The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

1. Préparation des bactéries Alimentation NOTE: Cette section décrit la préparation de bactéries d&#39;alimentation (la souche de E. coli OP50). <ol><li> Isoler une seule colonie de E. coli souche OP50 à partir d&#39;un bouillon de lysogénie (LB) plaque de gélose et aseptique inoculer dans 300 ml de bouillon LB autoclave. </li><li> Laisser la culture inoculé à croître pendant une nuit dans un agitateur à 200 tpm et 37 ° C, jusqu&#39;à ce que la saturation soit atteinte. </li><li> Transférer le OP50 en 6 tubes de 50 ml coniques stériles, pré-pesées. Pellet les bactéries par centrifugation pendant 5 min à 6000 tpm (5000 xg). </li><li> Jeter le surnageant et laver les bactéries avec 50 ml d&#39;M9 stérile. Répéter deux fois. </li><li> Après le second lavage retirer le M9 restant, assurant qu&#39;aucun M9 est laissé dans le tube. </li><li> Déterminer le poids de la pastille par pesée du tube contenant le culot de bactéries et soustraire le poids du tube conique de 50 ml. </li><li> Reprendre le culot in M9 à une concentration de 100 mg / ml. </li><li> Conserver la solution de OP50 à 4 ° C jusqu&#39;à son utilisation pour la culture de la vis sans fin. </li></ol> 2. Préparation de nématodes croissance à moyen (NGM) des boîtes de Petri NOTE: Cette section décrit la préparation de plaques NGM Petri, qui sont les plaques où le C. vers elegans sont maintenues en routine en laboratoire. <ol><li> Autoclave le milieu de gélose NGM. </li><li> En utilisant des procédures stériles, distribuer 17 ml d&#39;une solution de gélose NGM dans des boîtes de Pétri de 6 cm en utilisant une pompe péristaltique. NOTE: Une quantité constante d&#39;agar dans les plaques réduit le besoin de recentrer le microscope lors du passage d&#39;une plaque à l&#39;autre. </li><li> Laisser les plaques à température ambiante pendant 2 à 3 jours avant utilisation pour laisser la gélose solidifier et permettre à l&#39;excès d&#39;humidité de se évaporer. </li><li> Ensemencer les plaques NGM en utilisant une technique stérile. Appliquer 1-2 gouttes de culture liquide OP50 et diffuser l&#39;aide d&#39;une tige de verre. Veillez à ne pasfaire passer le gazon bactérien tout le chemin vers les bords des plaques. </li><li> Laisser la pelouse OP50 à croître pendant 1-2 jours à la température ambiante avant d&#39;utiliser les plaques à croître vers. </li></ol> 3. Préparation d&#39;une population de Worm synchrone NOTE: Le cycle de vie de C. elegans est composé du stade embryonnaire, quatre stades larvaires (L1-L4) et l&#39;âge adulte. Cette section décrit la préparation d&#39;une population de vers l&#39;âge synchrone. Tous les matériaux entrant en contact avec C. elegans après le traitement de l&#39;eau de Javel doivent être stériles. <ol><li> Jour 1 - Préparation de gravides Worm population <ol><li> Utilisez des assiettes NGM dans lequel la majorité de la population de vers se compose de larves L1 affamés. </li><li> Recueillir les larves L1 avec un ver stérilisée ramasser et de les transférer au frais 6 cm de plaques NGM ensemencé avec OP50. Incuber pendant environ 65 heures à 20 ° C jusqu&#39;à ce que la majorité des vers adultes sont gravides. Àéviter plaque surpeuplement et permettent les vers de se développer sans épuiser les bactéries, ne pas transférer plus d&#39;un ou deux groupes de larves L1 à chaque plaque NGM frais. </li></ol></li><li> Jour 4 - Création d&#39;un synchronisée L1 larves population <ol><li> Recueillir les vers gravides des plaques NGM en les lavant avec 1-2 ml de M9 et de les transférer à un tube conique de 15 ml. </li><li> Laissez les vers gravides sédimentent au fond du tube de 15 ml conique pour environ 5-10 min. Eliminer le surnageant sans perturber le culot à vis sans fin. </li><li> Transférer le culot de ver 2-4 microtubes et ajouter 1 ml d&#39;eau de Javel / solution de NaOH. Incuber pendant 2-3 min à température ambiante. Surveillez la progression de la réaction sous la loupe binoculaire pour confirmer tous les vers sont morts. Ne pas blanchir plus de 5 min que les embryons pourraient mourir. </li><li> Recueillir les vers par centrifugation pendant 1 min à 3000 rpm (900 xg). Retirer le surnageant et ajouter 1 ml de M9 stérileneutraliser la réaction. </li><li> Laver les vers deux fois par centrifugation pendant 1 min à 3000 rpm (900 x g). </li><li> Retirer le surnageant et ajouter M9 jusqu&#39;à 100-200 ul. </li><li> En utilisant une pipette Pasteur en verre ajouter une goutte de la vis sans fin / M9 mélanger pour effacer plaques NGM et incuber pendant au moins 24 heures à 20 ° C pour permettre aux embryons éclosent. REMARQUE: Sans nourriture la croissance des larves sera arrêtée au stade L1. </li></ol></li><li> Jour 5 - Création d&#39;un synchronisée larves L4 population <ol><li> Recueillir les larves L1 à partir des plaques NGM claires par lavage des plaques avec 2.1 ml de M9 et les transférer dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Laissez les morts vers adultes sédiment au fond du tube conique de 15 ml pendant environ 5 min. </li><li> Recueillir le surnageant, où les vers sont L1, dans un nouveau tube conique de 15 ml, et précipiter les vers par centrifugation pendant 2 min à 2600 rpm (1000 xg). </li><li> Eliminer le surnageant leyant environ 500 pi. </li><li> Déterminer la concentration de la solution vers dans M9 en comptant le nombre de vers dans 10 ul de gouttes à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope. Comptez au moins 5 gouttes. </li><li> Ajuster la concentration des vers à 20-25 vers / ul et ajouter 50 ul du ver / M9 mélange sur des plaques NGM ensemencés avec OP50. </li><li> Incuber pendant 65 heures à 15 ° C (pour l&#39;incubation à travers le week-end) pour permettre à la population synchronisée L1 à grandir jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent le stade L4. </li></ol></li></ol> 4. Exposition de Worms à des produits chimiques dans les plaques à 96 puits NOTE: Cette section décrit l&#39;utilisation de Pxol1 :: rapporteur transcriptionnel GFP contenant C. souche elegans pour le dépistage de l&#39;induction de l&#39;aneuploïdie. <ol><li> Recueillir les larves L4 à partir des plaques NGM claires par lavage des plaques avec 2.1 ml de M9 et les transférer dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Laissez le L4 vers sédiments au fond de la15 ml tube conique de environ 5-10 min. Eliminer le surnageant sans perturber le culot à vis sans fin. </li><li> Ajouter 3-5 ml de M9 et déterminer la concentration de la solution vers dans M9 en comptant le nombre de vers dans 10 ul de gouttes à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope. Comptez au moins 5 gouttes pour chaque échantillon. </li><li> Remettre en suspension les vers à une concentration de 1,000 / ml dans les vers M9. </li><li> Diluer les bactéries OP50 de l&#39;article 1 10 fois avec M9. Assurez-vous que les bactéries remises en suspension atteignent la température ambiante parce que la température inférieure affecte le développement du ver. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, d&#39;abord ajouter 100 ul du ver / M9 mélange (de l&#39;étape 4.4) et puis ajouter 400 pl des bactéries OP50 dilué (de l&#39;étape 4.5) pour chaque puits d&#39;une 2 ml ronde profonde de plaque de 96 puits à fond. À la fin, chaque puits aura 100 vers dans 500 pi. </li><li> Ajouter 0,5 ul de la substance d&#39;essai ou le contrôle approprié pour les puits souhaités, pour parvenir à une concentr finale suggéréation de 100 uM, une concentration couramment utilisé dans les écrans chimiques en C. elegans 12. Exposer l&#39;éthanol ou le DMSO témoins de solvant à une concentration finale de 0,1%. NOTE: Nous vous recommandons l&#39;utilisation de nocodazole (100 M) comme témoin positif. </li><li> Sceller la plaque avec un film adhésif. Ne oubliez pas de sceller la plaque bien de prévenir la contamination croisée entre les puits. </li><li> Envelopper la plaque avec une feuille d&#39;aluminium. </li><li> Transférer la plaque à un agitateur (170 à 180 rpm) de la température appropriée pour la longueur de temps appropriée (24 ou 65 h). La température de la pièce affecte la croissance des vers; maintenir la température autour de 20 ° C. </li></ol> Acquisition 5. Image gravides Worms dans une plaque 384 puits NOTE: Cette section décrit l&#39;utilisation d&#39;un microscope à haute teneur à l&#39;image de la Pxol1 exposée :: vers GFP, de visualiser l&#39;expression de la GFP dans les embryons dans l&#39;utérus d&#39;hermaphrodites adultes. Pourchaque plaque 384 puits à cribler, utiliser des vers de plaques 4 x 96 puits. <ol><li> Après exposition aux produits chimiques dans le shaker, laissez la plaque à 96 puits de repos pendant 10-15 min pour permettre les vers adultes dans les sédiments au fond de la plaque. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, retirer 350 pi de la M9, ​​en faisant très attention à ne pas déranger les vers dans le fond de la plaque. </li><li> Laver les vers avec 1 ml de M9 et répétez l&#39;étape 5.1. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, retirez 1 ml de la M9, ​​étant Vey attention à ne pas déranger les vers dans le bas de la plaque. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, remettre en suspension les vers dans le M9 restante et de recueillir 100 pi du ver / M9 mélange des plaques à 96 puits et le charger dans les puits d&#39;une murs noirs / plaque de fond claire 384 puits. Répétez le processus en utilisant les vers de plaques 4 x 96 puits, jusqu&#39;à ce que tous les puits de la plaque 384 puits ont été chargés. NOTE: Il est important pour tous les puits d&#39;avoir le même volume pour augmenter lal&#39;efficacité et la rapidité de la mise au point automatique pendant le processus d&#39;acquisition d&#39;image. Chaque puits doit contenir entre 80 à 100 vers. </li><li> Ajouter 1 ul de lévamisole (100 M) à chaque puits et laisser les vers incuber pendant environ 30 min. REMARQUE: lévamisole agit comme un agoniste du récepteur de l&#39;acétylcholine et immobilise les vers. </li><li> Transférer la plaque à un microscope haute teneur grand champ capable de fournir l&#39;imagerie automatisée. </li><li> Pour l&#39;acquisition de l&#39;image, utiliser une acquisition et d&#39;analyse d&#39;image logiciel teneur élevée selon les directives du fabricant. Sélectionnez l&#39;objectif 4X pour acquérir une image par bien. </li><li> Avant de commencer l&#39;acquisition de l&#39;image, réglez les paramètres d&#39;imagerie de la GFP à 45 ms de l&#39;exposition et de la résolution de 2160 x image pour 2160. </li><li> Recueillir les données que le nombre de vers GFP-positives divisé par le nombre total de vers dans le puits, cette dernière mesure étant relativement constante entre les puits. </li></ol>

<ol>
	<li>Office, U. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+No.+GAO-06-1032T.">Report No. GAO-06-1032T.</a> Actions are needed to improve the effectiveness of EPA&#8217;s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).</li><li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte.">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+in+humans:+incidence,+origin+and+etiology.">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li><li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths:+final+data+for+2006.">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li><li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+mammals:+recombination,+non-disjunction+and+the+environment.">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex.">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li><li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis.">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function.">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans.">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La méthode décrite ici constitue la première stratégie de grande échelle pour l&#39;identification de substances toxiques de la lignée germinale. Il nécessite l&#39;utilisation d&#39;un transgénique GFP Pxol-1 :: GFP contenant la souche qui rend fidèlement l&#39;induction de l&#39;aneuploïdie dans les embryons précoces qui est utilisé comme un proxy pour le dysfonctionnement de la lignée germinale. La méthode implique la synchronisation minutieuse d&#39;un C. elegans population de vers et...

Il ya environ 87 000 produits chimiques inscrits pour le commerce aux États-Unis, mais seulement un petit nombre d&#39;entre eux ont été testé pour ses effets potentiels sur la santé 1. Parmi ceux qui ont été testés, seule une partie a été évalué pour les effets sur la santé de la reproduction en partie à cause de la difficulté à déterminer l&#39;altération des événements reproduction début chez les mammifères, en particulier au cours du développement des cellules germinales femelles et la différenciation. En effet, les premiers événements méiotiques ont lieu pendant les premiers stades du développement embryonnaire chez les mammifères femelles et sont donc difficiles d&#39;accès et se accumuler dans les numéros appropriés à des fins de dépistage. La lignée germinale fournit le lien crucial entre les générations, et sa fonction appropriée dépend de l&#39;exécution précise du programme complexe de la division cellulaire et chromosomique appelée méiose. Le dérèglement du processus méiotique peut provoquer une réduction de la fertilité et de la productiongamètes et des embryons avec un nombre anormal de chromosomes, un état appelé aneuploïdie. Chromosomiques erreurs de ségrégation dans la méiose sont très pertinents pour la santé humaine. Les anomalies chromosomiques sont communs, avec une fréquence de 1 à 150 naissances vivantes, la trisomie 21, 18 et 13 ainsi que chromosomes X et Y étant les erreurs types les plus répandus 2,3. En outre, les malformations congénitales, y compris ceux d&#39;origine chromosomiques, sont la principale cause de mortalité infantile aux États-Unis 4 L&#39;idée que les influences environnementales peuvent affecter la ségrégation et le comportement chromosomique ne est pas nouveau 5, mais est encore mal comprise. Il est donc crucial pour enquêter sur laquelle des produits chimiques introduits dans notre environnement sont interférer avec la fertilité humaine, le développement des jeunes et la santé reproductive en général. À la lumière de ces limites des modèles de mammifères, nous avons développé un test de l&#39;écran à haut débit pour tester la toxicité de la reproduction dans le ascaris &lt;em&gt; C. elegans. Nous avons mobilisé plusieurs caractéristiques importantes offertes par ce système de modèle génétique communément employés comme sa petite taille, à faible coût, cycle de reproduction court, forte proportion de cellules germinales et la facilité de manipulation 6. Worms peuvent être cultivées dans des plaques à 96 puits ou dans des cultures liquides à volume élevé et à cause de leur transparence peuvent être directement visualisés sur des plaques pour la détection des journalistes fluorescentes. Le test décrit ci-dessous tire profit de ces caractéristiques et profite d&#39;une souche du ver contenant le rapporteur fluorescent Pxol-1 :: GFP pour détecter la perturbation lignée germinale et l&#39;induction de l&#39;aneuploïdie embryonnaire. L&#39;utilisation de cette souche rapporteur est basé sur la présence des hommes généralement rares dans une population de vers principalement hermaphrodite. Ces mâles (&lt;0,2%) proviennent naturellement de l&#39;erreur dans la ségrégation du chromosome X 7. Cependant, comme la perturbation de la lignée germinale conduit souvent à des erreurs dans la ségrégation des autosomeset hétérochromosomes, il est corrélé à la fois avec une incidence élevée de mâles phénotype (X mauvaise ségrégation) ainsi que la létalité embryonnaire (autosome de mauvaise ségrégation). Pour détecter facilement l&#39;induction des hommes tout en contournant la question de la mortalité embryonnaire, un promoteur spécifique mâle (xol-1) est utilisé pour diriger l&#39;expression de la GFP dans les embryons précoces encore contenues dans l&#39;utérus de la vis sans fin. En tant que tel, l&#39;apparition d&#39;embryons exprimant la GFP est utilisée comme indicateur de la présence d&#39;embryons aneuploïdes. Cette méthode a déjà été utilisée pour identifier les gènes impliqués dans le maintien de la lignée germinale et la méiose 8,9. Adapté au dépistage chimique, cette souche est employé dans un milieu à l&#39;écran à haut débit. Surtout, la souche rapporte fidèlement la aneugenicity de produits chimiques et est donc pertinent de paramètres de la reproduction des mammifères 10. L&#39;essai décrit ici sera particulièrement utile pour les toxicologues dans les milieux de l&#39;industrie pharmaceutique et chimique à la recherched&#39;évaluer rapidement la toxicité des produits chimiques sur les effets sur la reproduction. En outre, ce test se aligne pleinement avec les priorités gouvernementales mises en évidence dans la toxicité dans le 21 e rapport de 11 siècle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="975">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td style="width:129px;">Tritech</td>
			<td>T3315</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Agar</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-274</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate</td>
			<td style="width:129px;">Corning</td>
			<td>P-DW-20-C-S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:129px;">Apex</td>
			<td>20-261</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bacto-tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1421-2</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bleach</td>
			<td style="width:129px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>AA12316-A1</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138225</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">DMSO</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>IC19018680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">E. coli (OP50)</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>EM-4455S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Greiner CELLSTAR 384 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1937-32EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageXpress Micro XLS System&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Levamisole hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31742</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>97061-438</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress High Content Image Acquisition &#38; Analysis Software&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Rayon Films for Biological Cultures</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>BDH0316</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:473px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ 745</td>
			<td style="width:255px;">This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:129px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">212750</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

L&#39;identification de la toxicité pour la reproduction des milliers de produits chimiques présents dans notre environnement a été l&#39;un des défis les plus alléchantes dans le domaine de la santé environnementale. Cela est dû en partie à la rareté des systèmes modèles qui peuvent (1) récapituler précision touches caractéristiques des processus de reproduction et (2) le font dans un moyen à la mode à haut débit, sans la nécessité d&#39;un grand nombre d&#39;animaux vertébrés. Nous décrivons ici un essai chez le nématode C. elegans qui permet l&#39;identification rapide des substances toxiques de la lignée germinale en surveillant l&#39;induction d&#39;embryons aneuploïdes. En faisant usage d&#39;une ligne rapporteur GFP, des erreurs dans la ségrégation des chromosomes résultant de la perturbation de la lignée germinale sont facilement visualisés et quantifiés par microscopie à fluorescence automatisé. Ainsi, la projection d&#39;un ensemble particulier de composés pour sa toxicité peut être effectuée dans un format de plaque à 96 384 puits dans une affaire de jours. Une analyse secondaire des h positifsa peut être effectuée pour déterminer si les anomalies chromosomiques provenaient de la perturbation de la méiose ou de début erreurs chromosome de ségrégation embryonnaires. Au total, ce test représente une stratégie de premier passage rapide pour l&#39;évaluation rapide de la dysfonction de la lignée germinale suite d&#39;une exposition chimique.

L&#39;exposition de la Pxol-1 :: GFP souche rapporteuse à des agents chimiques tels que les microtubules poison nocodazole (figure 1) conduit à l&#39;induction d&#39;une forte proportion d&#39;embryons exprimant la GFP dans l&#39;utérus d&#39;hermaphrodites adultes exposés par rapport à un témoin de DMSO. Les embryons GFP-positives sont significativement plus lumineux que le fond faible fluorescence observé dans d&#39;autres embryons ainsi que l&#39;auto-fluorescence observée dans l&#39...

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Évaluation complète de la lignée germinale toxicité chimique Utilisation du nématode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K vues.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Human cellules souches pluripotentes Basé Toxicité pour le développement dosages pour Chemical dépistage et la biologie des systèmes de sécurité de génération de données

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Recherche

Biologie du développement

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Salinity dépendant Essai de toxicité de l&#39;argent nanocolloïdes Utilisation de Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Analyse spatiale et temporelle d&#39;Active ERK dans le<em&gt; C. elegans</em&gt; germinale

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilisation Caenorhabditis elegans , à analyser le Transport intracellulaire dans les neurones

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

Évaluer l’alcalinisation Lysosomal dans l' intestin de vivre Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Analyse de calcul de la lignée germinale de Caenorhabditis elegans pour étudier la Distribution des noyaux, les protéines et le cytosquelette

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

Analyse du Cycle cellulaire dans la lignée germinale de c. elegans avec la Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

Étudier le Stress oxydatif causé par les streptocoques de groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Mesure du sperme guidage et motilité dans le Caenorhabditis elegans hermaphrodite appareil de reproduction

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

Isolement des populations neuronales spécifiques de Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...