L’analyse toxicologique de C.elegans est précieuse. Ce protocole décrit comment traiter C.elegans avec des produits chimiques dans une plaque de 384 puits, capturer des vidéos et quantifier les phénotypes liés à la toxicologie. Cette méthode pourrait aider à identifier et à prédire la toxicité aiguë potentielle d’un produit chimique.
Cette technique quantitative a été développée pour analyser automatiquement les 33 paramètres de C.elegans après 12 à 24 heures de traitement chimique dans une plaque de 384 puits avec milieu liquide. C.elegans est précieux comme un bon modèle d’évaluation rapide de la toxicité pour les nouveaux produits chimiques. En tant que souris, il peut être appliqué au criblage et à l’essai de toxicité de nouveaux produits chimiques, ou du composé comme pollution d’agent additif alimentaire, composé pharmaceutique, composé exogène d’environnement, et ainsi de suite.
Lisez attentivement le protocole et suivez toujours le avec étape par étape, alors vous serez le bon. La démonstration visuelle est plus facile pour l’utilisateur de voir le fonctionnement de chaque étape, et le résultat de l’opération. Wenjing Zhang et Gaochao Han feront la démonstration de la procédure.
Ce sont des étudiants diplômés de mon laboratoire. Pour commencer, effectuer un test préliminaire de létalité des vers pour un nouveau produit chimique, pour déterminer le dosage le plus élevé, et le dosage le plus bas, qui sont la concentration minimale de 100% létalité, et la concentration maximale de 100% non létalité. Pour cette expérience, préparez sept concentrations de gradient de chlorure de cadmium.
Pour préparer deux fois la solution aqueuse concentrée la plus élevée, dissoudre 92,8 milligrammes de poudre solide de chlorure de cadmium dans un tube de centrifugeuse rempli de huit millilitres de K moyen. Vortex à mélanger. Après la dissolution complète de la poudre, utiliser une pipette pour remplir jusqu’à 10 millilitres.
Préparer les autres niveaux de concentration par dilution avec K moyen. Dans un banc super propre, utilisez une pointe stérile pour prélasser une seule colonie d’E.coli OP50 dans la plaque de strie et placez-la dans le flacon avec 100 millilitres de bouillon LB pour inoculer la colonie. Cultivez-le pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans le shaker incubateur.
Verser le NGM dans une plaque petri en plastique de 90 millilitres. Ensemencer chaque assiette avec 300 microlitres de solution E.coli OP50. Incuber les vers N2 sur les plaques NGM avec OP50 à 20 degrés Celsius pendant environ 2 à 3 jours, jusqu’à ce que la plupart des vers aient atteint le stade adulte.
Avec de l’eau stérile, laver les vers gravid dans un tube de centrifugeuse conique stérile de 15 millilitres à récolter. Laissez les vers s’installer pendant au moins 2 minutes. Aspirer l’eau et ajouter cinq millilitres de tampon d’eau de Javel.
Vortex le tube pendant cinq minutes, puis mettre le tube dans une centrifugeuse pour tourner à une force centrifuge relative de 1300 pendant 30 secondes pour pelleter les oeufs. Utilisez une pipette pour aspirer le surnatant. Ajouter cinq millilitres d’eau stérilisée dans le tube pour laver les œufs et vortexer le tube pendant cinq secondes.
Centrifugeuse du tube pendant 30 secondes, à une force centrifuge relative de 1300. Retirer le surnatant et ajouter cinq millilitres d’eau stérilisée pour le laver à nouveau. Pipette les oeufs sur une nouvelle plaque NGM avec OP50.
Incubez-les à 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, les vers éclos atteignent le stade de L1. Après environ 40 heures, les vers atteignent le stade L4.
Avec k moyen, laver les vers de scène L4 des plaques Petri dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Pipette 50 microlitres du liquide ver du tube à une lame de verre. Au microscope stéréo, utiliser une pipette pour ajuster la concentration de vers à environ 40 animaux pour 100 microlitres de milieu K.
Ajouter 50 microlitres du milieu préparé dans chaque puits de la plaque de 384 puits. Ces vers synchronisés de stade L4 sont prêts à suivre le traitement par des produits chimiques. Avant d’ajouter les produits chimiques, placez la plaque de 384 puits, avec les vers synchronisés sur le stade automatique, et installez la caméra vidéo avec la procédure d’acquisition programmée.
Dans la plaque de 384 puits, les vers sont traités avec six à sept doses de chaque produit chimique individuel, avec huit puits parallèles contenant 50 microlitres de la solution deux fois chimique pour chaque dosage. Préparer au moins trois groupes de huit puits parallèles de milieu K comme un contrôle. Ajouter 50 microlitres de la solution chimique deux fois pour chaque puits.
Définissez l’heure comme point zéro heure. Ensuite, mettez la plaque de 384 puits dans le shaker incubateur fixé à 20 degrés Celsius, et 80 révolutions par minute. Après un temps désiré, retirez la plaque de l’incubateur et transférez-la à l’étape automatique.
Prenez des vidéos de chaque puits de la plaque, à 12 heures, et à 24 heures pour vérifier les phénotypes des vers. Pour commencer à traiter la vidéo expérimentale, transférez les fichiers vidéo à l’ordinateur. Via l’interface utilisateur graphique, cliquez sur le bouton Sélectionner, pour choisir l’annuaire des images source.
Ajouter l’annuaire des résultats intermédiaires. Les résultats intermédiaires incluent les images segmentées, qui sont utiles pour l’observation visuelle des images traitées. Ajouter l’annuaire des résultats fin derniers dans l’interface.
Définissez le paramètre moyen de taille du ver à 2000 dans la boîte de texte Worm Size dans l’interface. Définissez le seuil du ratio déplacé à 0,93 dans l’interface. Cliquez sur le bouton Analyser pour démarrer le traitement d’image.
Le programme développé peut reconnaître les vers et quantifier automatiquement les phénotypes. Dans cette expérience, 33 dispositifs distincts ont été quantifiés pour le traitement de chlorure de cadmium à trois points de temps, zéro heure, 12 heures, et 24 heures. Des images expérimentales montrent que les vers sont morts plus rapidement à mesure que la concentration chimique augmentait.
Au début, il n’y avait pas de différence significative entre le contrôle et les traitements chimiques. Après 12 heures de traitement, les vers traités avec une forte concentration sont devenus plus droits et moins courbés qu’à des concentrations inférieures ou dans des groupes de contrôle. La longueur principale de l’axe de la région couverte par le corps du ver a augmenté à mesure que le temps augmentait.
Il y a également une tendance de gradient des concentrations chimiques inférieures à plus élevées dans l’axe principal et dans la longueur mineure d’axe. La motilité des vers, basée sur la région et le rapport, a montré des modèles similaires. Aucune différence significative n’a été observée au début.
Au fil du temps, les vers du groupe témoin ont montré une diminution stable de la motilité. Après 12 et 24 heures, les vers qui ont été traités avec le chlorure de cadmium ont montré des différences significatives dans la motilité, comparées aux groupes de contrôle. En outre, les vers soumis à des traitements à concentration plus élevée ont montré une motilité plus faible, par rapport aux vers sous des traitements à faible concentration.
En résumé, cette technique ouvre la voie à une évaluation rapide de la toxicité dans plusieurs domaines. Les chercheurs qui pourraient appliquer la méthode à l’analyse d’urgence de la toxicité dans la toxicose d’origine alimentaire, l’évaluation de l’innocuité des composés pharmaceutiques, ainsi que le dépistage de la toxicité aiguë, et la détection de nouveaux produits chimiques, et les composés exogènes environnementaux. Le chlorure de cadmium est une substance faiblement toxique.
S’il vous plaît porter des gants et un masque pendant votre manipulation, et suivez les instructions de fonctionnement.
