Nous tenons à remercier Michaela Jansen au Health Sciences Center Texas Tech University, Lubbock, TX et Mladen Yovchev à l&#39;Université de Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA pour le pcDNA fournissant généreusement 3.1 myc-His (A) et hEF1α promoteur contenant des plasmides . Recherche présentée dans cette publication a été soutenue par l&#39;Eunice Kennedy Shriver Institut national de la santé infantile et le développement humain des Instituts nationaux de la santé sous le numéro d&#39;attribution R01HD037109 (à CCM). Un soutien supplémentaire est de l&#39;Institut Laura W. Bush pour la santé des femmes (à CCM et PNG). Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health. Les auteurs déclarent qu&#39;ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

1. In Silico conception du plasmide et génération des amorces chevauchement NOTE: L&#39;objectif de cette étape est d&#39;assembler séquence nucléotidique complète de la construction et de concevoir les amorces pour être utilisés pour générer des fragments avec des extrémités chevauchantes pour GA clonage. <ol><li> Concevoir une séquence nucléotidique continue de représenter le plasmide final. </li><li> Obtenir ou lister les plasmides réels et des fragments d&#39;ADN qui seront utilisés comme modèles dans PCR. REMARQUE: fragments d&#39;ADN qui ne sont pas facilement disponibles - comme combinaison différente de tags et promoteurs - peuvent être commandés en une seule ou plusieurs fragments d&#39;ADN double brin synthétiques (SDNA). Ces fragments sont disponibles dans le commerce à un coût relativement faible et peut être jusqu&#39;à 2 kb de longueur (voir le tableau des matériaux). </li><li> Diviser la séquence nucléotidique continue de la construction assemblés à l&#39;étape 1.1 en fragments appropriés d&#39;ADN pour la PCR. Confirm que les fragments correspondent plasmides disponibles et fragments SDNA. Évitez fragments d&#39;ADN inférieure à 200 nt. </li><li> Accéder à l&#39;outil de production primaire (voir le tableau de l&#39;équipement). Sélectionnez le menu &quot;Définir les préférences&quot;. Choisir les réglages appropriés en cliquant sur l&#39;onglet &quot;PREFS de changement» dans la fenêtre pop-up &quot;Modifier les paramètres de l&#39;Assemblée Gibson&quot;. REMARQUE: la conception d&#39;amorce peut également être effectuée sans l&#39;utilisation de l&#39;outil de génération d&#39;amorce. Cependant, l&#39;utilisation de l&#39;outil de génération amorce simplifie le processus. </li><li> Commencer à construire la construction en sélectionnant le menu &quot;Build Construct&quot;. Insérer les fragments d&#39;ADN fractionnés dans l&#39;amorce de manière séquentielle de l&#39;outil de génération de 5 &#39;vers l&#39;extrémité 3&#39;. NOTE: Le fragment d&#39;ADN utilisé comme squelette de plasmide peut être commodément divisée en deux morceaux. Dans le produit final de PCR extrémité de ce premier fragment et l&#39;extrémité 3 &#39;de la 5 fin du dernier fragment sont liés ensemble dans une DN continuUn fragment représentant le squelette du vecteur. </li><li> Collez le premier fragment d&#39;ADN représentant l&#39;extrémité 5 &#39;de l&#39;ADN de vecteur dans FASTA (une représentation textuelle de la séquence nucléotidique) dans la fenêtre &quot;Entrée Vector ou Insérer Fragment&quot; pop-up. Nommez le fragment d&#39;ADN. Choisissez la façon appropriée d&#39;obtenir le fragment d&#39;ADN, soit que la PCR, RE Digest ou de synthèse. Cliquez sur l&#39;onglet &quot;CONTINUER&quot;. </li><li> Se il est nécessaire d&#39;ajouter des nucléotides supplémentaires / sites de restriction à la jonction de la construction finale utiliser les espaces &quot;d&#39;écartement FWD ou Rev amorce&quot; prévues dans le &quot;Ajouter un fragment d&#39;insertion à l&#39;Assemblée&quot; fenêtre. Ajouter nucleotides appoint / sites de restriction à un seul des fragments d&#39;ADN et des fragments de ne pas les deux. Cliquez sur l&#39;onglet &quot;DONE&quot;. </li><li> Répéter pour tous les fragments jusqu&#39;à ce que le produit d&#39;assemblage est terminée. Sélectionnez le menu &quot;View amorces» et examiner les séquences d&#39;amorces. </li><li> Répétez l&#39;opération pour toutes les constructions (vecteur backbones et des inserts), ou de fragments d&#39;ADN qui sont différents. </li></ol> 2. Amplification des fragments d&#39;ADN par PCR en utilisant Hot Start Relecture ADN polymérase (2x Master Mix) NOTE: L&#39;objectif de cette étape est d&#39;obtenir suffisamment d&#39;ADN pour la réaction d&#39;assemblage par PCR. <ol><li> Achetez les amorces PCR conçues à l&#39;étape précédente en tant que produits dessalée et à la plus petite échelle possible. Diluer à leur 10 pM dans de l&#39;eau ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,9, EDTA 1 mM). </li><li> Achetez des fragments d&#39;ADN qui ne sont pas facilement disponibles sous forme de fragments SDNA. </li><li> Diluer tous les fragments d&#39;ADN, y compris les fragments SDNA qui seront utilisés comme modèles pour les PCR à 1 ng / ul dans l&#39;eau. </li><li> Assembler les réactions de PCR à la température ambiante. En bref, utiliser 2,5 pi (de 10 uM solution mère) du chaque amorce respective de la paire d&#39;amorces, une pi (de 1 ng ul solution / d&#39;achat d&#39;actions) du fragment d&#39;ADN matrice, 25 μl d&#39;eau chaude l&#39;ADN polymérase début de relecture (ADN pol; 2x mélange maître; voir le tableau des matériaux) et 19 pi d&#39;eau. Mélanger le tube en tapotant doucement et de recueillir les gouttelettes de liquide par une brève centrifugation. </li><li> Amplifier simultanément dans des tubes séparés des fragments d&#39;ADN de taille similaire selon les recommandations pour la pol de l&#39;ADN. Effectuer 25 à 28 cycles de PCR ou de déterminer le nombre de cycles qui produisent le rendement en ADN suffisante. </li><li> Run 10% du volume de réaction PCR (5 ul) sur une électrophorèse sur gel d&#39;agarose coloré au niveau du bromure d&#39;éthidium (0,2 ug / ml de concentration finale). Assurez-vous que d&#39;une seule bande d&#39;ADN représentant le produit de la PCR est visible. Déterminer la taille et la quantité relative des fragments d&#39;ADN en utilisant des normes d&#39;ADN de poids moléculaire. Si nécessaire, répéter la PCR pour obtenir une quantité suffisante de fragments d&#39;ADN. </li></ol> 3. Dpnl digestion des produits de PCR NOTE: L&#39;objectif de cette étape est de Diger plasmide ADN résiduel modèle de RAP dans la section 2. Dpnl digère l&#39;ADN de plasmide que si elle est méthylée, comme cela se produit à l&#39;ADN plasmidique barrage + cultivées dans des souches bactériennes. Par conséquent, ne pas traiter avec Dpnl si l&#39;ADN plasmidique sera utilisé comme un fragment d&#39;ADN dans la réaction GA. <ol><li> Ajouter 2 ul d&#39;enzyme de restriction Dpnl à 45 ul des produits de PCR obtenus dans la Section 2. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Procéder à l&#39;article 4 ou gel à -20 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> 4. purification et la concentration des fragments d&#39;ADN au cours de purification d&#39;ADN Magnetic Beads NOTE: L&#39;objectif de cette étape est de purifier et de concentrer les produits de PCR obtenus dans les sections 2 et 3. D&#39;autres procédés de purification de PCR peuvent être utilisées aussi bien. <ol><li> Equilibrer les billes magnétiques de purification de l&#39;ADN à la température ambiante. Remettre en suspension les billes par vortex brève. </li><li> Transférez les PCR wi pré-digérée Dpnl à un des tubes de 1,5 ml et ajouter 81 ul de billes magnétiques de purification de l&#39;ADN dans chaque tube. Incuber le mélange à température ambiante pendant 10 min. </li><li> Placer les tubes sur le collecteur magnétique pendant environ 2 min. Jeter le liquide clair à l&#39;aide d&#39;une pipette. Laver deux fois avec 200 ul d&#39;éthanol à 80% pendant 30 secondes. </li><li> Laisser les boulettes de sécher. Gardez le couvercle des tubes ouverte, avec les tubes positionnés sur le collecteur magnétique. </li><li> Remettre en suspension les billes séchées dans 10 pl de 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0. Incuber à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger brièvement pour collecter le liquide au fond des tubes. </li><li> Placer les tubes sur le collecteur magnétique pendant 2 min. Retirer de 8,5 à 10 pi de la solution claire et le placer dans un nouveau tube pré-étiquetés. Déterminer la concentration des fragments d&#39;ADN par spectroscopie UV (voir le tableau de l&#39;équipement). </li></ol> 5. Réaction Assemblée clonage et la transformation des produits en E. coli &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTE: L&#39;objectif de cette étape est de calculer rapport 3: 1 de l&#39;insert: vecteur et effectuer la réaction d&#39;assemblage. <ol><li> Utilisation d&#39;au moins 100 ng de fragment d&#39;ADN représentant le squelette du vecteur ou fragment d&#39;ADN portant le marqueur sélectif. Calculer l&#39;excès molaire de 3 fois pour les fragments d&#39;ADN qui seront utilisés comme inserts. </li><li> Convertir la molaire en excès en ng nécessaire de chaque insert particulier. REMARQUE: Un moyen pratique pour faire les calculs est d&#39;utiliser une application basée sur le Web (voir le tableau de l&#39;équipement). </li><li> Mélanger des quantités calculées de fragments d&#39;ADN dans un tube PCR, ajuster le volume à 10 pi. Ajouter 10 pi de mélange maître GA (2x, voir le tableau des matériaux). Incuber la réaction à 50 ° C pendant 1 heure pour l&#39;assemblage de quatre à six fragments ou 15 min pour l&#39;assemblage de deux à trois fragments dans un cycleur thermique de PCR. </li><li> Procéder à la transformation du produit d&#39;assemblage dans E. compétente coli ou geler les produits à -20° C, jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li><li> Suivez la procédure de transformation qui accompagne l&#39;électro cellules compétentes ou chimique. Habituellement, en utilisant 2 ul de la réaction d&#39;assemblage par réaction de transformation. </li><li> Après la transformation est complète, étaler les cellules transformées sur des plaques agar supplémenté avec l&#39;antibiotique sélectif approprié. </li></ol> 6. plasmide isolement, digestion enzymatique et séquençage NOTE: L&#39;objectif de cette étape est d&#39;isoler l&#39;ADN plasmidique à partir de E. coli, puis de vérifier le produit d&#39;assemblage par digestion de restriction et séquençage. <ol><li> Propager plusieurs colonies simples pour minipreps et l&#39;isolement de plasmide. Culture liquide LB nuit utilisation de 2-5 complétée par antibiotique approprié. Isoler les plasmides correspondant en suivant la procédure qui est décrite dans le mini kit de préparation qui est utilisé. </li><li> Déterminer la quantité et la concentration des plasmides obtenus en utilisant spectrophotomètre. </li><li> Effectuer restriction digestion avec une ou plusieurs endonucléases de restriction à ~ 0,5 pg des plasmides purifiés. Utilisation d&#39;enzymes de restriction qui fournissent motif distinct de digestion caractéristique pour les constructions d&#39;ADN. </li><li> Confirmer clonage d&#39;ADN succès par séquençage d&#39;ADN en utilisant des amorces spécifiques ou standard. Analyser les données de séquençage pour la précision. </li></ol>

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Open Access publication and production fees were supplied by New England BioLabs Inc.

L&#39;utilisation réussie de clonage GA doit toujours être précédée d&#39;une conception soignée de la construction complète (figures 2 et 3). Vérification minutieuse des séquences d&#39;amorces conçus par l&#39;outil de génération amorce est également fortement recommandé. Amorces pour GA peuvent être produits sans l&#39;utilisation de l&#39;outil de génération d&#39;amorce. Cependant, l&#39;utilisation de l&#39;outil est fortement recommandé, car il simplifie le processus. Généralement, l&#39;amorce pour le clonage GA doit avoir deux séquences fonctionnellement différents. La première séquence est un fragment d&#39;ADN spécifique, et permet l&#39;amplification du fragment par PCR. La seconde séquence chevauche le fragment adjacent, ce qui est nécessaire pour l&#39;assemblage GA. Une séquence-spécifique fragment d&#39;ADN typique serait de 18 à 22 nt de longueur. Des séquences spécifiques d&#39;ADN utilisées pour amplifier un fragment du même ADN doivent avoir des températures de fusion similaires et le contenu GC. Séquence de chevauchement doit être au moins de 15nt de long avec une température de fusion d&#39;au moins 48 ° C. Le rassemblement de plus de quatre fragments d&#39;ADN nécessitera la séquence de chevauchement d&#39;au moins 20 nt. Chevauche plus permettront spécificité accrue du recuit résultant en des fragments d&#39;ADN plus correctement montés. Il est recommandé d&#39;éviter des séquences qui sont biaisées dans leur GC ou AT contenu dans le développement de séquences qui se chevauchent, parce séquences asymétriques pourraient compromettre l&#39;assemblage d&#39;ADN appropriée. Nous suggérons également d&#39;utiliser comme contrôle négatif, qui ne devrait pas produire des colonies bactériennes résistantes aux médicaments, juste le fragment d&#39;ADN correspondant au squelette du vecteur dans une réaction GA. En variante, l&#39;un des fragments d&#39;ADN comprenant les &quot;inserts&quot; peuvent être omis de la réaction GA, ce qui devrait également se traduire par pas de colonies bactériennes résistantes aux médicaments. La raison pour laquelle aucune colonie ne se développent sera l&#39;absence de chevauchement des extrémités des fragments d&#39;ADN adjacents, ce qui rend l&#39;assemblage d&#39;un complplasmide ete. Dans le protocole décrit des séquences chevauchantes de 25 nt pour générer les ensembles d&#39;amorces ont été utilisées, en raison du nombre de fragments d&#39;ADN utilisées (figure 3). La recommandation du site de l&#39;outil de production primaire (voir le tableau de l&#39;équipement) est d&#39;utiliser au moins 20 séquences chevauchantes nt à assembler 4-6 fragments d&#39;ADN. En outre, plus le chevauchement séquence assure que la complémentation appropriée des brins d&#39;ADN (voir la figure 1) augmenter le nombre de produits assemblés avec précision. Actuellement, plusieurs systèmes pour le clonage sont disponibles sans soudure. Toutefois, certains de ces systèmes utilisent encore des enzymes de restriction (c.-à Golden Gate clonage 18). D&#39;autres utilisent des mélanges exclusifs d&#39;enzymes à base de virus de la vaccine et l&#39;ADN polymerase de la protéine de liaison d&#39;ADN simple brin à partir de la même source 19 biologique. Les deux systèmes sont limités par rapport à l&#39;AG par le shorlongueur ter des séquences chevauchantes. Parce que des séquences plus courtes qui se chevauchent peuvent ne pas fournir une spécificité suffisante pour l&#39;étape de recuit de fragments d&#39;ADN adjacents, ce qui rend le montage correct de plus de 23 fragments d&#39;ADN problématiques. Ces lacunes ne sont pas présents dans le système GA. La taille des fragments d&#39;ADN à amplifier doit être également considérée afin de ne pas dépasser la taille de manière fiable amplifiable par PCR (ce est à dire, à moins de 8 kpb de longueur). Même avec les améliorations de la fonction de polymérases d&#39;ADN dans des 10 dernières années, de grands fragments d&#39;ADN seront amplifiés avec moins d&#39;efficacité et de précision. Si nécessaire, des fragments d&#39;ADN plus grands peuvent être obtenus à partir d&#39;autres sources de PCR, par exemple, par l&#39;isolement du plasmide et digestion d&#39;ADN appropriée avec des enzymes de restriction. Plus précisément, pour le protocole décrit dans le manuscrit actuel, notre rationnel d&#39;utiliser la PCR était basée sur la taille des fragments d&#39;ADN disponibles, qui étaient toutes inférieures à5 kpb. Se il existe plus d&#39;un produit de PCR identifiée par électrophorèse sur gel d&#39;agarose, la purification sur gel du fragment de taille souhaitable est recommandé d&#39;utiliser l&#39;une des techniques de biologie moléculaire ou des kits disponibles appropriées. Dans le protocole actuel d&#39;une ADN polymérase thermostable est utilisé (voir le tableau des matériaux). Toutefois, tout ADN polymérase fournir de haute fidélité et le rendement sera adapté pour être utilisé avec ce protocole. Si haute fidélité ADN polymérases différent de celui décrit dans le protocole sont disponibles, utiliser les conditions fixées comme décrit dans les manuels respectifs. Dans le protocole actuel, E. chimiquement compétente cellules de E. coli sont utilisés qui sont fournis avec le kit GA. E. Sinon, chimiquement ou électro compétente les souches E. coli DH5a ou tels que DH10B peuvent être utilisés. L&#39;assemblée clonage master mix 2x est facile à utiliser avec un minimum de mains sur le temps. Cependant, pipetage précis est nécessaire en raison des faibles volumes neEDED à être mélangés ensemble. Une bonne technique de biologie moléculaire doit être exercé en tout temps ainsi. Le clonage GA offre des possibilités illimitées pour une construction de fragments d&#39;ADN, des plasmides et des vecteurs, qui sont plus longues que 3 kpb de taille. En outre, il a un impact plus large dans le domaine de la biologie synthétique, car il permet la synthèse et l&#39;assemblage de, par exemple, un ensemble bactérienne (Mycoplasma mycoides) génome ou une levure (Saccharomyces cerevisiae) chromosome 20,21. La technique est également applicable aux clonage conventionnel doit générer des constructions sans soudure. En conclusion, le clonage GA offre de remplacement rapide, fiable et flexible pour la procédure de clonage d&#39;ADN classique.

Les procédures de clonage d&#39;ADN classiques reposent sur l&#39;utilisation d&#39;enzymes de restriction pour cliver l&#39;ADN et l&#39;ADN ligase pour joindre les fragments d&#39;ADN ensemble. Génération de constructions d&#39;expression personnalisées contenant différents fragments d&#39;ADN est un procédé séquentiel qui comprend le clivage de l&#39;ADN avec l&#39;un et / ou plusieurs endonucléases de restriction et l&#39;insertion ultérieure des fragments d&#39;ADN par ligature. L&#39;inconvénient majeur de cette procédure est que les enzymes de restriction appropriées pour l&#39;un des fragments d&#39;ADN peuvent être difficiles à identifier (ce est à dire, pourrait avoir plusieurs sites de clivage) rendu succès le clonage d&#39;ADN de la protéine pleine longueur d&#39;intérêt impossible. Par conséquent, la génération d&#39;expression personnalisée construit sous la régulation transcriptionnelle des promoteurs spécifiques de type cellulaires efficace avec protéines-tags personnalisés nécessite une conception très prudent. Ce est aussi une technique de temps et intensité de travail. Récemment, plusieurs rapports ont décrit des méthodes pour assembler multipLe différents fragments d&#39;ADN synthétique en une séquence continue à la fois dans les réactions soit à un ou à deux étapes sans l&#39;utilisation d&#39;enzymes de restriction 3.1. La réaction de clonage en une étape (à l&#39;exclusion toutes les étapes de préparation), dépend de l&#39;utilisation d&#39;un mélange d&#39;exonucléase de l&#39;ADN, de l&#39;ADN polymerase, l&#39;ADN ligase de 2,3 et les extrémités de fragments d&#39;ADN (Figure 1). Comme il n&#39;y a pas d&#39;utilisation d&#39;enzymes de restriction, les fragments d&#39;ADN de ne importe quelle taille et la composition de la séquence (à l&#39;exclusion des séquences hautement répétitives) peuvent être fusionnés ensemble dans une construction sans couture. Récemment, un kit commercial (d&#39;assemblage Gibson; GA) pour les réactions de clonage en une seule étape est devenu disponible. Ce kit permet un montage rapide et efficace et le coût de tous les fragments d&#39;ADN dans un vecteur unique avec les promoteurs et les étiquettes personnalisées de protéines. Les vecteurs d&#39;expression plasmidiques disponibles largement utilisés pour exprimer des protéines exogènes dans les modèles de culture de cellules de mammifères sont souvent sous la reg transcriptionnelleulation viral du cytomegalovirus (CMV) ou le virus 40 SV40 (Simian promoteurs). Ces promoteurs viraux fournissent robuste expression transitoire des protéines exogènes dans la majorité des modèles fondés sur la culture de cellules de mammifères. Toutefois, la génération de lignées cellulaires exprimant de manière stable les protéines exogènes est souvent infructueux à cause de silençage transcriptionnel du CMV ou des promoteurs de SV40 de 4,5 au cours de la procédure d&#39;établissement. En outre, les viral de SV40 et les promoteurs de CMV ne favorisent pas suffisamment l&#39;expression de protéines exogènes dans des cellules de la lignée lymphoïde ou des cellules souches embryonnaires 6,7. La solution à la limitation inhérente de promoteurs viraux est d&#39;utiliser des promoteurs forts non viraux constitutifs 8-10. Un fort bien caractérisé promoteur non viral d&#39;origine humaine constitutif est le promoteur du facteur d&#39;élongation 1α (hEF1α) (hEF1α est impliqué dans la catalyse de l&#39;association de GTP-dépendante de l&#39;aminoacyl-ARNt aux ribosomes 11). Cependant,des vecteurs d&#39;expression contenant le promoteur hEF1α ne sont pas aussi largement que le promoteur viral contenant des plasmides, en particulier ceux contenant également 3 × FLAG à l&#39;extrémité amino-terminale de la protéine d&#39;intérêt. La protéine de facteur de stimulation de clivage de 64 000 MW (PNC-64) est engagé dans l&#39;extrémité 3 &#39;de la plupart des ARNm traitement, y compris des histones 12,13 ARNm de réplication dépendant 14,15. CstF-64 est exprimée dans tous les tissus somatiques 12. Son motif de reconnaissance d&#39;ARN se lie à GU riches en séquences d&#39;ARN sur transcrits naissants en aval du site de clivage et une polyadénylation 16. Cette liaison de CstF-64 au pré-ARNm efficace favorise le clivage endonucléolytique de la transcription naissante. Ici, un protocole est décrit qui utilise l&#39;amplification par PCR de fragments d&#39;ADN, un kit de clonage Gibson ensemble (qui comprend des cellules bactériennes chimiquement compétentes) pour produire des vecteurs de mesure m 3xFLAG marquésouse CstF-64 ou un mutant CstF-64 à leur extrémité amino-terminale sous l&#39;expression d&#39;une hEF1α promoteur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="553">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:196px;">Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA)</td>
			<td style="width:71px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">DNA purification magnetic beads</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification system</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Plasmid Isolation Mini Kit</td>
			<td style="width:71px;">Omega Bio-Tek Inc</td>
			<td style="width:119px;">D6942-01</td>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">Gibson Assembly Cloning Kit</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E5510S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DNA polymerase&#160;</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">M0494S</td>
			<td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">DpnI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NheI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3131S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">NotI</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:196px;">HindIII</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R3104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>NanoDrop device</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">EditSeq</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">SeqBuilder</td>
			<td style="width:71px;">DNASTAR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of Lasergene Core Suite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Word</td>
			<td style="width:71px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Part of&#160; Microsoft Office</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBuilder</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>primer generation tool: http://nebuilder.neb.com</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">NEBioCalculator</td>
			<td style="width:71px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of plasmid vectors expressing flag-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1&#945; promoter using gibson assembly

Ensemble Gibson (GA) clonage offre une alternative rapide, fiable et souple des procédés de clonage d&#39;ADN classiques. Nous avons utilisé pour créer GA plasmides personnalisés pour l&#39;expression de gènes exogènes dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs). L&#39;expression des gènes exogènes sous le contrôle de la SV40 ou les promoteurs de cytomégalovirus humain diminue rapidement après transfection dans mESCs. Un remède à cette expression diminuée est d&#39;utiliser le promoteur humain facteur d&#39;élongation 1-alpha (hEF1α) pour diriger l&#39;expression du gène. vecteurs de plasmide contenant hEF1α ne sont pas aussi largement disponible que SV40 ou des plasmides contenant le CMV, en particulier ceux contenant également 3xFLAG-tags N-terminaux. Le protocole décrit ici est une méthode rapide pour créer des plasmides exprimant étiquetée FLAG CstF-64 et CstF-64 mutant en vertu du règlement expressional du promoteur hEF1α. GA utilise un mélange d&#39;exonucléase d&#39;ADN, l&#39;ADN polymérase et d&#39;ADN ligase de faire le clonage du chevauchement des extrémités des fragments d&#39;ADN possibles.Basé sur les ADN de modèle dont nous disposions, nous avons conçu nos constructions pour être assemblés en une seule séquence. Notre conception utilisé quatre fragments d&#39;ADN: pcDNA 3.1 squelette du vecteur, hEF1α promoteur partie 1, hEF1α promoteur partie 2 (qui contenait 3xFLAG-tag acheté comme un fragment d&#39;ADN double brin synthétique), et soit CstF-64 ou spécifique CstF-64 mutant. Les séquences de ces fragments ont été chargés dans un outil de génération primaire pour concevoir des amorces de PCR appropriées pour générer les fragments d&#39;ADN. Après la PCR, les fragments d&#39;ADN ont été mélangés avec le vecteur contenant le marqueur de sélection et la réaction de clonage GA a été assemblé. Les plasmides provenant de colonies bactériennes transformées ont été isolées individuelles. Écran initial des plasmides a été réalisée par digestion de restriction, suivie d&#39;un séquençage. En conclusion, GA a permis de créer des plasmides personnalisées pour l&#39;expression des gènes dans les cinq jours, y compris la construction d&#39;écrans et de la vérification.

Un flux de travail du protocole qui a été suivie est illustrée à la figure 2A. Nous voulions cloner CstF-64 et mutantes CstF-64 protéines fusionnées à 3xFLAG-tag en vertu du règlement expressional du promoteur hEF1α (figure 2B et la figure 3). Un hEF1α de plasmide contenant suivie par 3xFLAG-tag ne était pas disponible pour nous. Cependant, les plasmides suivants étaient disponibles: pcDNA 3.1 myc-His (A; un don généreux de Michaela Jansen), hEF1α contenant le plasmide (un don généreux de Mladen Yovchev) et de la souris CstF-64 plasmides 12 (Figure 3). La séquence entière pour la construction (s) a été assemblé en utilisant les applications nucléotides et l&#39;édition de texte (Figure 3; voir le tableau de l&#39;équipement). Par la suite, la séquence (s) a été divisée en quatre morceaux commodes (Figure 2B, les blocs rouges et la figure 3) correspondant aux ADN plasmidiques disponibles. Amplification primers ont été conçus en utilisant l&#39;outil de génération amorce (voir le tableau de l&#39;équipement) avec des contraintes de 4-6 fragments avec un chevauchement minimal de 25 nt, mis en place dans la fenêtre pop-up &quot;Modifier les paramètres de l&#39;Assemblée Gibson&quot;. Les sites de restriction Nhel et Notl ont été inclus dans la conception d&#39;amorce dans le but d&#39;identifier les plasmides correctement assemblés. Site Nhel est situé dans la séquence entre amorces pcDNA 3.1 et l&#39;extrémité 5 &#39;du promoteur hEF1α. Le site Notl est situé après le codon d&#39;arrêt (UGA) de CstF-64 et pcDNA 3.1 squelette du vecteur. Lors de la digestion simultanée avec les deux enzymes fragment d&#39;ADN consistant en hEF1α promoteur, 3xFLAG et CstF-64 ou mutant CstF-64 sera publié (voir ci-dessous et la figure 2B). Amorces ont été commandés en la plus petite échelle possible et dessalés. La deuxième partie du promoteur hEF1α fragment d&#39;ADN contenant 3xFLAG-tag (490 pb, figure 2B, figure 3) a été acheté comme un fragment SDNA seule (see Table des matières). Les fragments d&#39;ADN utilisés dans la réaction d&#39;assemblage ont été amplifiés en utilisant l&#39;ADN pol (voir le tableau des matériaux). fragments d&#39;ADN de hEF1α promoteur partie 1, hEF1α promoteur partie 2, pleine longueur et mutant CstF-64 ont été amplifiés simultanément dans un des tubes séparés pendant 28 cycles (figure 4A), suivant les recommandations du fournisseur de la pol de l&#39;ADN (voir le tableau des matériaux , pour chaque dénaturation du cycle était de 7 sec à 98 ° C, recuit 45 sec à 55 ° C, l&#39;allongement de 90 sec à 72 ° C). Initialement, le squelette pcDNA 3.1 a été amplifié pendant 22 cycles (en utilisant les mêmes conditions que ci-dessus à l&#39;exception du temps d&#39;élongation, qui a été fixé à 3 min à 72 ° C). Cependant, le rendement d&#39;ADN résultant était pas suffisant pour être utilisé dans une réaction d&#39;assemblage (figure 4A). Par conséquent, une amplification supplémentaire a été effectuée pour obtenir suffisamment d&#39;ADN. Obtenir des produits de PCRed partir d&#39;une matrice plasmidique doit être digéré avec l&#39;enzyme de restriction Dpnl pour éliminer l&#39;ADN plasmidique, qui autrement contaminer les produits de réaction résultant de l&#39;assemblage et qui va produire des colonies bactériennes résistantes aux médicaments faux positifs. Par conséquent, les produits de PCR ont été digérés par enzyme de restriction Dpnl, qui clive l&#39;ADN plasmidique méthylé et hémi-méthylé isolé de barrage + E. souches coli. Les produits de PCR obtenus en utilisant des fragments d&#39;ADN synthétiques, en tant que modèles ne ont pas besoin d&#39;être digéré avec Dpnl depuis ADN synthétisé par voie chimique ne contient pas de bases méthylées ou hémi-méthylé. Les fragments d&#39;ADN ont été purifiés et concentrés sur des billes magnétiques de purification de l&#39;ADN (voir le tableau des matériaux) comme décrit dans l&#39;étape de protocole 4. Les PCR pour le pcDNA 3.1 squelette du vecteur ont été combinés ensemble et la quantité de billes magnétiques de purification d&#39;ADN utilisée a été ajustée en conséquence. Le rendement en ADN a été déterminéeà l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre (tableau 1 et le tableau de l&#39;équipement). réactions de montage pour CstF-64 et mutantes CstF-64 constructions ont été assemblés sur la glace (Tableau 1). Un excès molaire de 3 fois des fragments d&#39;ADN considérées comme &quot;inserts&quot; a été utilisé (tableau 1, figure 3). Le volume final des mélanges de fragments d&#39;ADN a été ajusté à 10 ul avec de l&#39;eau et 10 ul de mélange maître d&#39;assemblage (2x) a été ajouté. Les réactions ont été mélangés et incubés à 50 ° C pendant 1 heure. Réaction du contrôle positif a également été assemblé selon la recommandation du manuel de kit GA et incubé simultanément avec les CstF-64 et mutantes CstF-64 réactions. Tel que recommandé dans le protocole, 2 pl de la chacune des réactions d&#39;assemblage ont été transformées dans le E. chimiquement compétente coli fourni avec le kit de clonage Assemblée (voir le tableau des matériaux). La transformation a été effectuée comme décrit dans le kitmanuel. Les clones positifs ont été sélectionnés sur des plaques de gélose à l&#39;ampicilline / LB. 6 colonies par chaque réaction d&#39;assemblage ont été choisis au hasard pour se propager. Les ADN plasmidiques ont été isolés en utilisant un mini kit d&#39;isolement de plasmide (voir le tableau des matériaux). Dans silico digestion des produits d&#39;assemblage avec les enzymes de restriction Nhel et Notl ont donné lieu à deux fragments avec des tailles de 4590 pb, 3032 pb pour CstF-64 et 4590 pb, 2711 bp pour CstF-64 mutant (figure 2B et la figure 4B). La digestion avec les enzymes de restriction HindIII et Notl ont donné lieu à trois fragments ayant les tailles suivantes: 5872 pb, 1005 pb et 745 pb (PNC-64) et 5872 pb, 1005 pb et 424 pb (mutant CstF-64, Figure 2B et Figure 4C). En effet, la digestion des plasmides isolés affiche les motifs caractéristiques attendues (figure 4B, C). On notera que le fragment d&#39;ADN de 424 pb produit par digestion avec HindIII et Notl du CstF-64 mutantplasmides sur la figure 4C est faiblement colorés en raison de sa petite taille. 2 sur les 6 plasmides isolés ont été envoyés pour le séquençage. Nous avons séquencé le promoteur hEF1α et CstF-64 ou mutant CstF-64 parties des constructions afin de vérifier qu&#39;il n&#39;y a pas des suppressions, des insertions ou des substitutions. Nous recommandons vivement le séquençage des constructions d&#39;ADN résultant de cette ou tout protocole basé sur la PCR. Le séquençage a montré que une séquence de chaque plasmide contenait la séquence attendue dans la zone de hEF1α, 3xFLAG-tag et CstF-64 ou un mutant CstF-64. Chacun des autres plasmides avaient un point de mutation introduite lors de l&#39;amplification du fragment d&#39;ADN correspondant. Expression du plasmide contenant CstF-64 dans les cellules souches embryonnaires de souris, a produit quantité abondante de protéine exogène comparable à l&#39;expression de type sauvage 17. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" width="450" /> Figure 1. Représentation schématique du mécanisme Assemblée Gibson. Les fragments d&#39;ADN avec des extrémités chevauchantes ont été assemblées de manière isotherme dans une seule séquence continue. Le chevauchement premières extrémités sont mâchés retour par 5 &#39;exonucléase, qui est la chaleur progressivement inactivé. Par conséquent, différents fragments d&#39;ADN avec des extrémités qui se chevauchent se hybrider de manière isotherme. ADN polymérase sera de combler les lacunes et d&#39;ADN ligase thermostable ligats les entailles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig1highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" width="650" /> Figure 2. (A) Diagramme de flux du protocole décrit pour le clonage assemblage. (B) Représentation du plasmide, pGA-CstF-64 généré en utilisant un kit GA rouges - fragments d&#39;ADN utilisés dans la réaction d&#39;assemblage:. PcDNA3,1; hEF1α promoteur partie 1 (hEF1a - 1); hEF1α promoteur partie 2 (hEF1a - 2) ordonné comme un ADN synthétique; souris CstF-64 (mCstF-64). Bleu - cadres de lecture ouverts. Violet - promoteurs viraux et non viraux. Vertes -. Régions de clivage et de polyadénylation <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig2highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" width="650" /> Figure 3. Conception de l&#39;assemblage Gibson CstF-64 plasmide. Boîtes noires représentent les fragments d&#39;ADN qui étaient disponibles pour concevoir un seul ensemble Gibson CstF-64 dans la séquence de silico. Par la suite, la séquence est divisée en quatre morceaux d&#39;ADN qui ont été amplifiés par PCR. Notez qu&#39;en raison de la petite taille de la 3xFLAG-tag la séquence a été conçu comme un SDNA avec le pr hEF1α<html> omoter partie 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52235/52235fig3highres.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52235/52235fig4highres.jpg" width="650" /> Figure 4. PCR des fragments d&#39;ADN utilisés dans les réactions de clonage et représentant la digestion d&#39;enzyme de restriction des plasmides obtenus (A) PCR représentatifs utilisant démarrage à chaud haute fidélité 2x master mix pour les fragments d&#39;ADN utilisés dans les réactions d&#39;assemblage:. (B) représentant plasmides de hEF1α, pleine longueur CstF-64, pcDNA 3.1 construction (PGA-CstF-64) et hEF1α, mutant CstF-64, pcDNA 3.1 construction (PGA-mutCstF-64) digéré avec Nhel et Notl. (C) les mêmes plasmides comme dans B digérés par les enzymes HindIII et Notl.&quot;_blank&quot;&gt; Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nom de fragments d&#39;ADN </td><td> La taille attendue (pb) </td><td> CONCN. (Ng / ul) </td><td> Dilué à (ng / ul) </td><td> ul utilisé dans CstF GA-64 à partir dilué </td><td> ul utilisé dans mutCstF GA-64, à partir dilué </td><td> Rapport molaire (ins: VEC) </td></tr><tr><td> pcDNA 3.1 (vecteur) </td><td> 4618 </td><td> 158 </td><td> non dilué </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td></td></tr><tr><td> hEF1_ promoteur partie 1 </td><td> 825 </td><td> 213 </td><td> 75 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ promoteur partie 2 pour CstF-64 </td><td> 516 </td><td> 229 </td><td> 50 </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> CstF-64 </td><td> 1796 </td><td> 161 </td><td> non dilué </td><td> 1 </td><td></td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> hEF1_ promoteur partie 2 pour mutant CstF-64 </td><td> 516 </td><td> 199 </td><td> 50 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr><tr><td> mutant CstF-64 </td><td> 1448 </td><td> 201 </td><td> 171 </td><td></td><td> 1 </td><td> 3: 1 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Rendement de fragments d&#39;ADN après concentration sur des billes magnétiques, la dilution et mettre en place des réactions d&#39;assemblage.

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Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Génération de vecteurs plasmidiques exprimant des protéines de marquage Flag En vertu du règlement de l&#39;allongement Human Factor-1α promoteur Utilisation Assemblée Gibson

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

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Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

36.7K vues.  Texas Tech University Health Sciences Center. Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning. 

Vidéo: Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

Plasmid DNA purification from E. coli is a core technique for molecular cloning. Small scale purification (miniprep) from less than 5 ml of bacterial culture is a quick way for clone verification or DNA isolation, followed by further enzymatic reactions (polymerase chain reaction and restriction enzyme digestion). Here, we video-recorded the general procedures of miniprep through the QIAGEN's QIAprep 8 Miniprep Kit, aiming to introducing this highly efficient technique to the general beginners for molecular biology techniques. The whole procedure is based on alkaline lysis of E. coli cells followed by adsorption of DNA onto silica in the presence of high salt. It consists of three steps: 1) preparation and clearing of a bacterial lysate, 2) adsorption of DNA onto the QIAprep membrane, 3) washing and elution of plasmid DNA. All steps are performed without the use of phenol, chloroform, CsCl, ethidium bromide, and without alcohol precipitation. It usually takes less than 2 hours to finish the entire procedure.

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Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method is a basic technique of molecular biology. It consists of inserting a foreign ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

Culture primaire et l&#39;électroporation plasmidique de l&#39;Organe de Corti murin.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Génération de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

Méthodes à découvrir Alternative Utilisation de promoteur et la régulation transcriptionnelle de Murine BCRP1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed specifically for this protocol and allows for the quantification of terminator efficiency. As a proof of concept, six terminators were bioinformatically identified in the mycobacteriophage Bernal13. Once identified, terminators were then made as oligonucleotides with the appropriate sticky ends and annealed together. Using Golden Gate Assembly (GGA), terminators were then cloned into pGR-Blue. Under visible light, false positive colonies appear blue and positively transformed colonies are white/yellow. After induction of an arabinose inducible promoter (pBad) with arabinose, colony strength can be determined by measuring the ratio of green fluorescent protein (GFP) produced to red fluorescent protein (RFP) produced. With pGR-Blue, the protocol can be completed in as little as three days and is ideal in an educational setting. Additionally, results show that this protocol is useful as a means for understanding in silico predictions of terminator efficiency related to the regulation of transcription.

This protocol utilizes Golden Gate Assembly and the plasmid pGR-blue to rapidly quantify the strength of terminators found in silico.

Vérification rapide de Terminators Utilisation du pgr-Blue plasmidique et Golden Assemblée Porte

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the original plasmid recovery method and introduces restriction enzyme digestion to ease DNA ligation reactions (required for chimera assembly). For this protocol, users clone wildtype genes into the same plasmid (pUC18 or pUC19). After the in silico selection of amino acid sequence regions where chimeras should be assembled, users obtain all the synonym DNA sequences that encode them. Ad hoc Perl scripts enable users to determine all synonym DNA sequences. After this step, another Perl script searches for restriction enzyme sites on all synonym DNA sequences. This in silico analysis is also performed using the ampicillin resistance gene (ampR) found on pUC18/19 plasmids. Users design oligonucleotides inside synonym regions to disrupt wildtype and ampR genes by PCR. After obtaining and purifying complementary DNA fragments, restriction enzyme digestion is accomplished. Chimera assembly is achieved by ligating appropriate complementary DNA fragments. pUC18/19 vectors are selected for CAPRRESI because they offer technical advantages, such as small size (2,686 base pairs), high copy number, advantageous sequencing reaction features, and commercial availability. The usage of restriction enzymes for chimera assembly eliminates the need for DNA polymerases yielding blunt-ended products. CAPRRESI is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI), a protocol based on the insertion of restriction enzyme sites into synonym DNA sequences and functional plasmid recovery. This protocol is a fast and low-cost method for fusing protein-coding genes.

CAPRRESI: Assemblage de la chimère par insertion de plasmides et restriction Enzyme Site Insertion

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in understanding the gene regulation and spatiotemporal expression patterns of target genes. On the other hand, it is also critical to establish promoter evaluation tools and genetic transformation techniques that are fast, efficient, and reproducible. In this study, we investigated the spatiotemporal expression pattern of the rhizobial symbiosis-specific nodule inception (NIN) promoter of Phaseolus vulgaris in the transgenic hairy roots. Using plant genome databases and analysis tools we identified, isolated, and cloned the P. vulgaris NIN promoter in a transcriptional fusion to the chimeric reporter &#946;-glucuronidase (GUS) GUS-enhanced::GFP. Further, this protocol describes a rapid and versatile system of genetic transformation in the P. vulgaris using Agrobacterium rhizogenes induced hairy roots. This system generates &#8805;2 cm hairy roots at 10 to 12 days after transformation. Next, we assessed the spatiotemporal expression of NIN promoter in Rhizobium inoculated hairy roots at periodic intervals of post-inoculation. Our results depicted by GUS activity show that the NIN promoter was active during the process of nodulation. Together, the present protocol demonstrates how to identify, isolate, clone, and characterize a plant promoter in the common bean hairy roots. Moreover, this protocol is easy to use in non-specialized laboratories.

Promoter expression analyses are crucial to improving the understanding of gene regulation and the spatiotemporal expression of target genes. Herein we present a protocol to identify, isolate, and clone a plant promoter. Further, we describe the characterization of the nodule-specific promoter in the common bean hairy roots.

Analyse de végétaux de promoteur : Identification et caractérisation de racine Nodule promoteur spécifique chez le haricot commun

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...