This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

1. Zygotic développement de l&#39;embryon <ol><li> matériel végétal <ol><li> Cultivez l&#39;Medicago truncatula type sauvage Jemalong ou son quasi isogénique, hautement re-générable génotype Jemalong 2HA 13 (connu sous le nom 2HA) dans une serre avec une photopériode de 14 h et à 23 ° C / 19 ° C de température jour / nuit. <ol><li> Pierce la surface de l&#39;enveloppe de la graine (avec une aiguille 23 G) avant les semailles afin que l&#39;eau est autorisé à entrer dans la graine et tremper dans l&#39;eau pendant la nuit. Ajouter suffisamment d&#39;eau pour couvrir entièrement la graine. </li><li> Semer 3 graines dans chaque pot de 15 cm de diamètre (total de 10 pots) dans le mélange de rempotage (sable grossier, de la perlite, fibre de coco tourbe (1: 1: 1) plus de 5 g de Osmocote standard exacte: engrais à libération lente) et le transfert à la serre. Conserver le plus sain après la germination des semis de sorte qu&#39;il est de 1 plant par pot et Surround par un treillis pour les tiges des plantes à grimper. </li></ol></li></ol></li><li> Les gousses de récolte <ol><li> Recueillir les gousses de la wType ILD Jemalong ou 2HA pour obtenir les stades de l&#39;embryon précoce appropriés comme décrit pour la première 9. REMARQUE: Les différentes étapes de pince sont présentés sur la figure 1 et les étapes d&#39;embryons correspondants sont présentés dans la figure 2. </li><li> Vérifiez les différentes étapes de gousses à la récolte en utilisant des critères comme l&#39;indique le tableau 1. Mesurer le temps écoulé depuis l&#39;étape 6 pour aider étapes distinctes 6 et 7 (Tableau 2). </li></ol></li><li> Dissection ovules de gousses et de vérifier le stade de l&#39;embryon <ol><li> Isoler ovules de gousses à l&#39;aide de pinces fines seule ou un microscope de dissection stéréo et des pinces si nécessaire. Si nécessaire, le stade de l&#39;embryon peut être rapidement vérifiée à l&#39;aide d&#39;un microscope composé standard (figure 3B). </li><li> Préparez-vous modifié la solution de Hoyer contenant 7,5 g de gomme arabique, 100 g d&#39;hydrate de chloral, 5 ml de glycérol, 60 ml d&#39;eau déminéralisée distillée. Dissoudre par agitation pendant 3-5 heures ou toute la nuit. </li><li> Pour plus d&#39;affinerd microscopie effacer les ovules disséqués dans une solution de 15,16 de Hoyer modifié. Prenez soigneusement les ovules intacts et les placer dans un petit volume de la solution de Hoyer (assez pour couvrir l&#39;ovule) à température ambiante jusqu&#39;à ce que clair. </li><li> Voir les échantillons avec un contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) optique. Capturez les images iwth un appareil photo numérique 9 (Figure 2). </li><li> Obtenir les ovules plus uniformes à partir de la région centrale de la nacelle et accumuler le nombre requis. Un exemple est montré sur la figure 3A. Recueillir les ovules sur glace et conserver à la température requise (acides -80 ° C pour nucléiques) pour une analyse plus approfondie. NOTE: Pour plus de détails sur l&#39;analyse de coupes histologiques, microscopie électronique en transmission, et l&#39;hybridation in situ s&#39;il vous plaît voir les documents 8,9. </li></ol></li></ol> 2. embryons somatiques développement in vitro <ol><li> Utilisez un M. truncatula cultivar tchapeau est capable de former facilement des embryons en culture. Pour ce protocole pour explants foliaires utiliser des plantes 2HA 13,17 qui sont vieux 2-4 mois. </li><li> Prenez des dépliants de la dernière feuille trifoliée près complètement développée d&#39;une tige d&#39;élongation. </li><li> Gardez les feuilles trifoliées sur du papier humide éponge dans un pot de culture pour éviter la déshydratation. NOTE: Une fois que les feuilles trifoliées sont récoltés, ils doivent être utilisés dans un délai minimal. </li><li> Préparation du milieu de culture <ol><li> Utiliser le P4 10: 4: 1: 5 en milieu gélose (0,8% p: v) dans des boîtes de Pétri de 9 cm. Remarque: le P4 10: 4: 1: 5 milieu est constitué du milieu P4 basal 18 plus 10 acide uM 1-naphtalène (NAA), 4 uM 6-benzylaminopurine (BAP), 1 uM d&#39;acide abscissique (ABA) et 5 uM gibbérellique l&#39;acide (GA). L&#39;utilisation de GA + ABA accélère la formation de l&#39;embryon et provoque un accroissement substantiel du nombre d&#39;embryons 14. </li><li> Faire remonter la moyenne la base de P4 dans 1 L; constitué de sels majeurs (faire Calcium séparément), des sels et des vitamines mineures (Tableau 3), fer chélaté (maquillage séparément), casaminoacides (hydrolysat de caséine), 30 g de saccharose, 8 g d&#39;agar. </li><li> Magasin solutions mères de sels majeurs, calcium, des acides casaminés, des sels et des vitamines mineures à -20 ° C dans des aliquotes convenables. Stockez fer chélaté à 4 ° C. </li><li> Faites le fer chélaté (200x) en dissolvant 7,44 g de Na 2 EDTA • 2H 2 O dans environ 900 ml d&#39;eau distillée déminéralisée tout en remuant, puis amener la solution à 98-99 ° C tout en ajoutant 1.853 g de FeSO 4 • 7H 2 O. Enfin faire jusqu&#39;à 1 L quand les ingrédients sont dissous. Magasin en ambre bouteilles à 4 ° C coloré. </li><li> Faire remonter la moyenne de base de P4 avec les solutions d&#39;achat d&#39;actions dans le tableau 4. Les hormones dans le milieu sont 10 uM NAA, 4 uM BAP, 1 uM ABA, 5 uM GA (voir tableau 4 et matériaux spécifiques tableau). Ajouter la NAABAP et avant passage à l&#39;autoclave et ajouter ABA GA et après passage à l&#39;autoclave et refroidissement à environ 55 ° C, en utilisant la filtration stérilisante avec un filtre de 0,22 um fixée à une seringue. Bien mélanger en remuant doucement. </li><li> Ajustez les médias à pH 5,8 avec 1 M KOH avant autoclavage. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min. </li><li> Après autoclavage ajouter le filtre stérilisé ABA et GA, et versez environ 25 ml de milieu dans des boîtes de Pétri de 9 cm stériles dans une hotte à flux laminaire ou Biohazard cabinet. Refroidir et laisser l&#39;agar réglé avec le couvercle. Ensuite, mettre sur le couvercle et assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de condensation sur le couvercle. Étiquette comme nécessaire et conserver à 4 ° C (dans une boîte en carton pour éviter couvercle condensat). </li></ol></li><li> Stérilisation des tissus foliaires <ol><li> Travailler dans une hotte à flux laminaire stérilisée aux UV ou une armoire risque biologique. </li><li> Lieu laisse dans la boule de maillage d&#39;une boule à thé de printemps préalablement autoclave. </li><li> Immerger boule à thé contenant les feuilles dans 70% (v: v) d&#39;éthanol dans un culpot ture pendant 30 sec. REMARQUE: Pour toutes les étapes de cette procédure utilisent 250 ml bouchon à vis des pots de culture de polycarbonate qui sont passés à l&#39;autoclave. </li><li> Égoutter puis transférer et plonger le tissu de la feuille en 1: 8 (v: v) l&#39;eau de javel diluée (0,5% de chlore) pendant 10 min. Agiter doucement de temps à autre. </li><li> Égoutter l&#39;eau de Javel et de transférer l&#39;infuseur à thé dans un pot de culture contenant de l&#39;eau distillée stérile déminéralisée. Remuer doucement et égoutter l&#39;excès d&#39;eau. Répéter une fois de plus avec un pot de culture frais de l&#39;eau distillée stérile déminéralisée. </li><li> Retirer les feuilles de l&#39;infuseur à thé avec des pinces stériles à un pot de culture frais de l&#39;eau distillée stérile déminéralisée. Visser le bouchon stérile et rincez en inversant et tourbillonnant. Laissez les feuilles flottant sur l&#39;eau stérile jusqu&#39;au moment de préparer explants. </li></ol></li><li> Préparation et Placage explants <ol><li> En utilisant des techniques stériles, couper dépliants stérilisés individuels à partir du bord avec un scalpel, et couper le rectangle restant en deux ou Three explants rectangulaires (8-10 x 3-5 mm) avec la nervure médiane au centre de chaque explant (figure 5A). NOTE: La taille de l&#39;expiant est très important dans le lancement de la première callusing. Effectuer la coupe sur les couvercles des contenants stériles alimentaires à emporter. </li><li> Planche 6 explants sur agar-milieu de culture solidifié en 9 cm de diamètre des boîtes de Pétri (figure 5B). Plaque du explants côté abaxiale vers le bas pour maintenir l&#39;orientation de la feuille d&#39;habitude. </li><li> Sceller les boîtes de Pétri avec Parafilm (Figure 5C) tendus autour du plat. Le tissu est maintenant prêt pour l&#39;incubation. </li></ol></li><li> L&#39;incubation de tissus <ol><li> Incuber les plaques à l&#39;obscurité à 28 ° C dans une chambre à température régulée ou une armoire de croissance tout au long de la période de culture. NOTE: Les explants entameront dédifférenciation, subir la division cellulaire, la prolifération (formation de cals) et de l&#39;embryogenèse (différenciation). </li><li> Repiquer la EXPOSÉ différenciernts après trois semaines sur un milieu frais. À cette sous-culture transférer la totalité expiant aide d&#39;une spatule en acier inoxydable stérile et forceps, dans une hotte à flux laminaire ou dans une armoire de risque biologique. Comme callusing se produit et le cal est supérieure à la taille de la plus grande sur la figure 5C, transférer 50% de l&#39;individu lors de repiquage des cals dans un milieu frais. </li><li> Respecter les premiers embryons en environ 4 semaines. Bien qu&#39;il existe un degré de synchronie, de recueillir différents stades de l&#39;embryon au cours d&#39;une période d&#39;incubation de 4-8 semaines (figure 6A, B). Recueillir sous un microscope et le processus de dissection selon les objectifs expérimentaux. </li><li> Repiquer toutes les 3 semaines et éliminer périodiquement embryons afin que les explants continueront à produire des embryons pendant 3 mois. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li><li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds.">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li><li>Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies:+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li><li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li><li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo.">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li><li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. 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E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis.">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li><li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis,+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula.">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).</li><li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development.">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li><li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+(SERK1)+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula.">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li><li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+embryogenesis+from+leaf+explants.">Somatic embryogenesis from leaf explants.</a> The Medicago truncatula handbook. , (2006).</li><li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues.">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li><li>Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immature+seeds+and+embryos+of+Medicago+truncatula+cultured+in+vitro.">Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro.</a> Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).</li><li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula.">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li></ol>

The authors declare that they have no competing interests.

Les protocoles décrits sont relativement simples et permettent enquête de l&#39;embryogenèse légumineuses avec toute la cellule contemporaine et des techniques moléculaires. Nous reconnaissons qu&#39;il ya des avantages et des inconvénients des deux in vivo et in vitro approches. Les deux permettent davantage l&#39;accent sur ​​l&#39;embryogenèse précoce par rapport à la culture des graines immatures 19. Dans le cas des études in vivo ce qui est dé...

Les légumineuses sont la troisième plus grande famille de plantes supérieures avec environ 20.000 espèces et des légumineuses (ou fabacées) de la famille sont en second lieu à céréales de la superficie récoltée et la production totale 1. Le soja est la troisième plus grande plante cultivée. Les légumineuses à grains fournissent environ un tiers des protéines alimentaires, et un tiers d&#39;huile végétale pour la consommation humaine 2. Légumineuses avec leur capacité de fixation de N 2 contribuent également à des systèmes agricoles durables. Medicago truncatula, comme le soja, les magasins protéines et d&#39;huile dans les cotylédons de ses graines et est un modèle de légumineuses génétique et génomique des ressources génétiques et génomiques considérables 3,4. Alors que M. truncatula a permis des avancées dans la compréhension de la symbiose Rhizobium-légumineuses 4 il a été de plus en plus utilisé pour étudier la biologie des semences de légumineuses 5-7 et de l&#39;embryogenèse 8,9. Arabidopsis embryogenèse a été largement étudiée 10,11 mais il isa non-légumineuses et les détails de l&#39;embryogenèse ne sont pas identiques à Medicago 8,10. Embryogenèse zygotique dans M. truncatula a des caractéristiques intéressantes, avec un hypophyse multicellulaire distinctif, un suspenseur endoployploid et la cellule de transfert de base 8. L&#39;embryogenèse somatique (SE) est couramment utilisé pour 12 régénérer des plantes. Dans le modèle de légumineuse M. truncatula, la ligne de semis Jemalong 2HA (2HA) a été développé à partir du parent Jemalong d&#39;avoir des taux élevés de l&#39;embryogenèse somatique 13. Le nombre d&#39;embryons produits a récemment été substantiellement augmentée en ajoutant à la fois acide gibbérellique (GA) et de l&#39;acide abscissique (ABA) dans le milieu depuis longtemps établi 14. Dans ce cas, GA et ABA agissent en synergie, ce qui est inhabituel étant donné que GA et ABA agissent généralement antagoniste 14. Les embryons produits à partir de cals se développent sur la surface qui permet à l&#39;étape de l&#39;embryogenèse à être facilement déterminée Visually et facilement récolté. Avoir à proximité des lignes isogéniques qui sont embryonnaires (2HA) et non-embryonnaire (Jemalong) facilite l&#39;enquête de l&#39;embryogenèse somatique et ayant à la fois in vivo et in vitro fournit des systèmes de différentes possibilités expérimentales. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement embryonnaire est essentiel pour la compréhension des semences et le développement des plantes. Dans les légumineuses, comme dans les autres dicotylédones, ce sont les cotylédons de l&#39;embryon qui stockent les produits qui sont utilisés pour la nutrition humaine. Embryogenèse précoce implique la division cellulaire rapide, et la structuration de l&#39;embryon correcte. Dans environ 8 jours après la fécondation, l&#39;M. truncatula embryon atteint stades cotylédons début. La caractérisation morphologique est pas exactement indiquée par jours après la fécondation dans des conditions de serre. Ainsi, une approche efficace normalisé pour indiquer le stade de développement des embryons est précieux dans l&#39;étude de la génétique regulation du début de l&#39;embryogenèse zygotique. Dans cet article, nous proposons deux protocoles normalisés afin de recueillir des embryons en développement pour les études biologiques de l&#39;embryogenèse dans la légumineuse modèle M. truncatula. Le premier est de collecter des embryons zygotiques en associant l&#39;embryogenèse et pod morphologie tandis que le second est l&#39;embryogenèse somatique par culture des explants de feuilles de fournir un grand nombre d&#39;embryons facilement accessibles.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >P4 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Major salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Minor salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vitamins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Agar</td>
			<td>Bacto Laboratories</td>
			<td>214010</td>
			<td>Bacto agar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Plant hormones</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1-Naphthaleneacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0640</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Abscisic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1049</td>
			<td>Dissolve in small amount of 1 M NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-Benzylaminopurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3274</td>
			<td>Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Gibberellic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7645</td>
			<td>Dissolve in small amount of ethanol</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereo dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZFLIII</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Light microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiophot</td>
			<td>Or similar, with suitable optics</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Digital camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam HRc</td>
			<td>Or similar</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterilising leaves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>75.9922.519</td>
			<td>Autoclavable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for obtaining zygotic and somatic embryos for studying the regulation of early embryo development in the model legume medicago truncatula

Embryogenèse précoce partir d&#39;un seul zygote cellulaire passe par division cellulaire rapide et de la morphogenèse, et est morphologiquement caractérisée par étapes de pré-globulaire, globulaires, cardiaques, lance-torpilles et cotylédons. Ce développement progressif est sous la stricte réglementation d&#39;un réseau moléculaire complexe. La récolte des embryons précoces suffisantes à un stade de développement similaire est indispensable pour étudier la régulation cellulaire et moléculaire de l&#39;embryogenèse précoce. Cela ne veut pas simple puisque l&#39;embryogenèse précoce subit morphogenèse rapide dans un temps court, par exemple 8 jours pour Medicago truncatula pour atteindre le stade cotylédons tôt. Ici, nous abordons la question par deux approches. Le premier établit un lien entre le développement de l&#39;embryon et pod morphologie en aidant indiquer le stade de l&#39;embryon zygotique. Ceci est en particulier basée sur le nombre de spires et le développement des épines pod. Une autre manière de compléter in vivo ses études est via explants culture de feuilles pour produire des embryons somatiques. Le milieu comprend une combinaison d&#39;hormones inhabituelle - une auxine (acide 1-naphtalène), une cytokinine (6-benzylaminopurine), l&#39;acide abscissique et l&#39;acide gibbérellique. Les différentes étapes peuvent être discernées plus en plus hors du cal sans dissection.

Pour embryogenèse différente zygotiques structures pod correspondant aux différents stades de l&#39;embryon sont présentés dans la figure 1A - F tandis que les différents stades de l&#39;embryon sont présentés dans la figure 2A - F. En sélectionnant gousses au même stade, des échantillons de ovules qui sont assez uniforme peut être obtenue (figure 3A). En utilisant RT-qPCR embryon gènes spécifiques peuvent être facilement...

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Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Protocoles pour l&#39;obtention Zygotic et embryons somatiques pour l&#39;étude de la réglementation de développement précoce de l&#39;embryon dans la légumineuse modèle<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

13.8K vues.  University of Newcastle, Callaghan, New South Wales, Australia. The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided. 

Vidéo: Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Recherche

Biologie du développement

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome profilage des<em&gt; In-Vivo</em&gt; embryons de bovins pré-implantation à l&#39;aide de deux couleurs Microarray Plate-forme

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

Préparation de petites bibliothèques d’ARN pour le séquençage à partir d’embryons de souris précoces

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

Protocole d’immunohistochimie et de distribution in situ de l’ARN au sein de l’embryon précoce de drosophile

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Un dispositif de transplantation simple et efficace pour les embryons de poisson zèbre

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Isolement de cellules souches mésenchymateuses du tissu adipeux de rat pour la différenciation en cellules productrices d’insuline

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart disease. The development of the primitive cardiac valves involves the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) of endocardial cells from the atrioventricular canal (AVC) and outflow tract (OFT) regions of the heart in response to local inductive myocardial and endocardial signals. Once the cells delaminate and invade the extracellular matrix (cardiac jelly) located between the endocardium and the myocardium, the primitive endocardial cushions (EC) are formed. This process implies that the endocardium has to fill the gaps left by the delaminated cells and has to reorganize itself to converge (narrow) or extend (lengthen) along an axis. Current research has implicated the planar cell polarity (PCP) pathway in regulating the subcellular localization of the factors involved in this process. Classically, the initial phases of cardiac valve development have been studied in cross-sections of embryonic hearts or in ex vivo AVC or OFT explants cultured on collagen gels. These approaches allow the analysis of apico-basal polarity but do not allow the analysis of cell behavior within the plane of the epithelium or of the morphological changes of migrating cells. Here, we show an experimental approach that allows the visualization of the endocardium at valvulogenic regions as a planar field of cells. This experimental approach provides the opportunity to study PCP, planar topology, and intercellular communication within the endocardium of the OFT and AVC during valve development. Deciphering new cellular mechanisms involved in cardiac valve morphogenesis may contribute to understanding congenital heart disease associated with endocardial cushion defects.

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classically, the endocardium of the mouse embryonic valve primordium has been analyzed using transversal, coronal, or sagittal sections. Our novel approach for en face, two-dimensional imaging of the endocardium at valvulogenic regions allows planar polarity and cell rearrangement analysis of the endocardium during valve development.

En face Préparation d’un coussin endocardique pour l’analyse de morphogenèse planaire chez des embryons de souris

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...