Ce protocole est un moyen simple et réalisable pour les étudiants de premier cycle de mener des recherches authentiques qui pourraient conduire à des résultats publiables. Le principal avantage est que les étudiants peuvent mener des recherches originales sur des questions qu’ils décident eux-mêmes. Pour commencer, fabriquez un épandeur de solution en pliant soigneusement une pipette Pasteur en verre de neuf millilitres dans une flamme de brûleur Bunsen et fermez l’ouverture de la pipette.
Ensuite, l’éthanol stérilise l’épandeur avant chaque étalement sur la plaque de Pétri. À l’aide d’un micropipetter, placez 100 microlitres de la dilution au centre de la gélose et étalez doucement sur la surface avec l’épandeur stérilisé. Ensuite, mettez de côté les boîtes de Petri couvertes et laissez la solution tremper dans la surface jusqu’à ce qu’elle soit sèche.
Pour les périodes d’exposition supérieures à 12 heures, ajouter 50 microlitres d’une culture nocturne d’Escherichia coli aux plaques avant d’ajouter les nématodes, alors que pour les expériences aiguës de 12 heures ou moins, il n’est pas nécessaire d’avoir E. coli sur les plaques. À l’aide d’une micropipette, placez un millilitre d’eau stérile sur la plaque de nématodes. Ensuite, faites pivoter l’eau pour soulever les nématodes, puis retirez le liquide avec les nématodes dans un tube de microfuge de 1,5 millilitre.
Après 10 minutes, lorsque les nématodes se sont déposés par gravité, retirez soigneusement au moins 500 microlitres d’eau et jetez-les. Ensuite, remettez en suspension les nématodes et, à l’aide d’une pointe de pipette jaune coupée, retirez 50 à 100 microlitres de vers en suspension dans chaque plaque de traitement, en vous assurant que chaque plaque contient au moins 10 vers adultes. Préparez deux diapositives en plaçant un morceau de ruban adhésif sur un seul côté de la diapositive pour former un tampon d’épaisseur uniforme, puis placez une glissière propre inutilisée entre elles sur la paillasse.
Placez une goutte de 10 microlitres d’agarose fondue sur le centre de la lame à l’aide d’un micropipetter. Ensuite, aplatissez la goutte en plaçant une autre lame propre sur le dessus perpendiculairement à la glissière avec la goutte et appliquez une pression pour que la goutte d’agarose forme l’épaisseur du ruban d’étiquetage. Ensuite, appliquez une pression constante pour séparer les deux glissières.
Ensuite, posez cette glissière avec le côté agar vers le haut sur la paillasse et laissez-la sécher pendant une à deux minutes avant de l’utiliser. Pour ajouter des nématodes de la lame préparée avec le tampon d’agarose, ajoutez une goutte d’eau de cinq microlitres contenant un azoture molaire de sodium au tampon de gélose, ce qui anesthésiera les vers et les mobilisera. Ensuite, transférer à 10 nématodes par lame de traitement à la gouttelette à l’aide d’un pic à vers, qui doit être stérilisé avant et après le transfert des nématodes.
Ensuite, ajoutez un glissement de couverture à l’aide d’une pince en le plaçant à un angle et en l’abaissant lentement. Ensuite, placez la monture humide préparée sur un microscope fluorescent pour observer les vers d’abord sous un grossissement et un contraste de phase de 10X, puis sous un grossissement de 40X avec contraste de phase et éclairage fluorescent. Placez une monture humide préparée à la fois sur la scène du microscope et fixez-la en place à l’aide des clips de la scène du microscope, puis commencez à visualiser les montures humides avec l’objectif de grossissement le plus bas, qui est généralement de 10X et utilisez un champ lumineux ou un contraste de phase pour visualiser et se concentrer sur les nématodes.
Une fois qu’un nématode est situé dans le champ de vision, concentrez-vous dessus à l’aide du bouton de mise au point fine du microscope, puis basculez l’éclairage en fluorescence en tournant le cadran et dirigez la lumière vers l’appareil photo pour capturer les images numériques. Ensuite, ajustez l’éclairage à l’aide du logiciel d’imagerie afin que les neurones soient brillamment éclairés, mais pas sursaturés. À un moment donné, obtenez une image séparée d’une règle au même grossissement que les images de cellule pour fournir une échelle de grossissement pour leur figure.
Les effets du pesticide contenant du manganèse sur la morphologie des neurones dopaminergiques à l’aide d’une souche dans laquelle les neurones dopaminergiques exprimaient la GFP ont été étudiés montrant un signal lumineux. Cependant, le signal fluorescent blanchit si les neurones sont exposés à la lumière pendant de longues périodes. Cette procédure peut faire partie d’un projet de plusieurs semaines dirigé par des étudiants qui peut également inclure des données comportementales ou autres.
