Les auteurs tiennent à remercier le Dr Stephen Kingsmore et le Centre du génome pédiatrique Médecine des Hôpitaux de Mercy enfants et cliniques pour l&#39;utilisation de leurs grappes de calcul pour l&#39;analyse des données, Illumina équipe sur le terrain des services (Elizabeth Boyer, Scott Cook et Mark Cook) et technique équipe de consultants pour leurs réponses rapides et des suggestions utiles sur le fonctionnement de l&#39;instrument ADN séquençage de prochaine génération, HiScanSQ et analyse de la qualité des données. Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de la santé Grant HL080042 (à SQY) et le démarrage du fonds de dotation et des hôpitaux pour enfants Mercy et Cliniques, Université du Missouri à Kansas City (à SQY).

<html> Un organigramme décrivant ce protocole est affiché à la figure 1. 1. Le traitement des cellules avec de la thrombine, RNA, évaluation de la qualité et la quantification de l&#39;ARN <ol><li> Culture cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires (HMVEC-LBL) à 90-100% de confluence dans des plaques 6 puits en milieu EGM-2 avec 5% de FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques (Lonza, chat # CC-3202). </li><li> Changer médias pour les médias famine (0% de FBS) 30 min avant le traitement avec de la thrombine. </li><li> Traiter les cellules avec 0,05 U / ml de thrombine ou de quitter traitée comme un contrôle pendant 6 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Isoler l&#39;ARN total des cellules traitées et témoins en utilisant le kit Ambion mir Vana selon les instructions du fabricant. </li><li> Évaluer la qualité de l&#39;ARN avec une Experion eucaryote StdSense puce ARN selon le protocole standard sur la station Experion électrophorèse (Automated= &quot;_blank&quot;&gt; Www.bio-rad.com). </li><li> Quantifier l&#39;ARN en utilisant une méthode standard spectrophotométrique. </li></ol> 2. Construction Bibliothèque et de séquençage <ol><li> Utilisez 1 ug d&#39;ARN totaux de haute qualité par échantillon comme produit de départ. </li><li> Pour construire la bibliothèque, suivez la procédure standard d&#39;Illumina (protocole # 15008136 Rev A). Dans ce protocole, deux séries de poly (A) ARNm contenant les sélections sont effectuées pour enlever ARNr de minimiser le séquençage ARNr. </li><li> Évaluer la qualité des bibliothèques à l&#39;aide d&#39;une puce ADN Experion 1K selon le protocole standard sur la station Experion électrophorèse automatique ( <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a> ). </li><li> Quantifier la bibliothèque en utilisant qPCR: Utiliser une bibliothèque qui a déjà été séquencé par une courbe standard et des amorces spécifiques pour les adaptateurs ligaturés. Utiliser une gamme de dilutions des bibliothèques inconnus (c.-à 1:100, 1:500 et 1:1000). Exécutez l&#39;acco qPCRrding au protocole Sybergreen MM et calculer la concentration de matière d&#39;origine de chaque bibliothèque. </li><li> Diluer les stocks de bibliothèque à 10 nM et conserver à -20 ° C jusqu&#39;au moment de pôle une cellule d&#39;écoulement. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à se regrouper une cellule d&#39;écoulement, dégeler la plaque réactif CBOT dans un bain d&#39;eau. CBOT est un instrument Illumina utilisée pour simplifier le processus de génération de cluster. </li><li> Laver l&#39;instrument CBOT. </li><li> Dénaturer les bibliothèques: Mélanger 13 ul 1x TE et 6 ul de 10 uM bibliothèque et, sur le côté du tube, ajouter 1 ul de NaOH 1 N (fourni par Illumina). Vortex, centrifuger et incuber à température ambiante pendant 5 min et placer les bibliothèques dénaturées sur la glace. </li><li> Diluer les bibliothèques: Diluer les bibliothèques dénaturés avec un tampon d&#39;hybridation pré-réfrigéré (HT1, fourni par Illumina) en combinant 996 ul HT1 et 4 pl dénaturé bibliothèque pour une concentration finale de 12 heures. Placez les bibliothèques dénaturées et dilué sur la glace. </li><li> Inverser chaque rangée de tubes de la plaque CBOT,faire en sorte que tous les réactifs sont décongelées. Centrifuger la plaque, enlever / percer les joints bandes et charger sur le CBOT. </li><li> Aliquote de 120 ul dilués et bibliothèques dénaturées à un tube de bande, étiqueté 1-8. Ajouter 1,2 ul diluée, bibliothèque dénaturé contrôle PhiX (à partir de Illumina) dans chaque tube comme un pic en contrôle. Vortex et centrifuger les tubes et les charger sur le CBOT dans le bon sens (tube n ° 1 à droite). </li><li> Chargez une cellule d&#39;écoulement et le collecteur sur le CBOT. </li><li> Terminer le flux de vérifier et de commencer la course de clustering. </li><li> Après la course est terminée, vérifiez distribution de réactifs à travers toutes les voies. Prenez note de toutes les anomalies. Soit commencer l&#39;exécution de séquençage immédiatement ou stocker la cellule d&#39;écoulement dans le tube muni à 4 ° C. </li><li> Décongeler le séquençage par synthèse (SBS, Illumina) réactifs. </li><li> Chargez les réactifs aux endroits appropriés sur les plateaux de réactifs, en veillant à ne pas toucher les autres réactifs après avoir touché le mélange clivage. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un pascellule d&#39;écoulement n-séquençage (celle qui a été séquencé précédemment), prime les lignes de réactifs à deux reprises. </li><li> Bien nettoyer la cellule d&#39;écoulement séquençage avec EtOH à 70% et Kimwipes, suivie d&#39;EtOH à 70% et du papier pour objectif. Inspectez la cellule d&#39;écoulement pour d&#39;éventuelles traces. Re-nettoyez-le si nécessaire. </li><li> Charger la cellule d&#39;écoulement sur le séquenceur et effectuer un écoulement de vérifier que l&#39;étanchéité entre le collecteur et la cuve à circulation est serré. </li><li> Lancer le cycle de séquençage. </li><li> Évaluer les mesures de qualité (par exemple, la densité du cluster, les grappes passent filtre, Q30, intensité) dès qu&#39;ils sont disponibles pendant la course. </li><li> Contrôler l&#39;intensité tout au long de la course. </li><li> Après 101 cycles sont terminés, effectuez la chimie de redressement pour terminer la deuxième lecture: Décongeler les réactifs finaux jumelés et le tampon seconde lecture Incorporation (ICB, une composante de l&#39;réactifs SBS, Illumina) et charger les réactifs. </li><li> Continuer le long de séquençage, l&#39;évaluation de 2 ème lecture d&#39;intensité, un Q30nd mesures de qualité d&#39;autres que l&#39;on avance l&#39;exécution. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Utilisez la dernière version de CASAVA (Illumina, actuellement 1.8.2) pour convertir les fichiers d&#39;appel de base (. Bcl) des fichiers à fichiers. Fastq, la mise en fastq-cluster-comptage à 0 pour assurer la création d&#39;un fichier unique fastq pour chaque échantillon . Décompressez les fichiers fastq pour l&#39;analyse en aval. </li><li> Effectuez un alignement fin jumelé avec les dernières versions de TopHat (1.4.1) 5, qui aligne ARN-seq lit de mammifères de taille des génomes en utilisant l&#39;ultra haut débit aligneur à court de lecture (Bowtie, 0.12.7) 6 et samtools (0,1. 17) 7. Samtools met en œuvre divers utilitaires pour le post-traitement des alignements au format SAM. Le transcriptome humain de référence peuvent être téléchargés à partir iGenomes ( <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). En cours d&#39;exécution TopHat, nous avons utilisé tous les paramètres par défaut, y compris l&#39;option de type bibliothèque fr-unstranded (par défaut). </li><li> Noustion de la CuffDiff programme, une partie des boutons de manchette (1.3.0) 8 progiciel, comparez les cellules traitées par la thrombine dans les cellules contrôles pour éliminer les transcrits des gènes différentiellement exprimés dans l&#39;ancienne base de référence sur le transcriptome humain. Cette comparaison détecte l&#39;expression différentielle des transcrits connus. Utilisez Microsoft Excel pour visualiser le résultat sous forme de tableau. En exécutant le programme Boutons de manchette, nous avons utilisé tous les paramètres par défaut. Ces transcrits du gène avec FPKM &lt;0,05 et p&gt; 0,05 sont filtrés. </li><li> Pour détecter les nouvelles isoformes, exécutez Boutons de manchette sans transcriptome de référence. Comparer les fichiers de transcription échantillon de référence à l&#39;aide du génome Cuffcompare et tester l&#39;expression différentielle avec Cuffdiff combinées en utilisant les fichiers de transcription thrombine comme le génome de référence pour une analyse et les fichiers combinés de contrôle de transcription que le génome de référence pour une analyse secondes. Utilisez Microsoft Excel pour visualiser le résultat sous forme de tableau. Encore une fois, thostranscrits du gène électroniques avec FPKM &lt;0,05 et p&gt; 0,05 sont filtrés. Après cette étape, les enquêteurs peuvent choisir de télécharger une liste des transcriptions nouvellement signalés sur le site UCSC Genome Browser ( <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> ) pour vérifier leur validité par une inspection manuelle. </li><li> Présenter des listes de gènes différentiellement exprimés à Ingenuity Pathway Analysis (IPA, <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> ) pour la caractérisation des gènes et les voies affectées par le traitement thrombine. Dans cette étape, les enquêteurs peuvent choisir d&#39;utiliser ceinture ( <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> ), un package R qui est conçu pour faciliter et simplifier la tâche d&#39;analyser Boutons de manchette ARN-seq sortie, pour aider à gérer, visualiser et d&#39;intégrer toutes les données produites par une analyse Cuffdiff. </li></ol> 4. Validation des résultats par RNA-Seq quantitative en temps réel-PoChain Reaction lymerase (qRT-PCR) <ol><li> Effectuer totale isolement d&#39;ARN à partir de la thrombine et de contrôle traités par HMVEC-LBL cellules, l&#39;ARN et d&#39;évaluation de la qualité de quantification d&#39;ARN décrit dans les stades 1,4 à 1,6. </li><li> Générer ADN complémentaire de 1 ug d&#39;ARN totaux de chaque échantillon avec SuperScript III du premier volet Kits de synthèse RT système, suivant les instructions du fabricant (Invitrogen, 18080-051). </li><li> Effectuer qRT-PCR sur une analyse Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time System PCR en utilisant Taqman-on-Demand oligonucléotides conçus pour la détection des CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) et β-actine (ACTB, Hs99999903_m1). Chaque échantillon a eu un modèle équivalent à 5 ng d&#39;ARN total. Mesurer la quantification en utilisant la méthode DDCT et normaliser la β-actine. Chaque essai a été effectué sur au moins trois biologique répétitions. </li></ol>

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	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. 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G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les étapes clés Manipulation d&#39;ARN: RNases se dégrade, même les plus de haute qualité d&#39;ARN, donc il faut faire attention lors de l&#39;isolement, le stockage et l&#39;utilisation de l&#39;ARN 10. Les gants sont toujours portés afin de prévenir la contamination par des RNases trouvés sur les mains de l&#39;homme. Les gants doivent être changés souvent, surtout après la peau toucher, les poignées de porte ou d&#39;autres surfaces communes. Un ensem...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Réactifs ou équipements </td><td width="85"> Entreprise </td><td width="185"> Numéro de catalogue </td><td width="359"> Commentaires </td></tr><tr><td> Cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Kit Bullet </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> Contient EGM-2, FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques </td></tr><tr><td> La thrombine </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens ARN </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> Préparation d&#39;ARN TruSeqTrousse </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Perles AMPureXP </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript II de la transcriptase inverse </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion ADN 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect Sybergreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster Génération Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Kit de contrôle </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Cycle SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> machine à qPCR - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Modèle # VIIA7 / Equipement # 10631261 </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Système Experion </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer est un système alternatif </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre </td><td> Bio-Tek </td><td> Spectrophotomètre pour microplaques Epoch </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Centrifugeuse - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Support magnétique </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-bien thermocycleur </td><td> Fournisseur General Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 3. Liste des réactifs et des clés E Majorquipement. * Dans la vidéo, au lieu de HiSeq1000 HiScanSQ a été démontrée. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

La caractérisation de l&#39;expression des gènes dans les cellules via la mesure des niveaux d&#39;ARNm est un outil utile pour déterminer comment la machinerie transcriptionnelle de la cellule est affectée par des signaux externes (traitement médicamenteux, par exemple), ou comment les cellules diffèrent entre un état ​​sain et un état ​​pathologique. Avec l&#39;avènement et le raffinement continu de la technologie de l&#39;ADN de la prochaine génération de séquençage, séquençage de l&#39;ARN (ARN-seq) est devenue une méthode de plus en plus populaire de l&#39;analyse du transcriptome de cataloguer toutes les espèces de transcriptions, de déterminer la structure de la transcription de tous les gènes exprimés et à quantifier les niveaux d&#39;expression de l&#39;évolution de l&#39;ensemble total de transcrits dans une cellule donnée 1,2, tissu ou organisme. ARN-seq remplace progressivement les puces à ADN comme une méthode pratique pour l&#39;analyse du transcriptome, car il a les avantages de profilage d&#39;un transcriptome complet, offrant une donnée de type numérique (nombre de copies de la transcription) et ne comptez sur aucune séquentielle génomique connueCe 3. Ici, nous présentons un protocole complète et détaillée à appliquer ARN-seq pour transcriptomes profil de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est basé sur notre étude publiée récemment intitulé «RNA-seq révèle transcriptome Novel des gènes et de leurs isoformes de l&#39;homme dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traités par la thrombine,&quot; 4, dans lequel nous avons réussi a effectué la première analyse complète du transcriptome de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traité avec de la thrombine en utilisant l&#39;ARN-seq. Elle a abouti à des ressources sans précédent pour de nouvelles expérimentations afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la thrombine dysfonction endothéliale dans la pathogénie des maladies inflammatoires, le cancer, le diabète et les maladies coronariennes, et fournit de nouvelles pistes potentielles pour cibles thérapeutiques pour ces maladies. Le texte descriptif de ce protocoleest divisé en quatre parties. La première partie décrit le traitement de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec la thrombine et d&#39;isolement d&#39;ARN, analyse de la qualité et de quantification. La deuxième partie décrit la construction de bibliothèques et de séquençage. La troisième partie décrit l&#39;analyse des données. La quatrième partie décrit un essai de validation par RT-PCR. Les résultats représentatifs de plusieurs étapes clés sont affichés. Conseils utiles ou les précautions à stimuler le succès dans les étapes clés sont fournis dans la section Discussion. Bien que ce protocole utilise de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traitées avec de la thrombine, elle peut être généralisée à transcriptomes de profil dans les deux cellules de mammifères et non mammifères et dans les tissus traités avec différents stimuli ou des inhibiteurs, ou pour comparer les transcriptomes dans des cellules ou des tissus entre un état de santé et un état de maladie.

Pour l&#39;étape 1: L&#39;28s: 18s rapport est traditionnellement utilisé comme un indicateur de la dégradation de l&#39;ARN. Idéalement, le pic 28s devrait avoir environ deux fois la surface de la bande 18 (un ratio de 2), mais cette proportion idéale n&#39;est pas souvent vu dans la pratique. En outre, 28s: 18s ratios obtenus à partir de méthodes spectrophotométriques peut sous-estimer l&#39;importance de la dégradation de l&#39;ARN. Pour plus de précision quantifier la dégradation, et donc...

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RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Ce protocole présente une procédure complète et détaillée à appliquer ARN-seq, une puissante technologie de l&#39;ADN de la prochaine génération de séquençage, de transcriptomes profil de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est généralisable à différentes cellules ou des tissus affectés par différents réactifs ou états pathologiques.

ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

21.8K vues.  Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City. Ce protocole présente une procédure complète et détaillée à appliquer ARN-seq, une puissante technologie de l'ADN de la prochaine génération de séquençage, de transcriptomes profil de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est généralisable à différentes cellules ou des tissus affectés par différents réactifs ou états pathologiques.

Vidéo: RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Recherche

Biologie

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioingénierie de l&#39;homme Réseaux microvasculaires chez des souris immunodéficientes

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l&#39;interface Air Liquide

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Isolation de microvasculaire endothéliale des artères de résistance Tubes souris

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En détection de visage de l&#39;oxyde nitrique et de superoxyde dans la couche endothéliale des artères intactes

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Haute résolution Time-lapse d&#39;imagerie et d&#39;analyse automatisée des microtubules Dynamics Living ombilicale humaine Cellules endothéliales de veine

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.