des changements en fonction des granulocytes dans le cadre d&#39;une évaluation globale de l&#39;immunité et de la maladie 15-17. En dépit du potentiel de cet essai ne est pas sans limitations. Une des limitations majeures est la demande de coût et de temps associée à une forte traitement des échantillons de débit. Quand un modèle d&#39;étude nécessite un grand nombre d&#39;échantillons dans un jour donné, elles peuvent être difficiles à traiter. Le traitement est simplifié par l&#39;utilisation de pipettes électroniques et distributeurs,mais ceux-ci ont tendance à être coûteux et ne sont pas nécessairement disponibles dans tous les laboratoires. Notre domaine de recherche se concentre sur une étude de la façon dont l&#39;exercice et les habitudes alimentaires influent sur ​​la santé du système immunitaire et la fonction 6,8-10,18-20. Ces objectifs ont des implications pratiques importantes pour une variété de domaines de la santé humaine. Au-delà de l&#39;étude des effets de l&#39;exercice et de la nutrition de la méthode de la phagocytose démontré dans ce manuscrit pourrait être utile dans d&#39;autres domaines de l&#39;immunologie clinique où la surveillance de la fonction de phagocytose est essentielle pour les résultats du traitement. Le présent essai est le premier de beaucoup que les dosages immunologiques avec le potentiel d&#39;être réinventées en prenant avantages de l&#39;information d&#39;imagerie unique qui peut être possible à partir d&#39;un flux à base d&#39;images cytomètre.

Granulocytes représentent une composante du système immunitaire innée de l&#39;organisme, qui fournit la première ligne de défense contre les antigènes envahisseurs. Les procédés antérieurs pour évaluer la fonction des granulocytes ont porté sur la capacité de phagocytose ou oxydatif en utilisant des procédés différents, ce qui rend difficile de déterminer collectivement comment les granulocytes ont changé 4.1. Les progrès dans le domaine de la cytométrie de flux ont abouti à la production d&#39;instruments capables de paillasse haute résolution, l&#39;imagerie multi-couleur de cellules d&#39;une manière à haut débit 5. La capacité de combiner l&#39;imagerie avec un débit traditionnelle représente cytométrie un progrès qui fournit la plate-forme technologique nécessaire pour innover au sein de flux existants cytométrie méthodes et extraire de nouvelles informations sur le système immunitaire. Au cours des dix dernières années, notre laboratoire, entre autres, a été vivement mis l&#39;accent sur l&#39;effet de divers patte nutritionnelle et les traitements d&#39;exerciceIA sur la fonction immunitaire innée 6-9. La méthode illustrée dans ce manuscrit a des implications pratiques dans le domaine de l&#39;immunologie clinique. Le présent procédé exploite la puissance de la cytométrie de flux à base d&#39;images pour mesurer simultanément la phagocytose de particules bactériennes et oxydatif. En utilisant cette approche, on est capable de séparer les granulocytes activés en utilisant des variables fournies par la partie basée sur l&#39;image de l&#39;analyse. Ces sous-ensembles étaient identifiables uniquement après avoir évalué les images cellulaires sur les granulocytes individuels. De plus le temps d&#39;incubation de dosage affecté la transition entre les trois sous-ensembles 10 d&#39;activation. Ainsi, il est vraisemblable que l&#39;utilisation de plusieurs temps d&#39;incubation peut permettre à un procédé pour tester le changement en fonction des granulocytes suite à un traitement expérimental spécifique. Le but de ce manuscrit était de démontrer une méthode d&#39;évaluation de la fonction de granulocytes en utilisant la cytométrie en flux à base d&#39;images pour mesurer simultanément la phagocytose avec oxidative éclater.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacutainers</td>
			<td style="width:125px;">BD Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">WBC Fixative / RBC Lysis solution</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">00-5333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD66b-APC</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone G10F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45-APCeFluor780</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone 2D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">s.aureus bioparticles</td>
			<td style="width:125px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dihydroethidium</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-ethylmalemide</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7AAD</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hematology Analyzer</td>
			<td style="width:125px;">Mindray</td>
			<td style="width:119px;">BC-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-channel pipet</td>
			<td style="width:125px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">ViaFlo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead Bath Incubator</td>
			<td style="width:125px;">LabArmour</td>
			<td style="width:119px;">BeadBath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis FlowSight</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis INSPIRE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IDEAS Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis IDEAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">X-Pierce Piercable Plate Sealer</td>
			<td style="width:125px;">Excel Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X-Pierce</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dell Precision Workstation</td>
			<td style="width:125px;">Dell Computers</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td>Used for IDEAS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Utilisation de la cytométrie de flux à base d&#39;images nous a permis de séparer une population homogène de granulocytes activés en trois sous-ensembles d&#39;activation différents (figure 3). Dans cette méthode, la manière la plus efficace pour résoudre les trois sous-ensembles d&#39;activation est en traçant l&#39;intensité lumineuse de détail pour la phagocytose (S. aureus) vs. oxydatif (DHE) (Figure 3; Figure 4). En outre, l&#39;utilisation de l&#39;assistant co-localisation dans les logiciels IDEAS permettra pour la quantification de la présence de la phagocytose simultanée et oxydatif, qui est un signe caractéristique de granulocytes hautement activés. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> Figure 3. Identification des sous-ensembles de granulocytes activés. Après l&#39;identification des granulocytes avec des marqueurs de surface cellulaire (CD45 + / 66b +), un terrain de fille a été généré avec des détails brillants intensité pour la phagocytose vs lumineuse intensité de détail pour oxydatif. En utilisant cette approche, part des inactifs (violet), faible activité (rouge, A), modérée actif (bleu, B) et (C, jaune) granulocytes élevés actif a été déterminée. Cette technique de déclenchement a également été utilisé pour évaluer l&#39;effet du temps d&#39;incubation de dosage de l&#39;abondance relative des différents sous-ensembles de granulocytes activés. Le pourcentage le plus élevé des granulocytes &quot;High-actif&quot; était présente suite à la 40 minutes d&#39;incubation. Toutes les analyses de fichiers d&#39;images acquises a été achevée en utilisant un logiciel IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> En plus de démontrer la présence de trois sous-ensembles distincts de granulocytes activés, il a été démontré que le temps d&#39;incubation dosage dépend de l&#39;abondance relative de chaque sous-ensemble des granulocytes activés. Plus précisément, le 40 min incubation entraîné le plus grand pourcentage de granulocytes &quot;High-actif&quot;. En incluant au moins trois durées d&#39;incubation dosage, il peut être possible de déterminer la façon dont un traitement clinique donné modifie l&#39;état d&#39;activation des granulocytes temporel. Ce est la première méthode publiée en utilisant la cytométrie de flux à base d&#39;images pour identifier les différents sous-ensembles de granulocytes activés en fonction de mesures simultanées de la phagocytose et la poussée oxydative. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> Figure 4. Images représentatifs de marqueurs cellulaires. Une galerie d&#39;image de cellules classées comme de haute activité (A), modérée active (B), et de faible activité (C) est présenté dans ce chiffre. Bioparticules S.aureus sont en CH03 , oxydatif est en Ch04, 7AAD pour le noyau est en CH05, la dispersion latérale est en CH06, CD66b est enCh11, et CD45 est en C12. En outre, une image de co-fusion localisée de la phagocytose (CH03) vs. oxydatif (Ch04) est affiché. Zones de jaune dans l&#39;image de fusion indiquent que la phagocytose et oxydatif se produisent dans le même espace anatomique en même temps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Basée sur l&#39;image de cytométrie en flux Technique pour évaluer les changements de granulocytes Fonction<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.3K vues.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

Vidéo: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mesure de l&#39;activité calpaïne dans des cellules fixées et de la Vie par cytométrie en flux

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Recherche

Immunologie et infection

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Homme In Vitro</emRépression> comme outil de dépistage pour la reconnaissance d&#39;un Etat précoce de déséquilibre immunitaire

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

L&#39;utilisation de la cytométrie de flux pour évaluer l&#39;état de la chromatine dans les cellules T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Un roman In Vitro de la plaie guérison test afin d’évaluer la Migration cellulaire

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolement et la Culture In Vitro de Macrophages alvéolaires murines et humaines

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

Intégrer la cytométrie en imagerie et transcriptomique profilage pour évaluer l’altération CD1d endocytose traite

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...