Cette méthode permet l’examen de la dynamique protéique in vivo dans le système nerveux central intact pour répondre aux questions en neurosciences et immunologie. Les principaux avantages de cette procédure sont une excellente stabilité de mouvement pour l’acquisition d’image, un temps chirurgical bref, une exposition réduite de l’opérateur à l’anesthésie gazeux, et des plaques arrière personnalisables peu coûteuses. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car il est difficile d’enlever l’os sans endommager le tissu étroitement sous-jacent de système nerveux pendant les étapes de laminectomie de la procédure.
Avant de commencer la procédure, utilisez un logiciel de conception assisté par ordinateur 3D pour créer un modèle aux dimensions indiquées. Nous avons donc un objet, qui est l’objet tridimensionnel, que c’est ce que nous pouvons commencer par. Ce que je peux alors faire, c’est que nous pouvons mettre des paramètres sur cela pour la version d’impression.
Donc, si j’ouvre Modifier cela, aller dans Advanced, ouvrir une fenêtre qui me permet de regarder tous ces paramètres. Réglez la température de la buse à 205 degrés Celsius, la température du lit à 45 degrés Celsius et la vitesse d’impression à 45 millimètres par seconde sur une imprimante 3D. Utilisez une buse chaude d’enchevêtrement de 0,4 millimètre et une hauteur de couche de 0,2 millimètre pour imprimer les plaques arrière.
Évaluez ensuite visuellement les plaques arrière imprimées pour leur intégrité structurale. Les défaillances structurelles brutes indiquent des défauts d’impression. Lorsque les plaques arrière sont prêtes, placez la tête d’une souris anesthésiée de huit à 12 semaines sur un coussin chauffant entre les barreaux d’oreille d’un restrainer chirurgical et appliquez de la pommade sur les yeux de l’animal.
Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement d’onteil, utilisez une lame numéro 11 pour faire un rostral de 1,5 centimètre à l’incision caudale de midline au-dessus de la région lombaire supérieure thoracique inférieure et séparez la peau du péritoine. Utilisez des forceps pour peler tout tissu conjonctif transparent restant sous la peau pour exposer la musculature superficielle. Déplacez les muscles avec une lance chirurgicale en mousse ainsi que le muscle plus profond restant de la vertèbre cible.
Pour créer un siège pour la plaque arrière, effacer le muscle de l’aspect postérieur du thoracique 11 et l’aspect antérieur du thoracique 13. Utilisation de forceps pour enlever le muscle restant des tendons si nécessaire. Lorsque tout le muscle a été enlevé, couper soigneusement les tendons avec des forceps jusqu’à ce que suffisamment d’espace pour visualiser et manipuler la moelle épinière est atteint.
Confirmez que le dura mater de l’espace intervertébral, l’os laminaire semi-transparent, le vaisseau sanguin superficiel central sous l’os et l’artère rayonnante antérieure sont clairement visibles. Mouillez la région avec du liquide rachidien cérébral artificiel chaud et utilisez une micro-perceuse pour amincir l’os laminaire à l’aide de traits droits parallèles au long axe de la moelle épinière. Saisissant doucement le processus épineux superficiel avec des forceps, soulevez la vertèbre.
L’os doit se soulever facilement. Utilisez les forceps numéro quatre pour effacer les éclats d’os, en contrôlant tout saignement avec une lance chirurgicale et une pression douce et constante si nécessaire. Rincez ensuite le tissu avec du liquide céphalo-rachidien artificiel chaud.
Pour l’implantation de verre de couverture, appliquez doucement un verre de couverture de borosilicate de trois millimètres au cordon exposé. Utilisez une petite spatule pour appliquer 39 degrés Celsius réchauffé 2% agarose sur le bord du verre et permettre à l’action capillaire de dessiner l’agarose sous la surface de verre de couverture. Appliquer l’adhésif tissulaire sur les processus articulaires osseux exposés de la vertèbre adjacente intacte au niveau thoracique 11 et 13 épines vertébrales.
Appliquer un adhésif tissulaire supplémentaire dans un anneau autour du site de laminectomie sur le tendon adjacent et le processus transversal. Ensuite, utilisez une nouvelle spatule pour appliquer du ciment dentaire mélangé avec de l’accélérant sur la couche adhésive tissulaire et placez une plaque arrière sur le champ chirurgical centré sur la fenêtre en verre de couverture. L’application de plusieurs couches minces de ciment dentaire entraîne une adhérence plus forte plaque arrière, mais assurez-vous de placer la plaque arrière rapidement avant que le ciment dentaire commence à sécher.
Après avoir permis au ciment dentaire de guérir pendant 10 minutes, remplissez la base intérieure et le dessous de la place arrière avec un adhésif supplémentaire. L’application du ciment dentaire en couches minces peut aider à réduire le risque de propagation du ciment au verre de couverture et à l’agarose, ce qui peut compromettre l’ensemble du protocole. Lorsque le ciment dentaire a séché, appliquez un support de plaque arrière fourchue à la position appropriée au-dessus de la fenêtre et vissez la plaque arrière dans le support de la plaque arrière.
Appliquez ensuite de la solution saline sur la plaque arrière pour vérifier la fuite. L’animal et la plate-forme chirurgicale peuvent ensuite être transférés à la table optique d’un microscope à deux photons pour l’imagerie à travers la fenêtre en verre de couverture. Dans cette expérience représentative, le claudin-5 positif d’EGFP a été visualisé dans les jonctions serrées fluorescentement étiquetées dans un plexus vasculaire.
La délimitation claire des structures de jonction serrées dans la projection Z indique que le déplacement minimal d’image de XY est produit après une laminectomie réussie, le placement de fenêtre, et l’implantation de plaque arrière. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que cette microchirurgie est difficile et peut prendre du temps à maîtriser. Cependant, une fois maîtrisée, cette chirurgie peut être effectuée en environ 30 minutes.
Après cette procédure, d’autres méthodes, comme deux microscopies photons et l’imagerie in vivo, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur le remodelage neurovasculaire et d’autres processus de la maladie impliquant la moelle épinière.
