We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1. Culture cellulaire (24-48 h avant la transfection) <ol><li> 24 à 48 h avant la transfection à des semences de une quantité suffisante de cellules HEK293T en fonction du nombre de plaques à 96 puits est transfecté. NOTE: Pour les transfections compatibles, les cellules de la plaque à une densité suffisante pour favoriser division rapide, mais ne pas être à plus de 70 à 90% de confluence au moment de la transfection. </li><li> Chaque plaque de 96 puits nécessite 9 x 10 6 cellules (75 000 cellules par puits et 120 puits par plaque pour tenir compte de l&#39;utilisation du réservoir et une pipette multicanaux). Calculer le temps de doublement des cellules HEK293 (typiquement ~ 20 h), et les semences le nombre approprié de cellules pour obtenir au moins 9 x 10 6 cellules au moment de la transfection. Une plaque de culture circulaire de 145 mm est généralement suffisante pour 3 transfections 96 puits lorsqu&#39;il est cultivé à ~ 90% de confluence, avec environ 10% des cellules restantes de réensemencer une nouvelle plaque. </li></ol> 2. Préparation avant la transfection _content &quot;&gt; NOTE: La préparation des tampons et l&#39;ADN plasmidique à l&#39;étape 2,0-2,2 doit être effectué dans les jours avant la transfection depuis la préparation de ces réactifs peut prendre beaucoup de temps. <ol><li> 3&#39;UTR clones humains qui sont compatibles avec le test de 3&#39;LIFE sont disponibles à travers un plasmide publique référentiel 30. Purifier l&#39;ADN plasmidique manuellement ou avec des robots de manipulation de liquides. Utilisez un kit mini-prep 96 puits grade transfection lyse alcaline et suivez les instructions du fabricant. Reprendre les vecteurs purifiés à ~ 100 ng / l par puits. REMARQUE: Le signal de la luciférase insuffisant entraînera si la concentration de plasmide tombe en dessous de 40 ng / ul. </li><li> Obtenir la pLIFE-miARN vecteurs 30 ou clone en utilisant le pipeline dans la figure 1B 24. Remettre en suspension les vecteurs à une concentration de 500 ng / pl pour chaque miARN et des plasmides de contrôle à blanc. </li><li> En raison de la sensibilité des conditions de tampon de nucléofection, en sorte quele volume total des matières (y compris les cellules transfectées et les plasmides) ne dépasse pas 10% du liquide total dans chaque puits de la plaque de transfection à 96 puits. Pour atteindre cet objectif, concentrer le plasmide de stock pLIFE-miARN à une concentration de moins de 500 ng / ul. </li><li> Préparation des réactifs de tampon 10x luciole luciférase (tableau 1), ainsi que les réactifs 1x luciférase de Renilla tampons (tableau 2), qui peuvent être stockées pendant 6 mois. Remarque: le DTT dans le tampon de la luciférase de luciole à doit être stocké dans la solution à -20 ° C en aliquots à usage unique. </li></ol> 3. Préparez les éléments suivants immédiatement avant la transfection <ol><li> Préparer du tampon de transfection contenant du PBS, 1,5% de HEPES, pH 7,0. Préparer cette nouvelle, même si elle peut être conservée jusqu&#39;à un mois à 4 ° C sans diminutions notables dans l&#39;efficacité de transfection. Dans la formulation de volumes tampons et d&#39;ADN plasmidique, assumer 120 réactions pour chaque plaque de 96 puits à sufficiently tenir compte des erreurs de pipetage et volume perdu en utilisant réservoirs de liquide et pipettes multicanaux. Aliquote de 18 ul par tampon de transfection bien (120 puits / 96 puits plaque = 2,16 ml par plaque), et mis de côté. NOTE: Le dispositif cellulaire électroporation est extrêmement sensible aux conditions de tampons utilisés pour la transfection de cellules. Actualité lors de la préparation des tampons seront assurer une performance constante de l&#39;équipement. Un soin particulier doit être pris lors de l&#39;exécution du test pour éviter l&#39;évaporation de tampons, spécifiquement en minimisant le temps que le tampon est laissé à découvert dans des microtubes, plaques à 96 puits, des réservoirs et des plaques d&#39;électrodes. </li><li> Réserve quatre puits pour les contrôles suivants, aucune pLIFE-3&#39;UTR (pour mesurer fond du dosage de la luciférase), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (contrôle cible négative), le contrôle positif pour miRNA # 1, le contrôle positif pour miRNA # 2. NOTE: Ces vecteurs sont disponibles au public 30. Sinon, toute cible préalablement validépeut être utilisé comme témoin positif. </li><li> Médias chauds, la trypsine (0,25%) à 37 ° C. </li><li> A chaque puits de la plaque à 96 puits de culture de cellules, ajouter 200 ul de milieu DMEM additionné de 10% de FBS, 1% de Pen / Strep, et placé dans un incubateur à 37 ° C pour une utilisation suivant la transfection. </li><li> Tournez sur tous les appareils d&#39;électroporation des cellules, suivie par le logiciel de soutien. Utilisez le code Pulse FF120 pour les cellules HEK293T et tampon PBS / HEPES. </li></ol> 4. Préparation du plasmide ADN et de cellules Mélange REMARQUE: Le protocole suivant suppose que la transfection de trois plaques à 96 puits dans une expérience pour un écran avec deux miARN (miRNA- # 1 et # 2 miRNA-). Chaque plaque correspondra à la même plaque de 96 puits de plasmides pLIFE-3&#39;UTR, et être traité trois fois avec pLIFE-miARN-vierge, pLIFE-miRNA- # 1, ou pLIFE-miRNA- # 2. <ol><li> Préparez 3 stocks de tampon de transfection pLIFE-miARN + pour chaque miARN. Ce stock devrait représenter 50% (10 pi) du volume total de chaqueainsi, multiplié par 120 puits. Ainsi, chaque action doit contenir 1,08 ml de tampon + 120 ul ADN plasmidique (pLIFE-miARN). </li><li> Éliminer les cellules de 145 mm plaque de culture par élution médias, laver délicatement avec PBS, et en traitant avec ~ 5 ml 0,25% de trypsine pendant 5 min à 37 ° C. Neutraliser la trypsine avec un volume égal de milieu, et un culot de cellules à 300 g pendant 5 min. </li><li> Retirer la trypsine / médias, et remettre le culot en ~ 5-10 ml de milieu (en fonction de la densité cellulaire et la gamme précise de compteur de cellules). </li><li> Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules. Veiller à ce que les cellules sont&gt; 95% viables et à portée exacte de la machine. NOTE: Un nombre de cellules inexacts peut entraîner des concentrations cellulaires extrêmement élevées (&gt; 6.0x 10 6 / ml). La transfection d&#39;un trop grand nombre de cellules peuvent réduire considérablement l&#39;efficacité de miARN cible en réduisant plasmide ratio cellulaire et / ou la diminution de l&#39;efficacité de transfection. </li><li> Aliquotes trois tubes contenant chacun 9 x 10 6 cellules, correspondant à des cellules rbligatoire pour la transfection d&#39;une plaque à 96 puits. Spin cellules à 300 g pendant 3 min. </li><li> Retirez le support. Soyez sûr d&#39;enlever autant de médias que possible avec une perturbation minimale de la pastille que l&#39;excès des médias peuvent avoir un impact efficacité de la transfection. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1,2 ml transfection tampon / mélange de plasmides miRNA, et mettre de côté. </li><li> Les étapes suivantes détail remise en suspension des pLIFE-3&#39;UTR plasmide dans le tampon de transfection. Comme cela se produit dans des plaques de 96 puits, prendre soin d&#39;éviter l&#39;évaporation de tampon en couvrant plaques en tout temps. <ol><li> En utilisant une pipette multicanaux, déplacer 32,4 pi de tampon de transfection dans chaque puits d&#39;une plaque à 96 puits PCR (9 pl [par transfection] * 3 [plaques] * 1.2 [pour tenir compte des erreurs de pipette]). </li><li> Ajouter 3,6 ul (~ 100 ng / ul) de mini-prepped pLIFE-3&#39;UTR plasmide à chaque puits et mélanger soigneusement. </li><li> Pipette 10 ul de ce mélange dans chaque puits de la plaque de transfection de 96 puits et couvrir. </li></ol></li></ol><ol><li> Déplacez 1,2 ml de la première / tampon / mélange de plasmides pLIFE-miARN cellule dans le réservoir. Bien mélanger. </li><li> Ajouter 10 pi de ce mélange dans la première plaque de transfection de 96 puits contenant déjà 10 pi transfection tampon / pLIFE-3&#39;UTR. Bien mélanger en pipetant plusieurs fois. NOTE: égalité suspension de cellules dans le tampon assurera même et le passage complet du courant électrique à travers la cuvette et maximiser l&#39;efficacité de la transfection. </li><li> Placez plaque de 96 puits de transfection sur l&#39;appareil d&#39;électroporation de la cellule et d&#39;initier la transfection. </li><li> Une fois que la transfection est terminée, ajouter 100 pi de milieu préchauffées de plaque de 96 puits de culture à chaque puits de la plaque de transfection de 96 puits et bien mélanger. Déplacez 100 pi de chaque puits dans la plaque de culture à 96 puits. </li><li> Mélanger les cellules dans une plaque de culture à la pipette positionné verticalement dans le centre du puits, les cellules ont tendance à se regrouper sur les côtés de la pell moins mélangée correctement. </li><li> Répétez 5,1-5,5 pour les deux plaques restantes. </li><li> Nettoyage plaque de 96 puits de transfection <ol><li> Les plaques de transfection de 96 puits peuvent être recyclés par lavage avec EtOH à 70% pour éviter la présence d&#39;acides nucléiques entre expériences. Effectuer deux 70% EtOH lavages en utilisant un flacon pulvérisateur pour remplir complètement chaque puits, suivi par essuyer l&#39;excès EtOH sur les bandes d&#39;électrodes (partie inférieure) et en permettant aux plaques de transfection à complètement sec dans la hotte de culture. NOTE: Nous avons testé de report contamination d&#39;ADN par puits 12 transfection avec 2 ug de chaque plasmide pmaxGFP dans des cellules HEK293T, suivi par un seul lavage avec EtOH à 70%, et une seconde transfection sans ADN plasmidique. Avec cette concentration extrêmement élevée de plasmide, journaliste extrêmement lumineux, et un seul lavage, il n&#39;y avait pas de fluorescence observable dans l&#39;une des 12 transfections répétées. </li></ol></li><li> Culture de cellules de 48 à 72 heures à 37 ° C, suivie par la double Lucifeffacer dosage. </li></ol> 6. lysat cellulaire Préparation pour dosage de luciférase <ol><li> Diluer le tampon de lyse avec 4 parties d&#39;eau, 1 partie de 5x tampon de lyse passif dans un réservoir. Calculez 26 pl / puits, ajoutant ~ 20 volumes supplémentaires pour tenir compte de la perte dans le réservoir. NOTE: Le tampon est conservé à -20 ° C et peut être extrêmement visqueuse, donc avant de permettre le tampon 5x pour approcher la température ambiante sera d&#39;améliorer la précision de pipetage. </li><li> Analyser chaque puits pour l&#39;efficacité de transfection en utilisant la microscopie de fluorescence. Notez toutes les incohérences dans les puits qui ne transfecter efficacement (&gt; 90% d&#39;efficacité de transfection), ou expriment de faibles niveaux de DP indicative de la surpopulation ou les médias épuisement. Enlevez ces puits de l&#39;analyse. </li><li> Supprimer complètement les médias à partir des cellules, en faisant attention de ne pas éluer trop rapidement qui sera amener les cellules à se détacher. REMARQUE: les médias restants seront diluera le lysat et causer des fluctuations de valeurs à travers experiments. </li><li> Ajouter 26 pi de tampon de lyse à chaque puits, et les placer sur une plaque agitateur / rocker à vitesse faible / modéré pour ~ 20-30 min. Utilisez ce temps pour préparer des tampons luciférase, laver et amorcer le luminomètre (s), et de transférer lysat à des plaques de mesure opaques. </li></ol> 7. Double Luciferase Assay NOTE: Si plusieurs plaques sont mesurées séquentiellement sur un luminomètre, créer des master mix tampons de tout, sauf de l&#39;ATP et des substrats, l&#39;ajout de ces réactifs suivie par un ajustement du pH immédiatement avant utilisation avec chaque plaque. ATP et substrats peuvent se dégrader au fil du temps; la cohérence dans le temps ces réactifs dans la zone tampon permettra d&#39;améliorer la cohérence entre plusieurs plaques. <ol><li> Préparer les tampons de luciférase 1x (tableau 1): <ol><li> Enroulez deux tubes (typiquement 15/50 ml tubes de centrifugeuses) contenant la luciole et de Renilla tampons de papier d&#39;aluminium, comme substrats peuvent être sensibles à la lumière. </li><li>Préparer tampon 1x de la luciférase Firefly. Ajouter 1 ml de chacune des cinq 10x réactifs de luciférase de luciole, l&#39;ajout d&#39;EGTA dernier, à 5 ml de H 2 0 à une concentration finale de 1 x. <ol><li> Ajouter 0,025 g ATP à 10 ml 1x tampon luciole. Mélanger en retournant plusieurs fois. Gardez ATP sur la glace en tout temps. ATP va se dégrader, si la mesure de plus d&#39;une plaque séquentiellement, tampon doit être faite début frais à cette étape pour chaque plaque supplémentaire. </li><li> Ajouter 100 pl de luciférine de coléoptère 100 (substrat) (tableau 1) tampon doit changer de couleur jaunâtre basé sur le pH. </li></ol></li><li> 1x Renilla luciférase tampon de reconstitution: Per plaque de 96 puits, aliquote de 10 ml de 1 &quot;tampon Renilla&quot;. <ol><li> Ajouter 100 pi de BSA (44 mg / ml) actions. </li><li> Si le dépistage plus d&#39;une plaque, master mix séparé en aliquotes de 10 ml. </li><li> Ajouter 100 pi de coelentérazine pour tamponner (précédemment aliquoté et stocké à 100x conc.) </li></ol></li> &lt;li&gt; Ajuster le pH de luciole 1x tampon à 8,0, suivi par le tampon 1x Renilla à 5,0 en utilisant NaOH et HCl. NOTE: L&#39;activité de chaque tampon, et la capacité de la mémoire tampon de Renilla pour étancher l&#39;activité de la luciférase de luciole est fortement dépendante du pH. Pour des résultats cohérents être extrêmement précis dans cette étape. </li><li> Amener le volume de chaque tampon (correspondant à la plaque 1 96 puits) à 10,5 ml pour accommoder luminomètre amorçage. </li></ol></li><li> Transfert lysat de plaques blanches opaques: A ce stade, les cellules doivent être dans un tampon de lyse pendant ~ 20 min. Prenez 25 pi de chaque puits en utilisant une pipette multicanaux, veillez à pipette de haut en bas à fond pour briser les amas de cellules et homogénéiser le lysat. </li><li> Préparer le luminomètre. Allumez le luminomètre et sélectionnez le protocole dans le dossier DLR, appelé &quot;DLR avec deux injections&quot;. Autres formats ne sont pas compatibles avec le pipeline d&#39;analyse de données (ci-dessous). <ol><li> Sélectionnez les puits pour être tintéressée (tous les puits est la valeur par défaut). </li><li> Étendre le «Retard avant la mesure &#39;mise à 5 secondes, avec un temps de mesure de 10 secondes (voir 29 pour l&#39;explication). </li><li> Capillaires lavage étapes: 3x d&#39;eau, EtOH 3x 3x, d&#39;eau, 3x sec. Tampons Prime fois dans les déchets, puis amorcer une deuxième fois de retour dans les tubes de tampon pour assurer le mélange. Injecter le tampon luciole premier et le premier dans le capillaire à gauche, suivi par Renilla dans la bonne capillaire. </li></ol></li><li> Initier le dosage de la luciférase. Chaque plaque devrait prendre ~ 48 min à lire. Après l&#39;achèvement enregistrer le fichier d&#39;abord, puis répétez les étapes de lavage et coupez le luminomètre. NOTE: Plusieurs plaques peuvent être lues et les données stockées sur le même fichier Excel, mais les problèmes peuvent être rencontrés avec plaque plusieurs lectures où le programme de luminomètre va se planter. Veillez à sauvegarder toutes les données entre les mesures et prendre des screenshots si le programme se bloque avant sauvegarde est possible. <ol><li> Remplacer les vieux tamponsavec le nouveau, en étant sûr de Premier au moins deux fois avec de nouveaux tampons avant de commencer la nouvelle plaque. </li></ol></li></ol> 8. Analyse des données <ol><li> Utiliser tableaux Excel &quot;de 3&#39;LIFE - analyse de plaque unique&quot; et &quot;3&#39;LIFE - analyse multidisques» disponible auprès <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> . Copiez les données brutes de luciole et de Renilla luciférase mesures de fichier de sortie de luminomètre dans des endroits correspondant à la condition négative, miRNA # 1, # 2 et miARN dans la &quot;3&#39;LIFE - analyse de plaque unique&quot; feuille de calcul. </li><li> La feuille de calcul calcule automatiquement luciole / rapport Renilla et normaliser chaque miARN au contrôle négatif approprié, et de normaliser les valeurs de répression à travers chaque plaque. NOTE: Cette feuille de calcul permettra d&#39;identifier automatiquement les puits à faible signal de la luciférase, mettez en surbrillance puits significativement réprimés, et de fournir des mesures de repressisur à travers la totalité de la plaque. Voir 24 pour une explication détaillée de l&#39;analyse statistique. <ol><li> Copier les valeurs de la boîte &quot;indice normalisé de RI&quot;, dans les cellules correspondantes dans le &quot;3&#39;LIFE - analyse multidisques&quot; feuille de calcul à la position correspondant à répliquer # 1 pour chaque miARN testé. Répétez l&#39;opération pour toutes les répétitions biologiques effectués sur des jours différents. </li></ol></li><li> Si vous le souhaitez, insérer les noms de gènes et de l&#39;état de prédiction de cible dans les colonnes B et D, respectivement. <ol><li> Laissez la feuille de calcul pour calculer automatiquement la moyenne de toutes les tôles. Respecter les données en format 96 ainsi qu&#39;une carte de chaleur (Figure 2). Le fichier organise également les données sous forme de liste (figure 2). NOTE: L&#39;indice de la répression est la mesure utilisée pour identifier des cibles miARN putatifs. Différents paramètres de stringence peuvent être utilisées, en fonction des préférences individuelles. En moyenne, nous considérons résultats probables dessous indice de répression de 0.8 et statistiquement significative par le test t (valeur p &lt;0,05). Comme le montre la Figure 3 cibles potentielles basées sur ces critères seront surlignées en rouge. </li></ol></li></ol>

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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. 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This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

Le dosage de 3&#39;LIFE identifie des cibles miARN fonctionnels dans 3&#39;UTRs à haut débit. Ce test est utile pour les chercheurs qui souhaitent identifier expérimentalement un grand nombre de cibles potentielles pour leur miARN d&#39;intérêt. Le dosage de 3&#39;LIFE est une approche puissante pour interroger 3&#39;UTR réglementation entraîné, en ce que le test fournit une mesure fonctionnelle de miARN ciblage, et le test binaire d&#39;un seul journaliste :: 3&#39;UTR contre un seul miARN peuvent aborder en to...

L&#39;objectif global de cette méthode est de détecter et cartographier précisément microARN (miARN) cibles à haut débit. MiRNAs sont des ARN endogènes non codantes ~ 22 nucleotides de longueur. Après la transcription et de la transformation, miARN matures sont incorporés dans un complexe protéique appelé l&#39;ARN Induced Silencing Complex (RISC). Chaque miARN guide le RISC pour cibler des éléments situés principalement dans les régions 3 &#39;non traduite (de 3&#39;UTRs) des ARN messagers (ARNm), aboutissant soit à la répression de la traduction ou clivage de l&#39;ARNm 1. MiRNA reconnaître les sites cibles basées sur la norme Watson-Crick et G: U Wobble appariement de bases, et sont dans la nature dégénérée, contenant de multiples paires de bases dépareillés et régions bombé. De nombreux miARN sont largement conservées à partir de plantes pour les humains 2,3, où ils jouent un large éventail de rôles biologiques. Chez les métazoaires miARN peuvent influencer plusieurs processus biologiques, y compris les décisions du destin cellulaire 4, le calendrier de développement 5 </sup&gt;, Et présentent souvent des profils d&#39;expression de tissus spécifiques 6,7. MiRNA misexpression peut également entraîner dans la régulation génique aberrante, qui peut avoir une influence considérable sur le comportement cellulaire basé uniquement sur la fonction des gènes cibles. En tant que tel, les miRNAs sont liés à un large éventail de maladies, y compris la neurodégénérescence 8,9, le diabète et le cancer 10 11. Bioinformatique et des approches humide banc suggèrent que chaque miARN peut être capable de cibler des centaines de milliers d&#39;ARNm distincts 12-14, ce qui indique que de larges approches à haut débit ou du génome sont nécessaires pour sonder cette grande piscine des interactions potentielles. L&#39;identification de gènes cibles est une composante essentielle de définir mécaniquement fonction miRNA, et pour ce faire les chercheurs doit être en mesure de révéler les cibles sur une grande échelle. Plusieurs approches ont été développées pour identifier des cibles miARN, y compris les algorithmes de prédiction bioinformatique, séquençage à haut débitdes ARNm ciblé et journaliste basé dosages. Chacune de ces approches a ses forces et faiblesses inhérentes. Étant donné que le miRNA ciblage est guidé par une spécificité de séquence, et plus particulièrement de 2 à 6 nucleotides du miARN (appelée la région de la graine), plusieurs algorithmes ont été développés pour prédire des cibles des miRNA dans le génome de plusieurs organismes. Ces algorithmes sont formés en utilisant les motifs observés d&#39;appariement de bases de cibles miARN validées, et utilisent souvent des paramètres tels que l&#39;appariement rigoureux des semences, de la conservation du site, et / ou stabilité thermodynamique 15. Bien que ces filtres affiner le grand nombre de cibles potentielles avec complémentarité suffisante pour objectifs de confiance seulement élevés, ils peuvent exclure les espèces sites cibles miARN spécifiques et non-canoniques, qui sont des preuves récentes suggèrent répandue 16-24. En outre, ces prévisions ne tiennent pas compte des mécanismes de traitement de l&#39;ARNm qui excluent sites cibles miARN, comme polyadénylation alternatif25, édition de l&#39;ARN 26 ARN méthylation 27 et liaison coopérative. En tant que tel, de hauts taux négatifs faux positifs et faux ont été signalés pour de nombreux algorithmes 22,24,28. Bien que ces algorithmes sont utiles pour identifier des cibles miARN candidats pour la validation expérimentale ultérieure, ces taux d&#39;erreur élevés limitent l&#39;efficacité des approches bioinformatiques pour la détection systématique cible miARN. Pour sonder systématiquement les interactions entre un miRNA donnée et 3&#39;UTRs potentiellement ciblés, nous avons développé un dosage à haut débit appelé luminescent identification des éléments fonctionnels dans 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24. Ce dosage des mesures de répression interactions directes et de translation de la 3&#39;UTR de test par une requête miARN utilisant un système rapporteur double luciférase. Dans ce système, la 3 &#39;UTR d&#39;un gène d&#39;intérêt est clone en aval de la luciférase (Fluc) reporter le cadre de lecture luciole. Les inconvénients rapporteurstruct est cotransfecté avec une requête miARN dans les cellules HEK293T. MiRNA ciblage est déterminée en mesurant la variation relative entre la fluc de test :: journaliste 3&#39;UTR et un deuxième non-spécifique de Renilla journaliste. Surtout, les dosages luciférase détectent les interactions miARN / ARNm fonctionnels qui influencent la sortie de translation de la journaliste. Ceci est un avantage clé par rapport aux méthodes traditionnelles pour détecter la réglementation miARN, comme la RT-qPCR et transferts de Western, dans cette contourne différences dans la dégradation de l&#39;ARNm et de la répression de la traduction, ainsi que des changements dans l&#39;abondance des protéines indépendante de régulation fondée 3&#39;UTR. dosages de la luciférase sont largement utilisés pour valider des cibles miARN directs en raison de leur simplicité et de sensibilité relative, mais leur utilisation dans les écrans à haut débit est limité par les coûts élevés associés à réactifs consommables, le manque de bibliothèques 3&#39;UTR provenant de sources publiques, et l&#39;absence normalisée de luciférase protPROTOCOLES, conduisant à des difficultés en comparant la répression fonctionnelle sur plusieurs jeux de données. Pour faciliter l&#39;utilisation de l&#39;essai de 3&#39;LIFE, nous avons mis l&#39;accent sur ​​la simplification de la conception expérimentale, utilisation de transfection 24 et luciférase réactifs non-commerciaux 29, la création d&#39;une bibliothèque 3&#39;UTR qui est régulièrement mis à jour et élargi, et est disponible à travers un plasmide publique référentiel 30. L&#39;évolutivité de l&#39;essai de 3&#39;LIFE permet le dépistage d&#39;une grande bibliothèque 3&#39;UTR pour le ciblage par un miARN donné sans solliciter l&#39;écran vers gènes identifiés bioinformatique. En plus de tester les interactions canoniques et prédites, cette approche systématique permet l&#39;identification de nouvelles cibles entraînés par des interactions non-canoniques et / ou espèces spécifiques. Fait important, l&#39;effet de miARN cible sur la production de protéine est généralement comprise dans modeste au résultat de la répression traductionnelle 15,31 &lt;/ Sup&gt;, ce qui suggère que le rôle primordial de la réglementation miARN est de peaufiner la production de protéines, protéger contre les niveaux aberrants de l&#39;expression des gènes, et de fournir la robustesse à la cellule des programmes spécifiques 32,33. La sensibilité du dosage de la luciférase combiné avec le intrinsèquement grand nombre d&#39;interactions négatives miARN / ARNm dans l&#39;écran de 3&#39;LIFE permet la détection des effets subtils de miARN cible sur un grand nombre de gènes, et l&#39;identification de plusieurs composants de réseaux de gènes que sont réglementés par un miARN donné 24. Ici, nous décrivons le protocole de 3&#39;LIFE, et de démontrer qu&#39;il est faisabilité par criblage deux miARN bien caractérisés, miR-10b et laissez-7c contre un panel de 275 3&#39;UTRs humaines (Figure 1).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycylglycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1127-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kx PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2222</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">FLAAS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4282</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luciferin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E0399</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K H2 P O4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1551139</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coelenterazine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS/HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5546</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pennicilin/Streptomicin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">T2600000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiPrep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A2392</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well miniprep plate</td>
			<td style="width:71px;">Pall</td>
			<td>8032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well shuttle plates</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">V4SP-2096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5x Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td>E1941&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instruments</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well GloMax Plate Reader</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E9032</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biomech FX Liquid Handler Robot</td>
			<td style="width:71px;">Beckmann</td>
			<td style="width:119px;">A31842</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4D-Nucleofector Core Unit</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAF-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well Shuttle System</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAM-1001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Counter Countess</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

Luminescente identification des éléments fonctionnels dans 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) permet l&#39;identification rapide des objectifs de miARN spécifiques dans un réseau de centaines de 3&#39;UTRs interrogés. identification de la cible est basée sur le dosage à double luciférase, qui détecte la liaison au niveau de l&#39;ARNm par la mesure de sortie en translation, ce qui donne une lecture fonctionnelle de miARN cible. 3&#39;LIFE utilise des tampons non-propriétaires et des réactifs, et des bibliothèques rapporteurs publiquement disponibles, ce qui rend les écrans de l&#39;ensemble du génome faisable et rentable. 3&#39;LIFE peut être effectuée soit dans un laboratoire standard ou mise à l&#39;échelle à l&#39;aide de robots de manipulation de liquides et d&#39;autres instruments à haut débit. Nous illustrons l&#39;approche utilisant un ensemble de données de 3&#39;UTRs humains clonés dans des plaques à 96 puits, et deux miARN de test, laissez-7c et miR-10b. Nous démontrons comment effectuer la préparation de l&#39;ADN, la transfection, la culture cellulaire et des dosages de la luciférase en format à 96 puits, et de fournir des outils pour les donnéesanalyse. En conclusion 3&#39;LIFE est hautement reproductible, rapide et systématique, et identifie des cibles de confiance élevés.

Le fichier de sortie de luminomètre contient des mesures brutes pour les deux protéines de luciole et la luciférase de Renilla. Ce format brut est compatible avec le &quot;3&#39;LIFE - analyse de plaque unique&quot; et &quot;3&#39;LIFE - analyse multidisques&quot; des feuilles de calcul disponible sur le site du laboratoire Mangone ( <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). La seule feuille de calcul d&#39;analyse de plaque calcule automatiquement luciole / rapport Renilla, norm...

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Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Détection de cibles miARN dans à haut débit utilisant le test de 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

10.0K vues.  Arizona State University. Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Vidéo: Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

Assay saccharification haut débit pour les matériaux lignocellulosiques

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

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Biologie

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

À haut débit de cartographie physique des chromosomes à l&#39;aide automatisée<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

ARN prédiction de la structure secondaire via SHAPE à haut débit

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Criblage à haut débit fonctionnelle utilisant une maison double lueur de dosage de luciférase

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identification de paires Kinase-substrat en utilisant criblage à haut débit


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...