Ce travail est soutenu par une subvention de la MRC à M. FS.

1. Développement des embryons <ol><li> Quand ils sont pondus, les œufs sont regroupés en raison de filaments de fixation sur le chorion. Pour que les embryons se développent normalement, il est nécessaire de séparer les oeufs. Tangle et couper les filaments de fixation en maintenant les filaments de fixation avec deux pinces. </li><li> Après unclustering, les oeufs sont séparés de fèces et d&#39;algues et transférées dans un milieu d&#39;embryons frais à une densité maximum de 40 œufs par 6cm boîte de Petri. </li><li> Embryons de medaka développer un peu plus lent que le poisson-zèbre à 27 ° C. Le moment de l&#39;éclosion est différente entre les deux espèces; embryons de medaka éclosion du chorion en 7 jours et immédiatement commencer à nager et manger, alors embryons de poisson zèbre éclosent au bout de 2 jours, mais commencent à nager et de manger dans les 5-6 jours. Développement de medaka est mis en scène selon la mise en scène Iwamatsu 4. </li><li> Le développement des embryons de medaka peuvent être facilement ajustés aux plans expérimentaux en sélectionnant letempérature. Développement des embryons de medaka peut être arrêté à 4 ° C en début de développement. Après l&#39;étape 24, lorsque battements du cœur commence, le développement peut être ralenti en utilisant une température minimale de 18 ° C. </li><li> Le moment d&#39;apparition des organes / tissus est légèrement différente dans medaka rapport avec le poisson zèbre, c&#39;est à dire dans somitogenèse medaka survient après le début du développement du cerveau alors que dans le poisson-zèbre somitegenesis précède le développement du cerveau. </li></ol> 2. Retrait du chorion Le chorion de medaka compose de deux couches de protection à l&#39;intérieur d&#39;une couche dure et une surface extérieure souple. Ainsi, un traitement à la protéase en deux étapes en utilisant la pronase et enzyme d&#39;éclosion est nécessaire de supprimer ce chorion. Une fois dechorionated, les embryons doivent être conservés en 1X BSS. Semi-stériles conditions permettra d&#39;améliorer la culture d&#39;embryons dechorionated succès, surtout lorsque les périodes d&#39;observation plus longues sont nécessaires. Il s&#39;agit notamment deen utilisant des solutions stériles (stérilisés par exemple 1X BSS avec des antibiotiques) et des outils stérilisés avec de l&#39;éthanol 70% puis rinçage à l&#39;1X BSS. Comme dechorionated embryons de medaka sont plus doux et plus fragiles que les embryons de poisson zèbre dechorionated, des précautions supplémentaires doivent être prises pour veiller à ce qu&#39;ils n&#39;entrent pas en contact de l&#39;air ou de bulles dans la pipette, au risque de provoquer l&#39;effondrement immédiat. Afin de garantir un minimum de dommages aux embryons, une pipette à large goulot de la chaleur en verre poli avec pompe à pipette doit être utilisée pour le transfert d&#39;embryons et une boucle de cheveux doivent être utilisés pour orienter embryons pour l&#39;observation. Non adhérentes boîtes de Petri doivent être utilisés pour prévenir les embryons de se fixer aux surfaces. <ol><li> Avant dechorionation il faut vérifier que les œufs ont été suffisamment séparés et nettoyés. </li><li> Étant donné que la pronase et des enzymes d&#39;incubation sont protéinases, ils doivent être conservés sur de la glace et de minimiser l&#39;exposition des embryons de ces enzymes. </li><li> Transfert des œufs à sandpapar (p2000 grain, imperméable à l&#39;eau) placé dans le couvercle d&#39;une boîte de Pétri 9cm. Retirer milieu en excès, mais d&#39;assurer un volume suffisant demeure pour empêcher le dessèchement des embryons. </li><li> Roulez doucement embryons pendant environ 45-60 secondes pour enlever une partie des poils de surface extérieure et légèrement entailler la surface du chorion (Figure 1). Transfert d&#39;embryons revenir à une boîte de Pétri d&#39;origine et d&#39;examiner. Lorsque vous roulez sur du papier de verre embryons utiliser l&#39;index, en appliquant une pression minimale et le maintien doigt parallèlement à la surface du papier de verre. Ne pas rouler plus de 5-7 embryons à la fois. Cette précaution permettra de minimiser les risques d&#39;écrasement embryons dessous de l&#39;autre. </li><li> Remplacer milieu à l&#39;œuf dans un plat avec de la pronase 20mg/ml et d&#39;embryons incuber pendant 40-60 minutes à 27 ° C. Assurer embryons sont suffisamment couverts par la pronase et un couvercle est présent sur le plat. Pronase utilisé doit être conservé sur de la glace au cours de cette étape à mitienne pas compte d&#39;auto-digestion et peut être réutilisé jusqu&#39;à ce que l&#39;activité est perdue (environ 1-2 semaines). </li><li> Récupérer pronase pour les embryons de réutilisation et de lavage 5X en milieu embryon pour éliminer les traces de pronase car cela inactiver l&#39;enzyme d&#39;éclosion à ajouter. </li><li> Retirer moyen d&#39;embryons et d&#39;embryons de couverture avec l&#39;enzyme d&#39;éclosion, les embryons assurant siéger en tant que monocouche dans le plat. Si les œufs s&#39;asseoir sur le dessus les uns des autres dans le plat, ceux d&#39;en bas seront écrasés comme le chorion se dissout. Gardez enzyme d&#39;éclosion utilisé sur la glace. </li><li> Incuber les embryons à 27 ° C et après 15 minutes de vérifier périodiquement l&#39;état d&#39;avancement de l&#39;éclosion à l&#39;aide d&#39;un stéréomicroscope. On verra qu&#39;un certain nombre de cratère lunaire-comme les trous commencent à apparaître dans la couche interne du chorion, qui se dissout rapidement suite à cette sortie de la couche externe souple du chorion facilement enlevé manually. L&#39;ensemble du processus d&#39;éclosion peut prendre 15-60 minutes. </li><li> Dès que les embryons sortent du chorion, transférer des embryons à une boîte de Pétri contenant 1X BSS. Assurez-vous de ne pas transférer enzyme d&#39;éclosion au BSS 1X en touchant la pointe de la pipette sur la surface de la BSS permettant aux embryons à rouler doucement sur. </li><li> Une fois que tous les embryons sont transférés à partir enzyme d&#39;éclosion, faire un transfert définitif vers un autre plat frais de 1X BSS. Cela garantit embryons ne sont pas exposés à des restes de l&#39;enzyme d&#39;éclosion, car cela pourrait endommager les embryons exposés. Une fois dans ce plat final des embryons encore qui possèdent la couche externe du chorion peut être libéré manuellement à l&#39;aide de micro-pinces stérilisées sous la loupe binoculaire. Si les embryons doivent être développées dechorionation suivante, pénicilline / streptomycine doit être ajouté àle BSS à empêcher la croissance bactérienne. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Comparaison des embryons laminés et déroulé pendant dechorionation. Observez comment les embryons laminés dans le groupe B n&#39;ont pas les poils visibles sur les embryons déroulé dans le panneau A. 3. Montage embryons dechorionated Intégration d&#39;agarose est utile pour des périodes plus longues de l&#39;imagerie (par exemple, imagerie time-lapse) pour les embryons vivants ainsi que pour les observations détaillées des embryons fixes. Au cours de la gastrulation et organogenèse précoce (stade 14 au stade 28), les embryons de medaka présentent des vagues de mouvements rythmiques contractiles à travers le périderme, une couche de tissu qui recouvre à la fois le développement de l&#39;embryon et le jaune 5. Les embryons sont traités avec 3,5 mm 1-heptanol pour arrêter les mouvements contractiles 6. Pour arrêter le mouvement d&#39;embryons après stage 28 (64hpf), les embryons sont anesthésiés en ajoutant des gouttes de tricaïne mésilate (TMS) avant enrobage. TMS est également ajouté à la gélose (ajouter seulement une quantité minimale, cette dose doit être optimisé, environ une dilution 1:25). <ol><li> Décongeler une petite quantité de 3% d&#39;agarose à basse température de gélification (en 1X BSS) en chauffant à 37 ° C et maintenir à cette température. </li><li> Les étapes suivantes doivent être réalisées rapidement afin que l&#39;agarose ne pas se solidifier avant d&#39;orienter l&#39;embryon. On utilise un support de verre à large ouverture pipette agarose fondu suffisamment pour remplir la dépression bouchon d&#39;un tube Eppendorf. </li><li> Transfert d&#39;un embryon dechorionated à la dépression bouchon en minimisant transportant plus de BSS avec l&#39;embryon. Immédiatement absorption de l&#39;agarose et de l&#39;embryon de la dépression bouchon et le transfert vers une chambre de Petri boîte de culture. Un plat de 3.5cm de Pétri avec une fenêtre en verre au fond est utilisé. Pour l&#39;imagerie à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé,embryons sont face vers le bas et orientée vers le corps placé tout près de la vitre de protection. Pour l&#39;imagerie à l&#39;aide d&#39;un microscope droit, l&#39;épaisseur de l&#39;agarose est minimisée. </li><li> Placer la capsule 3.5cm de Petri dans un plat de diamètre 14cm de glace de Petri contenant et l&#39;eau (eau rempli à environ 1/3 profondeur totale de grand plat). Tout en maintenant la chambre fermement sur le fond de la boîte de Petri 14 cm, utiliser une boucle de cheveux pour orienter doucement l&#39;embryon tel que souhaité dans le agarose fondu et maintenir l&#39;embryon jusqu&#39;à l&#39;agarose se solidifie par un léger soulèvement et d&#39;abaissement de la petite cuvette dans sa position initiale dans l&#39;eau glacée. </li></ol> 4. La transplantation de cellules dans des embryons de medaka Le but de cette procédure est de déterminer si le gène d&#39;intérêt agit cellule autonome (dans une cellule) ou non cellulaire autonome (entre les cellules). Les cellules donneuses peuvent être marqués avec un colorant traceur tel que la rhodamine-dextran avant transplantation (tel que décrit dans «La micro-injection d&#39;embryons Medaka« le protocole d&#39;accompagnement JoVE) ou une souche transgénique avec une expression de GFP peut être utilisé, permettant une évaluation de transplantation. Une combinaison des deux techniques de marquage est souvent utile pour surmonter l&#39;auto-fluorescence qui peuvent être rencontrées. Pour time-lapse études après la transplantation, expression de la GFP est particulièrement utile. Utiliser une pipette en verre à large ouverture avec pompe à pipette long de cette procédure et stériliser tous les outils (y compris les diapositives) au préalable avec EtOH à 70%, suivi par un rinçage soigneux avec 1X stérile BSS. Embryons receveurs sont généralement développés autour de la 12e étape car cela permet la discrimination des pôles ventrales et dorsales lors de la réalisation de transplantation. <ol><li> Commencer dechorionating embryons 1,5 heure avant la transplantation et dispositif d&#39;injection de configuration au cours d&#39;incubations enzymatiques. </li><li> Placez une lame de microscope cavité dans une boîte de Pétri de diamètre 9cm. </li&gt; <li> Ajouter une petite quantité de méthylcellulose 3% vers le centre de la diapositive cavité à l&#39;aide d&#39;une pipette stérile et éparpillé. </li><li> Méthylcellulose à sec pendant environ 1-2 minutes. </li><li> Ajouter 350μl de 1X stérile BSS pour combler la dépression diaporama. </li><li> Transfert d&#39;un embryon donneur et un maximum de quatre embryons receveurs de la lame à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre. </li><li> Orienter les embryons en utilisant une boucle des cheveux de sorte que le blastoderme de l&#39;embryon est orienté vers le haut. Les embryons peuvent être appuyé contre l&#39;autre pour augmenter la stabilité ultérieure. </li><li> Insérez délicatement l&#39;aiguille en micro-blastoderme donateurs et lentement absorption 10-20 cellules. </li><li> Insérez doucement l&#39;aiguille dans la zone requise du blastoderme embryon receveur et d&#39;expulser les cellules lentement. Un grand soin doit être pris lors de l&#39;insertion dans les cellules du blastoderme destinataire afin de ne pas perturber la cellule vitelline frontière car cela peut entraîner la mort de l&#39;embryo. </li><li> Verser stérilisés 1X BSS dans la boîte de Pétri. Versez délicatement le SRS dans le plat le plus près possible du côté du plat que possible afin de ne pas perturber les embryons. Ne versez jamais le BSS directement sur les embryons et ajouter suffisamment BSS tels que le coulisseau et embryons sont immergés. </li><li> Ajouter 100 pi de pénicilline / streptomycine dans le plat et le couvercle. Transférer délicatement plat dans un incubateur à 27 ° C pour permettre un développement normal. </li><li> Les embryons peuvent être observés régulièrement comme vous le souhaitez. Lorsque vous utilisez la transplantation d&#39;effectuer gain-de-fonction et / ou expériences de sauvetage phénotype, certains changements morphologiques observés pourraient être dus à des effets de la transplantation. Ainsi transplantations multiples sont nécessaires. Après 2-3 jours, mélanophores doivent être présents sur le sac vitellin, la tête, les yeux et le tronc. Si elle est présente sur les embryons transplantés alors un succès chimère a probablement été produite (figure 3). </li></ol><pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Si nécessaire, l&#39;embryon donneur de génotype (s) par le transfert à la PCR tube (s) contenant 25 pi de 20mg/ml de protéinase K. Incuber à 55 ° C pendant 4 heures suivies de 10 minutes à 94 ° C et transporter la PCR. 5. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Exemple de position figure 2. D&#39;un embryon d&#39;agarose-embedded. Antérieur est illustré à droite et la vue est dorsale. Groupe B: les cellules endothéliales peut être vu des deux côtés du corps embryonnaire et sont étiquetés en utilisant la GFP dirigée par le promoteur fli. <img src="/files/ftp_upload/2055/2055fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Images de post-transplantation d&#39;embryons. Une image montre un donneur et receveur embryon immédiatement après la transplantation. L&#39;embryon donneur est indiquée sur la droite avec un blastoderme complètement rouge (flèche). L&#39;embryon receveur est indiqué sur ee à gauche et est facilement identifié par la petite masse de cellules transplantées rouges visibles dans le blastoderme (tête de flèche). B L&#39;image montre deux embryons receveurs d&#39;environ 7 heures après la transplantation (incubé à 27 ° C). Notez que les cellules transplantées ont migré à partir du site de la transplantation et sont aujourd&#39;hui dispersés à travers le blastoderme (flèches). Image C montre un embryon receveur à st.29 (environ 74hpf). Notez la pigmentation dans les yeux et la présence de mélanophores dans le coffre et la région du cerveau (flèches). Les cellules marquées à la rhodamine peut être vu à coloniser de nombreuses structures embryonnaires indiquant le succès de la production d&#39;une chimère.

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	<li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka,+Oryzias+latipes.">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li><li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medaka+and+zebrafish,+an+evolutionary+twin+study.">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech Dev. 121, 629-6237 (2004).</li><li>Hirose, Y., Varga, Z. M., Kondoh, H., Furutani-Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+lineage+and+regionalization+of+cell+populations+during+Medaka+neurulation.">Single cell lineage and regionalization of cell populations during Medaka neurulation.</a> Development. 131, 2553-2563 (2004).</li><li>Iwamatsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+normal+development+in+the+medaka+Oryzias+latipes.">Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes.</a> Zool Sci. 11, 825-839 (1994).</li><li>Cope, J., Fluck, R., Nicklas, L., Plumhoff, L. A., Sincock, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stellate+layer+and+rhythmic+contractions+of+the+Oryzias+latipes+embryo.">The stellate layer and rhythmic contractions of the Oryzias latipes embryo.</a> J Exp Zool. 254, 270-275 (1990).</li><li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Whole+Mount+High-Resolution+Double+Fluorescent+In+Situ+Hybridization.">Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization.</a> J Vis Exp. , (2009).</li></ol>

Dans cette vidéo, nous démontrons comment dechorionate et effectuer transplanataion cellules sur des embryons de medaka. Il s&#39;agit d&#39;une technique puissante pour produire des embryons chimériques pour l&#39;étude du gène / protéine de fonction au cours du développement, ainsi que pour élucider l&#39;autonomie du gène / protéine en question. Medaka constituent un système modèle vertébré utiles pour cette technique en raison de cartes sort bien établies et leur transparence, leur bien prêt à in vivo imagerie en temps réel. La transplantation peut être combiné avec micro-injection (tel que décrit dans «micro-injection d&#39;embryons Medaka« le protocole d&#39;accompagnement JoVE) de sorte que le comportement des cellules transplantées peuvent être facilement observés.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd"><html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en"><div><table border="1"><thead><tr><th> Nom du produit </th><th> Type </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commenter </th></tr></thead><tbody><tr><td> Moyen d&#39;embryons </td><td> Réactif </td><td> Fait maison </td><td> N / A </td><td> Solution 200ml bouillon 50X, 1 ml 1 methyleneblue% dans H 2 O/10 eau osmosée litre (solution mère 50X: 14.7g NaCl, KCl 0,6 g, CaCl 2, 2H 2 O 2,4 g, MgSO 4 7H 2 O 4.0g / 1 litre RO de l&#39;eau.) </td></tr><tr><td> Micro-pince à disséquer </td><td> Outils </td><td> 55 INOX A.DUMONT &amp; FILS </td><td> N / A </td><td> Très forte pointes fines pour l&#39;enlèvement du chorion. </td></tr><tr><td> Papier de verre fin imperméable à l&#39;eau - p2000 grain </td><td> Outils </td><td> Hermes Abrasives Ltd </td><td> N / A </td><td> Très fine granulométrie fou roulant / nettoyage embryons avec chorions. </td></tr><tr><td> Méthylcellulose 3% </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> M 0512 </td><td> Haute viscosité pour la tenue des embryons en place lors de la transplantation. </td></tr><tr><td> 1X BSS </td><td> Réactif </td><td> Fait maison </td><td> N / A </td><td> 20XBSS: 130g de NaCl, KCl 8g, 4g MgSO 4 .7 H 2 O, 4g CaCl 2 .2 H 2 O, 10 mg et rouge de phénol dans 1L d&#39;eau MilliQ et autoclave; Hepes 500mm dans de l&#39;eau MilliQ autoclave. Ajouter 20XBSS 25ml et 15ml 500ml Hepes pH 7,0, remplir jusqu&#39;à 500 ml et stériliser par filtration avant de l&#39;utiliser. </td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Réactif </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td> Ajouté à BSS lors de l&#39;incubation des embryons dechorionated. </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> Réactif </td><td> Calbiochem </td><td> 53702 </td><td> Pour dechorionation. </td></tr><tr><td> Enzyme d&#39;éclosion </td><td> Réactif </td><td> Fait maison </td><td> N / A </td><td> Pour dechorionation. </td></tr><tr><td> Tricaïne messageilate (TMS) </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> A-5040 </td><td> 400mg tricaïne dans l&#39;eau distillée 97.9ml et 2.1ml 1M Tris, pH ajusté à 7, 4,2 ml de cette solution dans l&#39;eau du réservoir 100ml propre. </td></tr><tr><td> 3% Température de gélification ultra-faible. agarose </td><td> Réactif </td><td> Sigma </td><td> A-2576 </td><td> Type IX-A. Utilisé lors de l&#39;enrobage des embryons à des fins d&#39;observation. </td></tr><tr><td> Chambre de Petri boîte de culture </td><td> Outil </td><td> Iwaki, Asahi Glass Corp Techno </td><td> 11-004-008 </td><td> Iwaki verre plat de base 35mm 12mm avec fenêtre. Utilisé lors de l&#39;enrobage des embryons à des fins d&#39;observation. </td></tr><tr><td> Micromanipulateur </td><td> Équipement </td><td> Narishige </td><td> N / A </td><td> Modèle MN151. Pour le retrait et l&#39;insertion de cellules lors d&#39;une transplantation. </td></tr><tr><td> Verre borosilicate capillaires </td><td> Outil </td><td> Harvard Apparatus </td><td> GC100-10T </td><td> Pour faire des aiguilles de transplantation. </td></tr><tr><td> Flaming / Brown micropipette extracteur </td><td> Équipement </td> &lt;td&gt; Sutter Instrument Co. </td><td> Modèle P-97 </td><td> Pour faire des aiguilles de transplantation. </td></tr></tbody></table></div>

dechorionation of medaka embryos and cell transplantation for the generation of chimeras

Medaka est un petit poisson d&#39;eau douce de ponte qui permet des analyses génétiques et embryologiques et est l&#39;un des trois organismes modèles vertébrés dans lequel l&#39;ensemble du génome phénotype axées sur les écrans mutantes ont été effectuées 1. Divergence de chevauchement fonctionnel de gènes liés entre medaka et poisson-zèbre permet l&#39;identification de nouveaux phénotypes qui sont identifiables dans une seule espèce 2, ainsi medaka et poisson zèbre sont complémentaires pour la dissection génétique des génomes de vertébrés fonctions. La manipulation des embryons de medaka, comme dechorionation, les embryons de montage pour l&#39;imagerie et la transplantation de cellules, sont les principales procédures de travailler à la fois sur le medaka et poisson-zèbre dans un laboratoire. La transplantation de cellules examine l&#39;autonomie cellule de mutations medaka. Les chimères sont générés par la transplantation de cellules marquées à partir d&#39;embryons donateurs dans des embryons receveurs non étiquetés. Les cellules donneuses peuvent être transplantés à des domaines spécifiques des embryons receveurs basées sur le sort cartes 3 </sup&gt; de sorte que des clones de cellules transplantées peuvent être intégrées dans le tissu d&#39;intérêt au cours du développement. En raison de la chorion dur et d&#39;embryons non alcoolisées, la manipulation d&#39;embryons de medaka est plus compliqué que chez le poisson zèbre. Dans cette vidéo, nous montrons les procédures détaillées de manipulation des embryons de medaka.

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Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

En raison de la chorion dur et d&#39;embryons non alcoolisées, la manipulation d&#39;embryons de medaka est plus compliqué que chez le poisson zèbre. Cette vidéo montre étape par étape, les procédures pour la manipulation des embryons de medaka, y compris dechorionation, montage d&#39;agarose pour l&#39;imagerie et la transplantation de cellules pour la production de chimères. Ces procédures sont essentielles à utiliser le medaka et poisson-zèbre dans un laboratoire de tirer pleinement parti de leur complémentarité pour la dissection génétique des fonctions du génome des vertébrés.

Dechorionation d&#39;embryons Medaka et la transplantation de cellules pour la production de chimères

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

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17.6K vues.  University of Bath. En raison de la chorion dur et d'embryons non alcoolisées, la manipulation d'embryons de medaka est plus compliqué que chez le poisson zèbre. Cette vidéo montre étape par étape, les procédures pour la manipulation des embryons de medaka, y compris dechorionation, montage d'agarose pour l'imagerie et la transplantation de cellules pour la production de chimères. Ces procédures sont essentielles à utiliser le medaka et poisson-zèbre dans un labora...

Vidéo: Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

L&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Recherche

Biologie

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection de 6,5 embryons de souris DPC

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Trachéotomie: Une méthode pour la transplantation de cellules souches pour le poumon

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

Plastique Embedding et le sectionnement des embryons de Xenopus laevis

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Génération de l&#39;homme CD40-B activés cellules

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tissu ciblé chimères embryonnaires: Zebrafish cellulaire Gastrula transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

La transplantation de blastomères exprimant la GFP pour l&#39;imagerie en direct sur le développement de la rétine et du cerveau dans les embryons de poissons zèbres chimériques

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

Microinjection d&#39;embryons Medaka pour être utilisé comme un organisme modèle génétique

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...