Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la recherche translationnelle, telles que la relation entre les biomarqueurs en circulation et le pronostic du patient. Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’évaluer l’expression d’un panel de biomarqueurs circulants avec une méthodologie facile et fiable avec une faible quantité de matériel d’entrée. Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie des patients atteints de cancer parce qu’elle pourrait identifier les biomarqueurs circulants utiles dans la prise de décision et la surveillance du traitement des patients.
En outre, cette méthode peut fournir un aperçu de l’analyse des biomarqueurs en circulation. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que l’analyse de l’expression des biomarqueurs tissulaires pour la caractérisation moléculaire de la maladie. La démonstration visuelle de cette méthode est critique, car les étapes d’extraction sont difficiles à apprendre.
Pour commencer, transférez 400 microlitres de l’échantillon plasmatique dans un tube de deux millilitres sans RNase. Ajouter ensuite 400 microlitres de solution de dénaturation au tube. Ajouter quatre microlitres d’un nanomolaire spike-in.
Après avoir mélangé la solution, ajouter 800 microlitres de phénol-chloroforme acide. Vortex la solution pendant 60 secondes, et centrifugeuse à vitesse maximale pendant 15 minutes. Ensuite, transférez le lysate contenu dans la phase aqueuse supérieure à un tube propre, en prenant soin de ne pas perturber l’interphase.
Mesurer le volume de la phase aqueuse récupérée et ajouter 1/3 volume d’éthanol au lysate. Ensuite, placez une cartouche de filtre dans un tube de collecte frais. Transférer jusqu’à 700 microlitres du mélange éthanol-lysate dans la cartouche de filtre.
Centrifugeuse la cartouche de filtre pendant 30 secondes à 10 000 fois la gravité. Ensuite, mesurez le volume total du flux. Ajouter ensuite les 2/3 du volume d’éthanol au filtrate et bien mélanger.
Placer une deuxième cartouche de filtre dans un tube de collecte frais. Ensuite, transférez jusqu’à 700 microlitres de l’échantillon à la cartouche, et centrifugez à 10 000 fois la gravité pendant 30 secondes avant de jeter le flux. Ajoutez 700 microlitres de solution de lavage microARN à la cartouche de filtre, et centrifuger avec un tube de collecte à 10 000 fois la gravité pendant 15 secondes.
Jetez le flow-through, et remettre la cartouche de filtre dans le même tube. Après cela, déplacez la cartouche de filtre dans un nouveau tube de collecte. Ajouter ensuite 100 microlitres de solution d’élitution préchauffée à la cartouche.
Centrifugez la cartouche du filtre à 10 000 fois la gravité pendant 30 secondes pour récupérer les microARN. Préparer le cocktail de mélange de réaction de polyadenylation selon le protocole du texte. Transférer deux microlitres de l’échantillon à chaque puits d’une plaque de réaction.
Ajouter ensuite trois microlitres du cocktail de réaction à chaque puits. Vortex et centrifugeuse de la plaque brièvement pour faire tourner le contenu. Ensuite, placez la plaque dans un cycleur thermique, et suivez la procédure décrite dans le protocole de texte.
Préparer le cocktail de mélange de réaction de ligature dans un tube de centrifugeuse. Ensuite, ajouter 10 microlitres du cocktail à chaque puits de la plaque de réaction. Ensuite, mélanger le contenu de la plaque de réaction sur un shaker à 1900 rpm pendant une minute, suivi d’une brève centrifugeuse de la plaque.
Après cela, placez la plaque de réaction dans un cycleur thermique, et suivez la procédure décrite dans le protocole de texte. Pour effectuer la réaction de transcription inverse, préparez le mélange de réaction dans un tube de centrifugeuse selon le protocole de texte. Ajouter ensuite 15 microlitres du mélange à chaque puits de la plaque contenant du produit de ligature.
Mélanger le contenu de la plaque sur un shaker à 1 900 r/min pendant une minute, suivi d’une brève centrifugeuse de la plaque. Ensuite, placez la plaque dans un cycleur thermique, et suivez la procédure décrite dans le protocole de texte. Ensuite, préparer le mélange de réaction miR-Amp, et ajouter 45 microlitres du mélange à chaque puits d’une nouvelle plaque de réaction.
Après cela, ajouter cinq microlitres du produit RT à chaque puits de la plaque de réaction. Mélanger l’assiette sur un shaker à 1 900 r/h pendant une minute, suivi d’une brève centrifugeuse de la plaque. Ensuite, placez la plaque dans un cycleur thermique, et suivez la procédure décrite dans le tableau un du protocole de texte.
Tout d’abord, diluer chaque échantillon cDNA dans le tampon TE. Ensuite, préparez le mélange de réaction PCR dans un tube de centrifugeuse. ajoutant 10% du volume en excès.
Transférer 19 microlitres du mélange de réaction à chaque puits de la plaque. Sceller brièvement la plaque et la centrifuger. Enfin, effectuez le protocole thermique sur un système RT-PCR, tel que décrit dans le tableau deux du protocole texte.
Des dilutions périodiques du contrôle spike-in ont été exécutées afin de choisir quelle était la meilleure concentration à ajouter dans tous les échantillons de plasma de cette série particulière de cas. Grâce à ce protocole, il a été possible d’évaluer tous les biomarqueurs chez chaque patient, ainsi qu’un seul biomarqueur dans la série globale de cas. Dans ce protocole, un panneau des miARN circulants angiogenèse-connexes par rapport à la survie progression-libre, à la survie globale, et au taux de réponse objectif a été analysé dans les patients présentant le cancer côlorectal traité avec un régime de chimiothérapie.
En comparant les niveaux d’expression du miRNA entre la ligne de base et la première évaluation clinique, une augmentation du has-miR-155-5p a été observée. Cette augmentation a été associée à un SFP et à un système d’exploitation plus courts. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’effectuer les étapes en utilisant phénol-chloroforme sous un capot de fumée. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme l’isolement et l’analyse des protéines circulantes ou le codage des ARN peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions, comme l’évaluation d’un panel plus exhaustif de biomarqueurs en circulation.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biopsie liquide pour explorer l’expression des biomarqueurs circulants chez les patients atteints de cancer. N’oubliez pas que le travail avec le sang et les réapprovisionnements chimiques peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que les gants et le manteau de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
