This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

NOTE: Éthique Déclaration: Le protocole de manipulation des animaux a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de Californie, Irvine, le protocole # 2010-2943. 1. Suppression de la moelle épinière <ol><li> Placez des serviettes en papier mouillés avec ~ 100% d&#39;isoflurane liquide, USP dans la chambre euthanasie et placer des serviettes en papier sec sur le dessus. Placez la souris dans la chambre au-dessus de serviettes en papier sèche afin souris ne est pas en contact avec le isoflurane et se assurer que la chambre est couverte. Attendre au moins une minute après l&#39;arrêt de la respiration pour que la souris est euthanasiée. </li><li> Effectuez une transection moelle du cou pour se assurer de la souris est euthanasié. Ne pas effectuer une dislocation cervicale car cela pourrait endommager la moelle épinière. </li><li> Pulvériser la souris avec 70% d&#39;éthanol pour mouiller les cheveux. </li><li> Utilisez des ciseaux Beaux pointus pour enlever la peau et les cheveux à l&#39;arrière de la souris pour exposer la colonne vertébrale d&#39;environ 1 lamina cervicale (C1) À lame sacrée 4 (S4). </li><li> En utilisant un scalpel à lame # 10, faire des incisions à gauche et à droite de la colonne vertébrale de la séparer de muscle et la graisse. Cela rendra le retrait de la moelle épinière beaucoup plus facile. </li><li> option: une rongeurs Luer courbes peuvent être utilisés pour ramasser loin chair supplémentaire. </li><li> Tout en maintenant le haut de la colonne vertébrale avec des pinces dentelées Graefe, insérez titane ciseaux courbés Vannas avec le côté bombé vers le haut dans la colonne vertébrale exposée au C1, en faisant attention à ne pas toucher la moelle épinière. </li><li> Faites glisser le titane ciseaux courbes Vannas tout le chemin à droite et faire une petite coupure. Un petit son crunch devrait être entendu et ressenti comme les ciseaux coupent les vertèbres. Répétez cette coupe sur le côté gauche de la corde. Veillez à ne pas aller trop vite ou de faire trop grand d&#39;une coupe car cela risque d&#39;endommager le cordon avec les ciseaux. </li><li> La seule lame doit pouvoir être soulevé avec la pince lorsque les côtés des vertèbres sont coupés. REPEAT cette étape pour chaque lamelle jusqu&#39;à S4, du maintien et tirez les vertèbres de la moelle épinière. REMARQUE: les vertèbres au-dessus du site de greffe viendra probablement une fois qu&#39;il est coupé au site de transplantation. Continuer la procédure de départ juste en dessous du site de transplantation. </li><li> option: jeter les vertèbres bas pour voir où le site de transplantation est et mesure et couper ~ 20 mm rostrale et caudale vers le site de transplantation. REMARQUE: Lors de la transplantation PNJ plus ne sera pas nécessaire que les PNJ transplantés généralement ne migrent pas à plus de 15 mm. Le montant de la moelle épinière nécessaire sera fonction des caractéristiques d&#39;expérimentation et de migration de type de cellule transplanté. Faire des coupes rostrale et caudale qui sont équidistants sur le site de transplantation permettra au site de transplantation d&#39;être placées plus facilement lors de l&#39;imagerie. </li><li> Avec un scalpel avec une lame # 11 Découpez soigneusement les ganglions sur la droite et à gauche de la face ventrale de la moelle épinière à partir de la fin rostrale. Ce wmalade permettre la moelle épinière à être présente dans les vertèbres ventral plus facilement. REMARQUE: Fait rapidement (étapes 01.07 à 01.11), la moelle épinière ne se dessèche pas. Cependant, PBS 1x peut être administré à la corde pour garder humide. </li><li> Inverser la souris et maintenez la souris vers le haut de sorte que la moelle épinière est orientée vers le bas. Retirer délicatement sur la moelle épinière en utilisant des pinces dentelées Graefe fermés. Sans entailler la moelle épinière, découpez soigneusement toutes les ganglions restants pour permettre la moelle épinière pour être levée dans une seule pièce intacte. </li><li> Assurez-vous que la moelle épinière est en RPMI-1640 et le placer sur la glace pour le transport vers le microscope 2P. </li></ol> 2. Préparation de la moelle épinière for Imaging <ol><li> Intégration de la moelle épinière dans l&#39;agarose <ol><li> Gardez la moelle épinière isolée dans réfrigérés RPMI-1640 sur la glace avant l&#39;imagerie. </li><li> Peser agarose (à basse température de gélification) et préparer une solution à 5% dans 5 ml de 1 x PBS. Micro-ondes la solution d&#39;agarose à 5% pendant 15 secondes pour dissoudre le agse leva et laissez refroidir la solution à 37 ° C. </li><li> Préparation de la moelle épinière en le plaçant sur une feuille de Parafilm avec la face ventrale vers le haut. </li><li> Pipet environ 5 ml de solution d&#39;agarose 5% par rapport à la face ventrale de la moelle épinière. Soit l&#39;agarose se solidifie par refroidissement à la température ambiante. Solidification complète prend environ 5 min. </li><li> Appliquer une légère couche de colle tissulaire à un couvercle carré glissement 22 mm. </li><li> Inversez la moelle épinière intégré, plaçant la face ventrale sur Parafilm. La face dorsale va maintenant être orientée vers le haut. Respecter la lamelle à la face dorsale, et plonger la moelle épinière / préparation couvercle intégré agarose de glissement dans IPMB pour solidifier l&#39;adhésif. Enlever l&#39;excédent de solidifié agarose en utilisant une lame de rasoir. </li></ol></li><li> Montage de la moelle épinière sur la platine du microscope <ol><li> Appliquez de la gelée de pétrole au fond de la lamelle. Ce sera de stabiliser la préparation pendant la perfusion. </li><li> Placer la préparation de la moelle épinière dans unImagerie bien sur la scène microscope avec la face ventrale vers le haut vers l&#39;objectif de trempage 25X. L&#39;imagerie bien construit sur mesure est d&#39;environ 20 mm de profondeur, 50 mm de long et 50 mm de diamètre. </li><li> Image tout superfusing la préparation avec réchauffé (37 ° C), oxygéné (95: 5 l&#39;oxygène: dioxyde de carbone carbogène) milieu RPMI-1640 sans sérum. <ol><li> Médias Préchauffer à 37 ° C dans le bain d&#39;eau et connectez-le à la pompe à tube en insérant le tube dans la bouteille de médias. </li><li> Maintenir la température du fluide à 37 ° C, un dispositif de chauffage au niveau du raccordement de la tubulure à la chambre. Médias à travers Superfuse bien à 3 ml / min en utilisant un tube relié à la pompe à tube (figure 1B). </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P imagerie de la moelle épinière ventrale <ol><li> Configuration de Microscope <ol><li> Acquérir des images à partir Thy1-EYFP la moelle épinière à l&#39;aide d&#39;un Ultra Chameleon Ti: Saphir laser réglé à 900 nm. Atténuer la puissance du laser à laspécimen à &lt;5% pour assurer un minimum de 16 phototoxicité. Maintenir la température de l&#39;oxygène en perfusant perfusé RPMI-1640 à une température constante de 37 ° C en utilisant un seul dispositif de chauffage de la solution en ligne pour assurer l&#39;imagerie stable, et pour empêcher la dérive des tissus et des dommages cellulaires. </li><li> Pour séparer eGFP et EYFP signal fluorescent, placer un dichroïque 520 nm bord unique et un nm bord unique diviseur 560 de faisceau dichroïque en série pour séparer 2P émission dans trois canaux, diviser volontairement l&#39;émission verte pour améliorer la visibilité. NOTE: Ce canal sont appelés bleu-vert (émission &lt;520 nm), vert-jaune (520-560 nm) et rouge (émission&gt; 560 nm). tubes photomultiplicateurs détectent la lumière émise dans chaque canal. </li></ol></li><li> Localiser les zones d&#39;imagerie d&#39;intérêt <ol><li> Utilisation de l&#39;oculaire et une source lumineuse de la lumière de champ, se concentrer l&#39;objectif de trempage à la partie ventrale de la moelle épinière pour définir un point de référence. </li><li> Assurez-vous que la source de lumière ambiante est éteint et swdémangeaison de 2P excitation en ouvrant l&#39;obturateur laser. </li><li> Si possible, lors de la recherche de tissus pour les zones d&#39;intérêt, utilisez un cadre de résolution inférieure, le volume plus élevé sans zoom numérique, et le taux de balayage plus élevé que lors de l&#39;acquisition des images finales. Paramètres typiques avec ce système lors de la recherche de tissus pour une région d&#39;intérêt sont: la résolution: 256 pixels; volume: x = 600 um, y = 600 um, z = 0 à 300 um. </li><li> Respecter les axones EYFP près du bord ventral de la moelle épinière. Signal de second harmonique à partir de collagène (bleu) sera plus brillante au bord de la moelle tissu de la moelle. Situez les axones EYFP juste dorsale au second signal harmonique à partir du collagène et le signal est EYFP visualisées dans le canal vert-jaune. </li><li> Localiser le site de transplantation dans le centre longitudinal de la préparation de la moelle épinière 14. Pour les souris un jour suivant la transplantation eGFP-NPC, localiser le site de transplantation en se concentrant la trajectoire du faisceau dans le plan z profondément dans les tissus. Le site de transplantation will varier légèrement entre les animaux mais il est généralement situé ~ 200 um du bord ventral. Respecter les grappes de eGFP-PNJ dans les secteurs de la substance blanche, plus proche des bords ventrales et latérales chez la souris après une jours post-transplantation. </li></ol></li><li> Acquisition d&#39;images finales <ol><li> Acquérir une résolution d&#39;image de 512 pixels; volume: x = 270 um, y = 212 um, et z = 100 um logiciel à l&#39;aide Slidebook 6. Compiler z-piles par l&#39;acquisition de plans focaux séquentiels dans 2,5 um incréments. </li><li> Effectuez un balayage entrelacé bidirectionnelle avec bon décalage pour assurer une quantification rapide de tous les objets qui migrent dans la moelle épinière. Assurez-vous que le taux idéal de trame d&#39;acquisition pour déterminer la vitesse cellulaire dans la moelle épinière est d&#39;environ 1 image / sec. REMARQUE: Les paramètres d&#39;imagerie peuvent être changés pour les préférences des utilisateurs individuels, tels que la cadence d&#39;acquisition, la résolution de l&#39;imagerie et des volumes d&#39;imagerie. Volumes d&#39;imagerie plus grands prendront généralement plus de temps à acquérir à un GIVen résolution. </li><li> Analyser, cultures, lisse et pseudocolor fichiers image Slidebook avec le logiciel d&#39;analyse d&#39;image tels que Bitplane Imaris 7,7. Produire finales vidéos time-lapse en peignant volumes d&#39;imagerie consécutifs à l&#39;aide d&#39;un processus automatisé dans Slidebook et Imaris. </li></ol></li></ol>

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The authors have no competing interests.

En temps réel 2P imagerie du tissu intact est nécessaire pour enquêter sur la cinétique et interactions NPC après la transplantation dans la moelle épinière de souris démyélinisée. Imagerie intravitale 2P est couramment utilisé pour déterminer la dynamique cellulaire sur la face dorsale de la moelle épinière chez les souris vivant, et a été utilisé pour étudier dorsale démyélinisation maladie démyélinisante 17-19. Toutefois, en raison des PNJ transplantées migrent à la matière blanche...

Des modèles murins de démyélinisation, y compris l&#39;encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et l&#39;infection par le virus intracrânienne neuroadapted de l&#39;hépatite de la souris (MHV), sont d&#39;excellents outils pour étudier les voies moléculaires et interactions cellulaires associés à la maladie. Ils ont mené et soutenu l&#39;efficacité des thérapies pharmaceutiques approuvé par la FDA, ciblant principalement la cessation de l&#39;auto-immunité et l&#39;inflammation 1. Cependant, une fois la remyélinisation endogène a échoué, les thérapies actuellement approuvés ne réparent pas efficacement les lésions démyélinisées dans le système nerveux central. Par conséquent, les thérapies de réparation axé à ce stade de la maladie sont décisifs pour le soulagement des symptômes chroniques et l&#39;amélioration de la qualité de vie. Récemment, des cellules précurseurs neurales (PNJ) sont venus à l&#39;avant-garde comme une modalité thérapeutique régénérative potentiel pour cibler des zones d&#39;inflammation et de démyélinisation. Plusieurs études ont mis en évidence la capacité des PNJ pour induire endógenonous remyélinisation et participer directement à la remyélinisation 2-8. Parce que les PNJ sont impliqués dans la remyélinisation directe, il est impératif de comprendre leur cinétique et les interactions avec des cellules endogènes après la transplantation. Après la transplantation, NPC migrent ventralement à des zones de blanc atteinte de la substance, puis rostrale et caudale par rapport au site de transplantation 5,9. La cinétique de la migration diffèrent en réponse aux signaux environnementaux; NPCs transplantées dans la moelle épinière non endommagés ont de plus grandes vitesses que PNJ transplantées dans la moelle épinière endommagée 6. Après une période de migration, transférés PNJ prolifèrent abondamment, à un taux supérieur dans une moelle épinière endommagée par rapport à une moelle épinière intacte 6. Enfin, la majorité des PNJ se différencier en oligodendrocytes et initier 4,6,9 de la remyélinisation directe. La lésion démyélinisée est complexe et peut comprendre une population diverse de cellules à divers stades d&#39;unctivation. Par exemple, une lésion active la sclérose en plaques (MS) peut comprendre une importante population de cellules T activées, la microglie et des macrophages M1 M1, mais une lésion chronique silencieux MS peut être composée essentiellement d&#39;astrocytes réactifs avec quelques cellules inflammatoires 10-13. En raison de la diversité des cellules effectrices, à deux photons (2P) imagerie dans des modèles murins de démyélinisation est un outil extrêmement utile pour aider à comprendre les interactions cellulaires locales au sein de la lésion. Dans la SEP et de nombreux modèles de recherche de MS largement utilisées, la majorité des lésions sont situées sur la face ventrale de la moelle épinière, une région inaccessible à l&#39;imagerie intravitale 2P en raison de la profondeur de la lésion et la forte teneur en lipides de la moelle épinière. Pour contourner ces problèmes et interactions étude cellule-cellule au sein de lésions long de la moelle épinière ventrale nous avons développé simple vivo 2P préparation d&#39;imagerie 6 ex. Cette étude fait suite à une précédente publication méthodes, qui a montréla procédure de transplantation protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) PNJ dites-vous dans la moelle épinière de souris après souche JHMV de démyélinisation MHV-induite 14. Souris âgées de cinq semaines sont infectées par JHMV et transplantées avec eGFP-PNJ au niveau thoracique 9 sur 14 jours post-infection. Le protocole présenté ici fournit des instructions détaillées sur la façon d&#39;extraire la moelle épinière, faire une préparation ex vivo agarose et image transplanté interactions eGFP-NPC avec la protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) des axones dites-vous. Les souris exprimant sous la EYFP Thy1 promoteur spécifique de neurones ont été utilisés dans cette procédure 15. Seuls quelques-uns des axones exprimer EYFP, le rendant utile pour l&#39;imagerie axones individuels. Ici, nous montrons la moelle épinière prélevés à sept jours post-transplantation; Toutefois, la moelle épinière peuvent être extraites à tout point de temps après la transplantation. Bien que nous montrons interactions avec des PNJ axones endommagés, notre protocole peut être utilisé en combinaison avec des marqueurs fluorescents génétiquesd&#39;autres types de cellules à examiner une multitude d&#39;interactions cellulaires qui se produisent tout au long de la moelle épinière de souris.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:381px;">Isoflurane, USP</td>
			<td style="width:175px;">Piramal Critical Care, Inc</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">14060-09</td>
			<td>sharp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel blade #10</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10010-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel handle</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Luer rongeurs</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">16001-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Graefe forceps</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Vannas scissors</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">15615-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">scalpel blade #11</td>
			<td style="width:175px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:136px;">10011-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:175px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">12-115F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A9414-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Parafilm</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Vetbond (tissue adhesive)</td>
			<td style="width:175px;">3M</td>
			<td style="width:136px;">1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">22 mm square cover slip</td>
			<td style="width:175px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">12-547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">25x dipping objective, 1.1 NA</td>
			<td style="width:175px;">Nikon</td>
			<td style="width:136px;">CFI Apo LWD 25XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Single inline solution heater</td>
			<td style="width:175px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:136px;">64-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">520 nm single-edge dichroic beam splitter</td>
			<td style="width:175px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF520-Di02-25x36</td>
			<td>Brightline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">560 nm single-edge dichroic beam splitter</td>
			<td style="width:175px;">Semrock</td>
			<td style="width:136px;">FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Brightline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">photomultiplier tubes</td>
			<td style="width:175px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:136px;">R928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">C/L variable-speed tubing pump</td>
			<td style="width:175px;">Masterflex</td>
			<td style="width:136px;">77122-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">digital thermometer</td>
			<td style="width:175px;">Comar Instruments</td>
			<td style="width:136px;">3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Coherent</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Slidebook 6 software</td>
			<td style="width:175px;">3i</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:381px;">Imaris 7.7 software</td>
			<td style="width:175px;">Bitplane</td>
			<td style="width:136px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

<html> Alors que le protocole d&#39;imagerie de la moelle épinière explantées peut être utilisé pour visualiser ne importe quel fluorescence de la moelle épinière, nos résultats démontrent représentatifs interactions avec eGFP-NPC-EYFP axones. Premièrement, nous montrons la préparation de la moelle épinière ventrale intégré à la figure 1A. Ensuite, on montre la configuration 2P du microscope et des éléments clés sur la figure 1B. La figure 2 illustre la fluorescence E...

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Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Une nouvelle préparation ex vivo pour l&#39;imagerie de la moelle épinière de souris. Ce protocole permet l&#39;imagerie à deux photons d&#39;interactions cellulaires vivants tout au long de la moelle épinière.

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.1K vues.  University of California, Irvine.  Une nouvelle préparation ex vivo pour l'imagerie de la moelle épinière de souris. Ce protocole permet l'imagerie à deux photons d'interactions cellulaires vivants tout au long de la moelle épinière. 

Vidéo: Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Recherche

Neurosciences

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Une procédure pour l&#39;implantation d&#39;une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie du cordon spinal de souris

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Diffusion d&#39;imagerie dans la moelle épinière cervicale Rat

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imagerie Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics dans les terminaux cône photorécepteur Axon de la rétine de souris

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imagerie fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris Utilisation du CLARITY / Technique CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Un In Vivo Duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminectomy et implantation de fenêtre de moelle épinière dans la souris

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...