Ce travail a été soutenu par la National Multiple Sclerosis Society accorde RG4595A1 / T à DD et les subventions des NIH / NINDS NS051470, NS052189 et NS066361 aux figures KA et des films adaptés et / ou tiré à part de Davalos et coll., J Neurosci Méthodes. Mars 2008 30; 169 (1) :1-7 Copyright 2008, avec la permission d&#39;Elsevier.

1. Construire le dispositif de stabilisation spinale <ol><li> Ordre de la mission STS-A Narishige Compact Pinces moelle épinière et le Narishige MA-6N adaptateur tenant la tête. </li><li> Conception sur mesure et faire une plaque en acier inoxydable de base pour tenir les deux parties Narishige dans l&#39;alignement de sorte que la tête de l&#39;animal est pris en charge alors que sa colonne vertébrale et la queue sont serrées. Gardez à l&#39;esprit que l&#39;ensemble du dispositif doit pouvoir être placés sous l&#39;objectif du microscope généralement sur une platine de microscope abaissé. </li></ol> 2. La chirurgie des animaux <ol><li> Pré-chauffer la chambre du microscope avec un dispositif de chauffage de l&#39;air et le maintenir à 37 ° C. </li><li> Peser les animaux et faire le mélange anesthésique en utilisant 100 mg de kétamine, 15 mg de xylazine et 2,5 acépromazine mg par kg de poids corporel, dilué dans une solution de NaCl 0,9% dans des conditions stériles. </li><li> Anesthésier les animaux par l&#39;injection de l&#39;anesthésique mélange (KXA) par voie intrapéritonéale. Pincer orteils doivent être effectuées régulièrement pour s&#39;assurer une anesthésie profonde à traversl&#39;expérience. Supplément avec la moitié de la dose initiale horaire ou selon les besoins. </li><li> Utilisez un tapis de petits animaux de chauffage à fournir un soutien thermiques tout en effectuant la procédure chirurgicale. </li><li> Appliquer une pommade artificielle des larmes sur les yeux pour éviter la déshydratation de la cornée et des dommages. </li><li> Rasez le dos de l&#39;animal d&#39;abord avec un dispositif de coupe et ensuite avec une lame tranchante pour supprimer complètement les cheveux de la zone autour de l&#39;incision. </li><li> Enlever les poils rasés et désinfecter la surface de la peau rasée avec un tampon d&#39;alcool. </li><li> Effectuer un petit (~ 1,5 cm) incision longitudinale de la peau sur le niveau souhaité vertébrale (vertèbres thoraciques représenté ici). </li><li> Exposer la musculature arrière par attentivement rétractant le tissu conjonctif sous-cutané. </li><li> Soigneusement séparée des muscles paravertébraux de la colonne vertébrale au niveau désiré. Effectuer le moins possible de détacher les incisions les muscles des deux côtés de chaque processus épineux et puis gratter les muscles détaché unchemin de la surface laminaire. </li><li> Choisissez la lame qui sera enlevé et préparer les sites d&#39;entrée pour les pinces de la colonne vertébrale de chaque côté de la colonne vertébrale, juste rostrale et caudale de la laminectomie. Soigneusement supplanter tissu musculaire pour faire quatre poches où les pinces seront insérés. </li><li> Soulevez la colonne vertébrale avec la denture droite pointe pince pour permettre l&#39;insertion sûre des courbes émoussées la pointe des ciseaux sous la lame sans toucher la moelle épinière. Effectuez la laminectomie par lentement couper les os d&#39;un côté puis de l&#39;autre côté. </li><li> Utilisez un coton-tige ou d&#39;insérer prédécoupés petits morceaux Gelfoam éponge de gélatine absorbable à côté de l&#39;incision pour limiter les saignements mineurs. Utiliser un petit bâtiment cauterizer pour contrôler les saignements supplémentaires si nécessaire. Utilisez préchauffé stériles fluide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) de laver les tissus. </li></ol> 3. Stabilisation de la colonne vertébrale et la préparation pour l&#39;imagerie in vivo <ol><li> Plac<html> e l&#39;animal sur un coussin d&#39;altitude sur la plaque de base du dispositif de stabilisation vertébrale et sécuriser la tête dans l&#39;adaptateur de tête de portefeuille. </li><li> Placer les pinces vertébrale de la mission STS-Un dispositif le long de l&#39;axe antéro-postérieur de l&#39;animal dans les poches pré-préparés flanquant la laminectomie (figure 1). Les deux pinces doivent être placés à un angle de ~ 45 ° par rapport à rostro-caudale de l&#39;animal axe pour laisser un espace suffisant pour faire baisser une lentille à immersion d&#39;eau au cours de la moelle épinière exposée (figure 1). </li><li> Placez la pince tiers de la mission STS-Un dispositif à la base de la queue pour le corps de l&#39;animal peut être en suspension dans l&#39;air après le retrait de la plaquette d&#39;altitude pour la durée des expériences d&#39;imagerie (figure 1). </li><li> Construire un petit puits d&#39;Gelseal (Amersham Biosciences Corp) autour de la moelle épinière exposés afin de faciliter le maintien de la moelle épinière dans l&#39;ACSF et l&#39;immersion de l&#39;objectif du microscope dans cette solution pour l&#39;imagerie in vivo. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 4. Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris avec la microscopie à deux photons <ol><li> Transfert de l&#39;animal sur le dispositif de stabilisation spinale intérieur de la chambre préchauffé couvrant le microscope et le fixer sur une platine de microscope abaissé plaçant la laminectomie droites sous la lentille (figure 1). </li><li> Une lentille Lower immersion dans l&#39;eau avec précaution dans la solution ACSF veillant à ce qu&#39;elle ne touche pas les pinces épinière ou du Gelseal. </li><li> Utilisez épifluorescence pour identifier la zone d&#39;intérêt et se concentrer sur elle. Passer en mode balayage laser et d&#39;effectuer l&#39;imagerie in vivo en utilisant l&#39;appropriée à deux photons de longueur d&#39;onde d&#39;excitation laser, dichroïques et de filtres passe-bande pour les fluorophores présents dans le tissu imagée. </li></ol> 5. Imagerie répétitive et soins post-opératoires <ol><li> A la fin des expériences d&#39;imagerie, retirez la souris à partir du dispositif de stabilisation vertébrale et essuyez soigneusement le Gelseal de la zone autour de la laminectomie.Nettoyez bien la région. </li><li> Restaurer et suture les muscles du dos au cours de la laminectomie. </li><li> Restaurer et suture la peau au cours de la laminectomie, il tampon avec la bétadine. </li><li> Fournir une solution de lactate de Ringer ml (Baxter Healthcare) comme un complément nutritif et l&#39;hydratation, ainsi que le traitement antalgique par voie sous cutanée (0,1 mg / kg de buprénorphine). </li><li> Administrer un traitement antiseptique par voie intrapéritonéale (0,03 ml par souris, 2,27% enrofloxacine solution injectable antibactérien). </li><li> Placer sur des animaux d&#39;un coussin chauffant jusqu&#39;à la guérison complète de l&#39;anesthésie et ensuite on la maison individuelle. </li><li> Répétez l&#39;administration antiseptique quotidien pour les 3-5 premiers jours après la chirurgie et le traitement antalgique toutes les 8-12 heures pendant 2-3 jours post-opératoire. Surveiller les animaux quotidiennement pour assurer un comportement normal et le rétablissement complet. </li><li> Pour re-imagerie à travers la laminectomie même, la réouverture de la peau suturée et les muscles et répéter les étapes décrites dans les sections 2 - 4. </li><li> Re-localiser les précéously imagé zone en utilisant la vascularisation artérielle comme une carte, comme décrit précédemment 10. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Toutes les procédures animales ont été réalisées sous les directives établies par les soins des animaux et des comités institutionnels Utiliser à l&#39;Université de Californie, San Francisco et sont conformes à la réglementation fédérale. Une image du dispositif de stabilisation vertébrale et un schéma montrant le positionnement de la souris sur le périphérique sous une lentille de microscope est montré dans la figure 1. Permettre une salle adéquate pour les mouvements de la respiration au-dessous du corps de l&#39;animal assure la stabilité de l&#39;imagerie in vivo dans la moelle épinière. La figure 2 montre la relation étroite entre les microglies et les vaisseaux comme il a été imagé in vivo dans la moelle épinière des CX3CR1 GFP / + souris transgéniques 18, dans lequel les microglies sont étiquetés avec la GFP endogène. Figure 3 montre des exemples répétitifsl&#39;imagerie in vivo tel qu&#39;il a été effectué dans les mêmes régions de la moelle épinière chez la souris exprimant une protéine fluorescente dans des axones épinière (YFP-H ligne 3) et la microglie (CX3CR1 dans la GFP + / souris). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig1.jpg" /> Figure 1. Stabilisation de la colonne vertébrale de souris pour l&#39;imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons. (A) une plaque personnalisée fait d&#39;acier de base est utilisé pour soutenir et aligner la mission STS-A Narishige compacte pinces de la moelle épinière et la MA-6N Narishige tête de la tenue adaptateur comme indiqué ici. (B) Le positionnement correct de l&#39;adulte de souris transgéniques anesthésiés avec un anesthésique KXA sur le dispositif de stabilisation vertébrale. L&#39;insert montre le placement des pinces épinière immédiatement rostralement et caudalement à la laminectomie et les tissus de la moelle épinière exposées. &lt;img alt = &quot;Figure 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/2760/2760fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Dans l&#39;imagerie in vivo des cellules microgliales haute densité et des vaisseaux sanguins dans la moelle épinière des souris anesthésiées. Projections, mais non-alignés z-piles de (A) très dense GFP-positives microglie (vert) dans la moelle épinière d&#39;un CX3CR1 GFP / souris + à proximité de vaisseaux sanguins (rouge, marqué avec injection IV de la rhodamine dextran). (B) l&#39;image à fort grossissement étiquetés comme en (A) d&#39;une seule cellule microgliale attaché à la paroi d&#39;un vaisseau sanguin avec les processus étendus autour du navire et vers le parenchyme de la moelle épinière. Barres d&#39;échelle, 10 microns. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/2760/2760fig3.jpg" /> Figure 3. Répétitifs imagerie in vivo des mêmes segments axonaux et microglies comme ils ont été relocalisés et reimaged dans la moelle épinière des souris anesthésiées à des jours différents. (A) YFP-Lab<html> axones ELED aux jours 0 et 5. (B). Les mêmes structures vasculaires et les cellules microgliales autour d&#39;eux imagé in vivo dans la moelle épinière des CX3CR1 GFP / souris + aux jours 0 et 1. Barres d&#39;échelle, 10 microns. Vidéo 1. Séquence timelapse Représentant acquises in vivo de la moelle épinière de souris. Cette séquence montre en détail la dynamique processus de fines microgliales (vert) et leurs interactions avec le système vasculaire (rouge, marqué avec injection IV de la rhodamine dextran) dans le temps dans un tissu densément peuplées avec des structures fluorescentes. Les images brutes ont été corrigées pour que le bruit de fond, la luminosité et le contraste et le film a été construit par timelapse z projetant des piles d&#39;images séquentiellement acquises, sans alignement de l&#39;image, avec une moyenne ou z-sélection des avions individuels. Les vaisseaux sanguins passent par une gamme similaire de plans z que les images de la microglie. Profondeur de plan Z: 38 um.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov &quot;&gt; Cliquez ici pour regarder le film. Séquence Timelapse Movie 2. Démontrant la stabilité de la méthode brute d&#39;imagerie à l&#39;échelle d&#39;un seul z-plan. L&#39;acquisition rapide de la même et unique plan z dans la moelle épinière des souris GFP CX3CR1 / + mis sur le dispositif de stabilisation vertébrale sous anesthésie KXA, démontre le déplacement d&#39;image minimale entre les images consécutives à une vitesse de balayage de 1 image / s qui est plus rapide que le rythme respiratoire de la souris. Le déplacement mineure résiduelle est probablement dû au battement de coeur. <a alt="Movie 2" href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2760/Davalos_Movie_2.mov">Cliquez ici pour regarder le film.</a>

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	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Takano, T., Han, X., Deane, R., Zlokovic, B., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+astrocytic+Ca2++signaling+and+the+microvasculature+in+experimental+mice+models+of+Alzheimer's+disease.">Two-photon imaging of astrocytic Ca2+ signaling and the microvasculature in experimental mice models of Alzheimer's disease.</a> Ann. N. Y. Acad. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=vivo+imaging+of+germinal+centres+reveals+a+dynamic+open+structure.">vivo imaging of germinal centres reveals a dynamic open structure.</a> Nature. 446, 83-87 (2007).</li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

La méthode décrite ici permet de stable et répétitive en imagerie in vivo de la fluorescence densément peuplées structures cellulaires dans la moelle épinière des souris anesthésiées à l&#39;aide microscopie à deux photons. La stabilité obtenue est le résultat d&#39;un instrument fait sur mesure et une stabilisation de la colonne vertébrale protocole anesthésique qui réduit d&#39;artefact mouvement respiratoire induite. Le dispositif de stabilisation vertébrale permet de répit sous l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Rhodamine B dextrane </td><td> Invitrogen </td><td> D1841 </td><td> 70 kDa, dilué dans ACSF (3% p / v) </td></tr><tr><td> Kétamine HCl </td><td> Bionichepharma </td><td> NDC Non: 67457-001-10 </td><td> Injectable, 50mg/ml </td></tr><tr><td> Anased </td><td> Lloyd Labs </td><td> NADA Non: 139-236 </td><td> Injectables xylazine, 20mg/ml </td></tr><tr><td> Acépromazine </td><td> Vedco </td><td> NADA Non: 117-531 </td><td> Injectable, 10mg/ml </td></tr><tr><td> Les larmes artificielles onguent </td><td> Phoenix pharmaceutiques </td><td> NDC Non: 57319-760 - 25 </td><td> Lubrifiant </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Fisher </td><td> 19-061617 </td><td></td></tr><tr><td> McPherson Westcott Ciseaux </td><td> Précision du Monde Instruments </td><td> 555500S </td><td> Courbé, émoussé pointe ciseaux </td></tr><tr><td> Pince droite </td><td> Précision du Monde Instruments </td><td> 555047FT </td><td> Pince la pointe crantée </td></tr><tr><td> Petit bâtiment cautériser </td><td> Outils Fine Science </td><td> 18000-00 </td><td></td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pharmacia, Pfizer Inc </td><td> Mixer Mill MM400 </td><td></td></tr><tr><td> Compact de la moelle épinière pinces </td><td> Narishige </td><td> STS-A </td><td></td></tr><tr><td> Adaptateur de tête tenant </td><td> Narishige </td><td> MA-6N </td><td></td></tr><tr><td> Gelseal </td><td> Amersham Biosciences Corp </td><td> 80-6421-43 </td><td></td></tr><tr><td> Ringer </td><td> Baxter Healthcare &lt;/ Td&gt; <td> 2B8609 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenex </td><td> Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc </td><td> NDC Non: 12496 - 6757-1 </td><td> La buprénorphine, injectables </td></tr><tr><td> Baytril </td><td> Bayer </td><td> NADA 140-913 </td><td> Enrofloxacine, injectable antibactérien 2,27% (20ml) </td></tr><tr><td> Coussin chauffant - Grand </td><td> Outils Fine Science </td><td> 21060-10 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy

L&#39;imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons dans une souris qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer des protéines fluorescentes dans des types cellulaires 2-3 a sensiblement élargi notre connaissance des processus physiologiques et pathologiques dans de nombreux tissus in vivo 4-7. Dans les études sur le système nerveux central (SNC), il ya eu une large application de l&#39;imagerie in vivo dans le cerveau, qui a produit une pléthore de nouvelles et les résultats souvent inattendus sur le comportement des cellules comme les neurones, les astrocytes, la microglie, sous conditions physiologiques ou pathologiques 8-17. Toutefois, des complications essentiellement techniques ont limité la mise en œuvre de l&#39;imagerie in vivo dans des études de la moelle épinière de souris vivante. En particulier, la proximité anatomique de la moelle épinière vers les poumons et le cœur génère des artefacts importants mouvements qui permet l&#39;imagerie de la moelle épinière qui vivent une tâche difficile. </p&gt; Nous avons développé une nouvelle méthode qui permet de surmonter les limitations inhérentes à l&#39;imagerie de la moelle épinière par la stabilisation de la colonne vertébrale, réduisant respiratoires induites par les mouvements et en facilitant ainsi l&#39;utilisation de la microscopie à deux photons à l&#39;image de la moelle épinière de souris in vivo. Ce résultat est obtenu en combinant un dispositif de stabilisation spinale personnalisé avec une méthode d&#39;anesthésie profonde, résultant en une réduction significative des maladies respiratoires induites par les mouvements. Ce protocole vidéo montre comment exposer une petite zone de la moelle épinière qui vivent peut être maintenu sous des conditions physiologiques stables sur de longues périodes de temps en gardant une lésion des tissus et des saignements au minimum. Représentant des images brutes acquises en détail in vivo à haute résolution de la relation étroite entre les microglies et la vascularisation. Une séquence timelapse montre le comportement dynamique des processus microgliales dans la moelle épinière de souris vivante. Par ailleurs, une analyse continue de la même z-cadre démontrents la stabilité exceptionnelle que cette méthode peut réaliser pour générer des piles d&#39;images et / ou des films timelapse qui ne nécessitent pas d&#39;alignement d&#39;image post-acquisition. Enfin, nous montrons comment cette méthode peut être utilisée pour revisiter et réimager la même zone de la moelle épinière au timepoints plus tard, permettant des études longitudinales de cours de processus physiologiques ou pathologiques in vivo.

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

Un protocole minimalement invasive pour stabiliser la colonne vertébrale de souris et d&#39;effectuer répétitives<em&gt; In vivo</emImagerie&gt; moelle épinière en utilisant microscopie à deux photons est décrit. Cette méthode combine un dispositif de stabilisation vertébrale et un régime d&#39;anesthésie afin de minimiser les mouvements induits par des voies respiratoires et de produire des données d&#39;imagerie brutes qui ne nécessitent pas d&#39;alignement ou d&#39;autres post-traitement.

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

23.7K vues.  University of California, San Francisco. Un protocole minimalement invasive pour stabiliser la colonne vertébrale de souris et d'effectuer répétitives In vivo moelle épinière en utilisant microscopie à deux photons est décrit. Cette méthode combine un dispositif de stabilisation vertébrale et un régime d'anesthésie afin de minimiser les mouvements induits par des voies respiratoires et de produire des données d'imagerie brutes qui ne nécessitent pas d'alignemen...

Vidéo: In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Recherche

Neurosciences

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopie à deux photons de terminaisons nerveuses dans la peau simples

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Une procédure pour l&#39;implantation d&#39;une chambre pour la colonne vertébrale longitudinale<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie du cordon spinal de souris

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanée à deux photons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagerie d&#39;entrées synaptiques et les cibles postsynaptiques dans le Cortex Souris rétrosplénial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal cord of the majority of these fiber systems have not been thoroughly investigated in any species. Serotonergic fibers, which project to the spinal cord, have been studied in rats and opossums on histological sections and their functional significance has been deduced based on their fiber termination pattern in the spinal cord. With the development of CLARITY and CUBIC techniques, it is possible to investigate this fiber system and its distribution in the spinal cord, which is likely to reveal previously unknown features of serotonergic supraspinal pathways. Here, we provide a detailed protocol for imaging the serotonergic fibers in the mouse spinal cord using the combined CLARITY and CUBIC techniques. The method involves perfusion of a mouse with a hydrogel solution and clarification of the tissue with a combination of clearing reagents. Spinal cord tissue was cleared in just under two weeks, and the subsequent immunofluorescent staining against serotonin was completed in less than ten days. With a multi-photon fluorescent microscope, the tissue was scanned and a 3D image was reconstructed using Osirix software.

Supraspinal projections are important for pain perception and other behaviors, and serotonergic fibers are one of these fiber systems. The present study focused on the application of the combined CLARITY/CUBIC protocol to the mouse spinal cord in order to investigate the termination of these serotonergic fibers.

Imagerie fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris Utilisation du CLARITY / Technique CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imagerie de l’activité neuronale dans le Cortex somatosensoriel primaire utilisant Thy1-GCaMP6s des souris transgéniques

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

Visualisation de la protéine Kinase Une activité chez des souris à behaving à l'aide de la microscopie d'imagerie à deux photons in vivo fluorescence à vie

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...