This work was supported in part by the NIH/NHBI (U01 HL099776-5), the NIH Director&#8217;s New Innovator Award (DP2 OD004411-2), the California Institute of Regenerative Medicine (RB3-05129), the American Heart Association (14GRNT18630016) and the Endowed Faculty Scholar Award from the Lucile Packard Foundation for Children and the Child Health Research Institute at Stanford (to SMW). We also acknowledge funding support from the American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000, and National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

REMARQUE: les informations fournisseur pour tous les réactifs utilisés dans ce protocole a été indiqué dans le Tableau 1 et Liste des matériaux. Toutes les solutions et équipements entrant en contact avec les cellules doivent être stériles, et la technique aseptique doit être utilisée en conséquence. Effectuer toutes les incubations de culture dans un humidifié à 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, sauf indication contraire. Dans ce protocole, tous les différenciations sont réalisées dans des plaques 6 puits, dans lequel les hiPSCs sont ensemencées. Suite à la différenciation et la purification, les cellules peuvent être dissociés et réétalées pour une utilisation en aval. 1. Préparation Matières <ol><li> Pour le moyen E8, préparer une solution de stock pour chaque composant du milieu (NaHCO 3, l&#39;acide L-ascorbique 2-phosphate, sélénite de sodium, de la transferrine, de l&#39;insuline, FGF2, TGFB1) et stocker les solutions à -20 ° C. Ajouter la quantité appropriée de solutions d&#39;achat d&#39;actions à la bouteille de DMEM / F12 et filtrer à stériliser. La solution concentration et la configuration de réaction pour les composantes du stock et support E8 peuvent être trouvés dans le tableau 1. </li><li> Pour la solution de matrice extracellulaire, décongeler la matrice de membrane basale (fournis habituellement à 10 mg / ml) à 4 ° CO / N. Matrigel est couramment utilisé pour la culture de cellules souches pluripotentes parce que les cellules souches pluripotentes humaines peuvent bien adhérer à ce produit en utilisant l&#39;alpha-6-bêta-1 intégrine 9. Une fois décongelé, assurez 2,25 mg (250 pi) échantillons sur la glace à l&#39;aide de glace conseils et des tubes de pipette froid et stocker les aliquotes à -80 ° C. <ol><li> Lorsque préenduction plaques avec ECMS, décongeler et aliquoter la solution de la matrice extracellulaire (ECMS) sur la glace. Mélanger le CEEM et du milieu DMEM / F12 glacée dans un rapport de 1: 200 sur de la glace. Gardez au frais pour éviter la solidification prématurée ECMS. </li></ol></li><li> Pour le RPMI / B27 sans produit de l&#39;insuline, ajouter 10 ml de B27 Minus insuline dans 500 ml de milieu RPMI. </li><li> Pour le RPMI / B27 (avec l&#39;insuline) moyen, ajoutez 10 ml de supplément de B27 (avec insulin) et 5 ml d&#39;antibiotique Pen-strep dans 500 ml de milieu RPMI. </li><li> Pour le moyen faible taux de glucose, ajouter 10 ml de supplément de B27 et 5 ml d&#39;antibiotique Pen-streptocoque dans 500 ml de milieu RPMI sans glucose. </li><li> Pour le support / de cryoconservation de congélation, mélanger sérum bovin foetal avec du diméthylsulfoxyde (DMSO) à un mélange 9: 1 rapport. Le milieu de congélation peut être stocké jusqu&#39;à un mois à 4 ° C. REMARQUE: Tous les médias doivent être filtrés et stockés dans 4 ° C et utilisés dans deux semaines, sauf indication contraire. Tous les volumes de réactif / solution utilisée ci-dessous sont destinés à un seul puits dans une plaque à 6 puits, sauf indication contraire. </li></ol> 2. Pré-revêtement 6 puits Plaques avec ECMS <ol><li> Assurez ECMS en mélangeant sous-sol matrice de membrane (par exemple, Matrigel) avec les médias DMEM / F12 glacée dans un rapport de 1: 200, puis appliquer 2 ml d&#39;ECMS fraîchement préparé dans chaque puits pour une plaque à 6 puits. Chaque puits dans une plaque à 6 puits recevra environ 90 mg ECMS. </li><li> Incuber l&#39;ECMS plaques recouvertes pendant 1 heure à 37 ° C. Immédiatement avant étalement des cellules, aspirer DMEM solution / F12 de chaque puits. Les plaques seront alors prêt à recevoir des cellules. </li></ol> 3. décongélation des surgelés hiPSCs NOTE: Suivre de près cette procédure car elle peut conduire à la culture optimale et la différenciation en aval de hiPSCs dans hiPSC-CMS suivant le cycle gel / dégel. <ol><li> Décongelez un flacon de hiPSCs pour chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits. Préparer un tube de 15 ml conique avec 9 ml de milieu E8 froid avec inhibiteur de ROCK (10 M) pour chaque flacon. inhibiteur de ROCK améliore hiPSCs survie après cryoconservation 10. Conserver les flacons dans 37 ° C bain d&#39;eau à dégeler les cellules jusqu&#39;à une participation d&#39;environ 5 mm de cristaux de glace de diamètre est à gauche. </li><li> Pulvériser l&#39;extérieur des flacons de 70% d&#39;éthanol. Essuyez les flacons avec du papier de soie avant de les déplacer à la hotte laminaire stérile. </li><li> Transférer les cellules dans le tube conique préparé. Rincer til flacon une fois avec 500 ul de milieu E8 et transférer le milieu contenant les cellules décongelées dans le même tube conique. Centrifugeuse à température ambiante pendant 4 min à 200 x g. </li><li> Aspirer le surnageant après centrifugation et remettre en suspension doucement le culot de cellules avec 2 ml de milieu avec E8 inhibiteur de ROCK (10 uM). Transférer les cellules remises en suspension à un puits d&#39;une plaque à 6 puits pré-revêtu d&#39;ECMS. </li><li> Remplacez le support avec le milieu E8 sans inhibiteur de ROCK après 24 h de culture. Les cellules doivent ont adhéré à cette époque. </li></ol> 4. Le repiquage du hiPSCs <ol><li> Typiquement, hiPSCs de passage après avoir atteint 75% -80% de confluence dans une plaque à 6 puits. Aspirer le milieu de culture. Laver rapidement les puits avec 1 ml de solution stérile, RT PBS. Aspirer PBS. <ol><li> Ajouter 500 pi de EDTA 0,5 mM ou une solution de détachement cellulaire 1x (par exemple, Accutase) et incuber pendant 1-7 min à température ambiante. Moment approprié pour EDTA incubation varie avec la ligne hiPSC. Attendez-vous à voir visibles curling or épaississement de colonies sur les bords, comme cela indique que la solution de EDTA ou de détachement cellulaire est prêt à être retiré. </li></ol></li><li> Aspirer la solution d&#39;EDTA ou le détachement de la cellule. Ajouter 1 ml de milieu supplémenté avec E8 inhibiteur de ROCK 10 uM. Déplacer colonies hiPSC dans le puits par pipetage de haut en bas plusieurs fois et la pulvérisation de colonies avec une pipette P1000. Colonies doivent être divisées en 5-10 amas de cellules après l&#39;achèvement. </li><li> Transférer les colonies qui sont en suspension dans 1 ml de milieu avec E8 inhibiteur de ROCK dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Perturber les grands amas de cellules en petits bouquets dans le milieu E8. Ajouter un volume approprié de E8 support avec un inhibiteur de la suspension de cellules pour diluer les cellules. Le volume de support de dilution pour ajouter dépend de la densité cellulaire et le nombre de puits à ensemencer. Idéalement, un seul, 80% de confluence et de hiPSCs doit être dilué 1:12. <ol><li> Ajouter 11 ml de milieu E8 avec inhibiteur de ROCK aux 1 ml existants de CEll solution dans ladite 15 ml tube conique pour obtenir une dilution 1:12. </li></ol></li><li> En outre triturer les amas de cellules en petits fragments de cellules (environ 50 à 200 cellules dans chaque fragment est le meilleur). Évitez de trop trituration car cela réduit la survie des cellules. </li><li> Aspirer ECMS des plaques pré-enduits et ajouter 2 ml de cellules remises en suspension dans chaque puits. Environ 100 000 cellules par puits d&#39;une plaque à 6 puits est idéal. Objectif pour distribuer les cellules uniformément autour du puits afin d&#39;éviter le regroupement des cellules dans le centre du puits. </li><li> Après 24 heures de culture, remplacer le milieu avec un milieu E8 sans inhibiteur de ROCK. Changer le milieu de culture toutes les 24 heures jusqu&#39;à ce que les cellules deviennent confluentes à 80%. Ensuite, les cellules sont prêtes à nouveau passage. Cela prend habituellement 3-6 jours entre les passages pour atteindre 80% de confluence. </li></ol> 5. hiPSCs de congélation REMARQUE: suivre de près cette procédure car elle peut conduire à la culture optimale et la différenciation en aval de la hancheSC en hiPSC-CMS suivant le cycle gel / dégel. <ol><li> Étiqueter tubes cryogéniques avec le nom de lignée cellulaire, type de cellule, le nombre de passages, et la date de congélation. En règle générale, utiliser un flacon pour chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits. Préparer un tube conique de 15 ml remplie de 9 ml de milieu E8 avec inhibiteur de ROCK (10 M). Préparer le milieu de congélation avec 90% de FBS et 10% de DMSO, et maintenir le milieu à 4 ° C jusqu&#39;au moment de servir. </li><li> Aspirer le milieu de culture, ajouter 500 ul d&#39;EDTA 0,5 mM ou une solution de détachement cellulaire 1x et incuber pendant 2-7 min à température ambiante. La durée de l&#39;exposition de la solution d&#39;EDTA ou détachement cellulaire varie de lignée cellulaire de la lignée cellulaire. </li><li> Aspirer EDTA ou une solution de détachement cellulaire. Ajouter 1 ml de milieu E8. </li><li> Déplacer colonies hiPSC dans le puits par pipetage de haut en bas et de la pulvérisation hors des colonies avec une pipette P1000. Colonies ne doivent pas être divisés en plus petits que 100 amas de cellules. Transférer les cellules en suspension dans le tube conique préparée contenant E8. Centrifugeuse à RT pendant 4 min à 200 x g. </li><li> Aspirer le surnageant et ajouter 500 ul de milieu de congélation froid au culot. Reprendre le culot en pipetant une à deux fois. La survie des cellules est améliorée en gardant les cellules en grandes touffes. </li><li> Transférer les cellules remises en suspension dans un tube cryogénique marqué. Déplacer rapidement les flacons dans un récipient contenant de l&#39;isopropanol congélation, ce qui permettra un refroidissement progressif. Conserver le récipient avec des cellules à -80 ° C pendant 24 heures, puis de transférer les cellules à l&#39;azote liquide pour le stockage à long terme. </li></ol> 6. cardiaque Différenciation des iPSC humaines REMARQUE: Tous les médias devraient être au moins à la température ambiante lorsqu&#39;il est ajouté. <ol><li> Après dissociation avec une solution d&#39;EDTA ou 1x détachement cellulaire, ensemencer environ 100 000 iPSCs humaines sur CEEM revêtues de plaques de culture à 6 puits de différenciation (mêmes étapes que les procédures de passages des cellules). Lorsque les cellules atteignent 85% de confluence, changer de support de RPMI / B27 sans milieu de l&#39;insuline avec 6inhibiteur de GSK3-bêta uM CHIR99021 (CHIR) et maintenir pendant 48 heures. </li><li> Après 48 heures, remplacer le milieu de culture contenant avec CHIR-RPMI / B27 sans milieu de l&#39;insuline et laisser seul pendant 24 heures (jusqu&#39;à ce jour 3). </li><li> Au jour 3, modifier le support RPMI / B27 sans insuline avec 5 uM Wnt inhibiteur IWR1 et maintenir pendant 48 heures (jusqu&#39;à ce jour 5). REMARQUE: Wnt inhibition peut également être tenté d&#39;utiliser d&#39;autres composés à petites molécules, comme décrit dans des études antérieures 11. IWR1 a été sélectionné par rapport aux autres inhibiteurs de Wnt à petites molécules en raison de la gamme plus large dans laquelle il a été montré pour être efficace dans l&#39;inhibition de la signalisation Wnt 11. </li><li> Au jour 5, changer le milieu revenir à RPMI / B27 sans milieu de l&#39;insuline et laisser reposer pendant 48 heures (jusqu&#39;à ce jour 7). </li><li> Au jour 7, remplacer le milieu par du milieu RPMI / B27 (à l&#39;insuline) et remplacer milieu tous les 3 jours par la suite avec le même milieu. Battements spontanés des cardiomyocytes doit d&#39;abord être visible à environ 8 jours à jour10. </li></ol> 7. Purification de cardiomyocytes humaines par la famine Glucose <ol><li> Au jour 10 post-différenciation, changer le milieu dans chaque puits de la plaque de 6 puits à 2 ml de milieu faible taux de glucose et de maintenir les cellules dans ce milieu pendant trois jours (jusqu&#39;à 13 jours). </li><li> Au jour 13, retourner cellules milieu RPMI / B27 (avec l&#39;insuline). </li><li> Eventuellement, Réensemencement cardiomyocytes avant le second tour de privation de glucose pour aider à déloger les non-cardiomyocytes de la plaque de culture, ce qui facilite la dissociation des non-cardiomyocytes au cours privation de glucose. <ol><li> Au jour 13, moyen d&#39;aspiration, laver une fois avec du PBS, et dissocier les cellules dans des cellules individuelles en utilisant 500 ul d&#39;enzyme de dissociation de cellules pendant 5 min à 37 ° C. Plus précisément, après 5 min de traitement enzymatique, en utilisant une pipette de 1000 ul de dissocier manuellement cardiomyocytes à partir de la plaque à 6 puits en tirant de façon répétée jusqu&#39;à l&#39;enzyme de dissociation cellulaire et la pulvérisation contre la cardiomyocyte monocouche. Jusqu&#39;à 30 répétitions de pipetage peut être nécessaire de dissocier les cardiomyocytes dans des cellules individuelles. </li><li> Après que les cellules sont dissociées et se présentent sous forme de cellules isolées, de recueillir toutes les cellules dans un tube conique de 15 ml remplie de 5 ml de milieu RPMI / B27 de l&#39;insuline à diluer à l&#39;enzyme de dissociation des cellules et centrifugation pendant 4 min à 200 x g. Aspirer et jeter le surnageant. </li><li> Re-suspendre les cellules avec un milieu RPMI 2 ml / B27 et la plaque sur une nouvelle plaque de 6 puits ECMS revêtu. Typiquement, confluence plus élevé de cardiomyocytes aide à la survie des cellules pendant les plaquant. Viser à Réensemencement 2 millions de cellules par nouveau plat à 6 puits pour la survie optimale pendant les plaquant. </li></ol></li><li> Au jour 14, changer le milieu revenir à 2 ml de milieu à faible glucose pour un deuxième cycle de la privation de glucose. Culture des cellules dans cet état faible taux de glucose pour trois jours de plus. La plupart des non-cardiomyocytes mourront dans cet état de la culture bas-glucose. </li><li> Au jour 17, changer de support de 2 ml de RMoyenne PMI / B27 avec l&#39;insuline. Les cellules restantes seront cardiomyocytes hautement purifiés. Ces cardiomyocytes peuvent être utilisés pour l&#39;analyse de l&#39;expression des gènes, le criblage de médicaments, l&#39;analyse métabolique, et d&#39;autres dosages en aval. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+cardiovascular+disease+modeling+and+drug+screening.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (6), 150 (2013).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108 (3), 407-414 (2001).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li><li>Kattman, S. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ROCK+inhibitor+Y-27632+enhances+the+survival+rate+of+human+embryonic+stem+cells+following+cryopreservation.">The ROCK inhibitor Y-27632 enhances the survival rate of human embryonic stem cells following cryopreservation.</a> Stem Cells And Development. 17 (6), 1079-1085 (2008).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells:+the+matrix+sandwich+method.">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li><li>Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+de+novo+cardiomyocytes:+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+and+direct+reprogramming.">Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).</li></ol>

The authors do not declare competing interests.

L&#39;obtention d&#39;une grande quantité de cardiomyocytes dérivés hiPSC hautement purifiée est critique pour la recherche de base cardiaque, ainsi que les applications cliniques et de la traduction. Les protocoles de différenciation cardiaque ont subi des améliorations considérables ces dernières années, les méthodes basées sur la transition de corps embryoïdes-utilisant croissance cardiogénique deux facteurs, à la matrice méthodes sandwich 12, et enfin à des méthodes basées mon...

Cardiomyocytes humains primaires sont difficiles à obtenir en raison de l&#39;obligation pour les biopsies cardiaques invasifs, de la difficulté à dissocier les cellules simples, et parce que de mauvaise survie des cellules à long terme dans la culture. Compte tenu de ce manque de cardiomyocytes humains primaires, souches pluripotentes humaines induites cardiomyocytes dérivés de cellules spécifiques au patient (hiPSC-CM) la technologie a été considérée comme une source de cardiomyocytes alternative puissante pour la recherche fondamentale ainsi que des applications cliniques et translationnelles telles que la modélisation de la maladie et de drogues une découverte. Les premiers efforts dans la différenciation des cellules souches pluripotentes en cardiomyocytes employés protocoles de différenciation en utilisant des corps embryoïdes (EBS), mais cette méthode est inefficace dans les cardiomyocytes produisant parce que souvent moins de 25% des cellules dans une EB battent cardiomyocytes 2,3. Comparativement, un protocole de différenciation en fonction monocouche à l&#39;aide des cytokines activine A et BMP4 affiche un rendement plus élevé que EBS, maisce protocole est encore relativement inefficace, nécessite des facteurs de croissance coûteux, et ne fonctionne que dans un nombre limité de lignées de cellules souches pluripotentes humaines 4. Récemment, un très efficace, le protocole de différenciation des cardiomyocytes base-monocouche hiPSC a été développé par la modulation de la signalisation Wnt / β-caténine 5. Ces hiPSC-CMS exprimer troponine T cardiaque et l&#39;alpha actinine, deux protéines sarcomériques qui sont des marqueurs standard de 6 cardiomyocytes. Le protocole décrit ici est une adaptation de cette petite base de molécule, chargeur acellulaire, la différenciation monocouche méthode 5,7. Nous sommes en mesure d&#39;obtenir des cardiomyocytes battant hiPSCs après 7-10 jours (figure 1). Cependant, suite à une différenciation des cardiomyocytes résultant dans 50% des cellules battant, immunocoloration constante montre l&#39;existence d&#39;une population de non-cardiomyocytes qui sont négatives pour les marqueurs spécifiques tels que des cardiomyocytes troponine T spécifiquement cardiaque et d&#39;alpha-actinine. Pour fucomplémen cardiomyocytes purifier et d&#39;éliminer les non-cardiomyocytes, des populations hétérogènes de cellules différenciées ont été soumises à la famine glucose en les traitant avec un milieu de culture de glucose extrêmement faible pendant plusieurs jours (figure 2). Ce traitement élimine sélectivement les non-cardiomyocytes en raison de la capacité des cardiomyocytes, mais pas non cardiomyocytes, à métaboliser le lactate comme source d&#39;énergie primaire pour survivre dans un environnement faible taux de glucose 8. Après cette étape de purification, on observe une augmentation de 40% du rapport des cardiomyocytes de non-cardiomyocytes, (figure 3, figure 4) et ces cellules peuvent être utilisées pour aval analyse de l&#39;expression génique, la modélisation de la maladie, et des essais de criblage de médicaments.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="550">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:207px;">Name</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Matrigel (9-12 mg/mL)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11835055</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glucose free RPMI media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11879-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Minus Insulin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1895601</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">B27 Supplement (w/ insulin)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Pen-strep antibiotic</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>BenchMark</td>
			<td>100-106</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-2650</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>688000</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">CHIR99021</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>508306</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">IWR1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I0161</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Accutase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cell lifter</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-100-240</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Cryovial</td>
			<td>Fisher (NUNC tubes)</td>
			<td>375418</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">TrypLE Select Enzyme</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12563-011</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation

Souches pluripotentes cardiomyocytes dérivés de cellules humaines induites (hiPSC-CMS) sont devenus une source de cellules important de remédier au manque de cardiomyocytes primaires disponibles pour les applications de recherche et de traduction de base. Pour différencier en cardiomyocytes hiPSCs, divers protocoles comprenant corps embryoïdes (EB) à base de la différenciation et de facteur de croissance induction ont été développés. Toutefois, ces protocoles sont inefficaces et très variables dans leur capacité à générer des cardiomyocytes purifiés. Récemment, un petit protocole utilisant la modulation en fonction de molécule-de la signalisation Wnt / β-caténine a été montré pour promouvoir la différenciation cardiaque avec une grande efficacité. Avec ce protocole, supérieure à 50% -60% de cellules différenciées sont des cardiomyocytes de troponine cardiaque positifs ont été observés de façon constante. Pour augmenter encore la pureté des cardiomyocytes, les cellules différenciées ont été soumises à la famine glucose pour éliminer spécifiquement non cardiomyocytes en fonction de la différence métaboliques entre les cardiomyocytes et les non-cardiomyocytes. En utilisant cette stratégie de sélection, nous avons constamment obtenu une augmentation de plus de 30% dans le rapport de cardiomyocytes à des non-cardiomyocytes dans une population de cellules différenciées. Ces cardiomyocytes hautement purifiés devraient améliorer la fiabilité des résultats de base iPSC humaine in vitro des études de modélisation des maladies et les essais de dépistage de drogue.

Les changements morphologiques cours de la différenciation hiPSC. Le hiPSC cultivées dans des plaques sans cellules nourricières a grandi comme plates colonies, en deux dimensions. Après avoir atteint environ 85% de confluence, hiPSCs ont été traitées avec CHIR 6 pM pour la différenciation (figure 1A). Des quantités substantielles de la mort cellulaire, un phénomène normal et commun, ont été observés après 24 h de traitement CHIR. Après deux ...

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Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Dérivation des cardiomyocytes hautement purifiée de anthropiques cellules souches pluripotentes en utilisant de petits différenciation de Molecule-modulé et ultérieur glucose famine

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

18.4K vues.  Stanford University School of Medicine. Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening. 

Vidéo: Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Recherche

Biologie du développement

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

Différenciation des atrial cardiomyocytes à partir de cellules souches pluripotentes Utilisation de la BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Différenciation des chondrocytes provenant des cellules souches pluripotentes induites par le sang périphérique dérivé du sang

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Intégration de la dérivation libre de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme à l&#39;aide de Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.