This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

<ol>
	<li>Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+specific+force+and+power+production+of+muscle+fibers+from+myostatin-deficient+mice+are+associated+with+a+suppression+of+protein+degradation.">Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation.</a> J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).</li><li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy.">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li><li>Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r., Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears.">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li><li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths.">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li><li>Chase, P. B., Kushmerick, M. 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Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li><li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells.">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li><li>Chase, P. B., Kushmerick, M. 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L&#39;évaluation des propriétés contractiles des fibres musculaires squelettiques simples perméabilisées sont utilisées pour étudier la fonction musculaire dans une grande variété de contextes. Les exemples incluent les études qui ont évalué les effets du vieillissement, 12 exercer 10,13,14, 15 vols spatiaux, des blessures 2,3,16, traitements médicamenteux 17,18, 19 maladies et les manipulations génétiques 20,21 sur la structure et la fonction des fibres. En raison de la capacité d&#39;évaluer directement la performance contractile des myofibrilles dans leur configuration native, cette technique fournit une plate-forme attrayante pour partir à former une compréhension de la fonction myofibrillaire absent des effets potentiellement confondants qui sont présents lorsque la transmission du signal neuromusculaire et la libération de calcium induite par l&#39;excitation- sont inclus dans le système étudié. En outre, les tests fonctionnels de fibres simples peut être utilisé pour compléter les résultats de l&#39;identification de protéines contractiles telles que cellesobtenu par immunohistochimie ou électrophorèse sur gel + western blot 22. Une des principales fonctions du muscle squelettique est de générer de la force. Par conséquent sF o, une mesure de la capacité de génération de force intrinsèque d&#39;un système contractile, est d&#39;un grand intérêt pour les physiologistes musculaires. Des estimations fiables de la SF o exigent des mesures précises des deux ASC de la fibre et F o. Depuis fibres sont, en général, ni circulaire en coupe, ni uniforme dans la norme CSA sur toute leur longueur, un grand soin doivent être prises lors de l&#39;estimation CSA. A cet effet, les mesures sont effectuées à plusieurs endroits le long de la longueur de la fibre et, à chaque emplacement, à partir de deux points de vue séparés par 90 °. Des mesures fiables de F o nécessitent une attention à plusieurs détails, y compris la comptabilisation des force passive, ajuster la longueur des sarcomères de maximiser le chevauchement des filaments épais et minces, en utilisant une solution d&#39;activation avec une concentration de calcium tRésultats sur le chapeau de l&#39;activation maximale, en maintenant la température expérimentale désirée, et le maintien de conditions optimales de stockage (température et durée) des fibres avant le jour de l&#39;expérience. Bien que les étapes décrites ci-dessous décrivent la procédure pour évaluer la force isométrique maximale, il est souvent souhaitable d&#39;évaluer d&#39;autres qualités fonctionnelles importantes de fibres musculaires squelettiques. Ceci peut être obtenu en étendant le protocole expérimental afin d&#39;inclure d&#39;autres manipulations mécaniques de la fibre. Par exemple, la mesure de la vitesse à laquelle la fibre raccourcit contre une série de différentes charges permet la détermination de la relation force-vitesse, à partir de laquelle les relations de force de puissance et vitesse puissance peuvent être calculées 10,23,24. En outre, la vitesse de raccourcissement sans charge peut être déterminée en utilisant le «test mou&quot; 25, qui consiste à appliquer une série de mesures et DE MESURE raccourcissement creuses induisantng le temps requis par la fibre pour enlever le mou. Un autre paramètre cinétique qui est fréquemment rapporté est tr k, la constante de vitesse pour la force réaménagement suivant une perturbation mécanique qui détache temporairement tous les ponts transversaux 26. Enfin, la relation entre la concentration de calcium et la génération de la force active (la &quot;relation force-PCA») est souvent un intérêt 18 et peut être déterminée en exposant la fibre à une série de solutions avec des concentrations en calcium allant de en dessous du seuil d&#39;activation de l&#39;contractile système à ceux suffisante pour déclencher l&#39;activation maximale et donc la force maximale (F o). Bien que la majeure partie de l&#39;équipement mentionné est nécessaire pour évaluer la contractilité seule fibre, d&#39;autres équipements est pas absolument nécessaire. Le régulateur de longueur, par exemple, est essentiel pour tout protocole expérimental qui nécessite un allongement ou raccourcissement rapide et précise de la fibre,mais ne sont pas absolument nécessaires pour évaluer la force isométrique maximale (si un niveau dans le dossier de force zéro force doit toujours être identifié par des moyens). Les prismes qui permettent l&#39;observation de la fibre par le côté, tout en étant utile pour l&#39;évaluation de surface de section transversale, ne sont pas absolument nécessaire lors du positionnement de la fibre à l&#39;intérieur de la chambre expérimentale. En outre, des moyens de remplacement pour exposer la fibre à des différentes solutions expérimentales peuvent être employés, y compris la conception d&#39;un système à commande manuelle de chambres ou une chambre unique qui permet le remplissage et la vidange rapide de solutions. Enfin, alors que les températures expérimentales sous-physiologiques telles que 15 ° C sont habituellement utilisés pour améliorer la reproductibilité des mesures mécaniques 1,2,3,5,8,12,17,27, il est possible de générer des données valides à d&#39;autres températures 23 , 28 aussi longtemps que les effets de la température sur les propriétés de la solution (concentration de calcium, le pH, etc.) sont pris en considération. </p&gt; Les compositions des solutions de test sont parmi les aspects les plus critiques des techniques de fibres perméabilisées décrites ici. Considérations concernant la composition de la solution est complexe et dépasse la portée de cet article. Les solutions décrites dans l&#39;étape 5 de la section de protocole sont conçus en mettant l&#39;accent sur ​​une activation rapide de la fibre perméabilisées lors de leur transfert à partir de pré-activation pour l&#39;activation de solutions tout en maintenant une force ionique constante, la composition cationique, et l&#39;osmolarité 6,29. D&#39;autres approches de composition de la solution ont été utilisées avec un succès notable par d&#39;autres groupes de recherche et généralement faire usage de constantes de liaison publiés et des outils informatiques 27,30,31. Les concentrations d&#39;ions calcium dans les différentes solutions d&#39;activation est particulièrement important dans les études impliquant une activation submaximale telles que les évaluations de force PCA. Pour les expériences dans lesquelles les fibres sont entièrement activés, tels que ceux décrired ici, la concentration de calcium dans la solution d&#39;activation dépasse généralement avec une marge confortable que nécessaire pour obtenir la force maximale, ce qui rend sa connaissance précise moins critique. L&#39;addition de phosphate de créatine est important pour tamponner les fluctuations intramyofibrillar ATP et ADP qui seraient autrement associés à l&#39;activité contractile. La créatine kinase est nécessaire pour catalyser le transfert de phosphate de créatine phosphate à l&#39;ADP. Dans des conditions expérimentales qui se traduisent par des taux de rotation élevés, y compris l&#39;ATP à travailler à des températures élevées ou raccourcissement de mesure à grande vitesse en 32 fibres rapides, la créatine kinase doit être ajouté à la solution pour compléter la créatine kinase endogène qui reste lié à la fibre. Pour des conditions expérimentales moins exigeantes, le système de régénération d&#39;ATP 27 est moins critique. Limites de la technique perméabilisée de fibre unique sont les suivants. Les données générées par ces tests définissent lapropriétés contractiles myofibrillaires de l&#39;unité spécifique qui a été attaché à l&#39;appareil expérimental. Par conséquent, cette capture seulement une petite fraction de l&#39;ensemble de fibres à partir de multinucléées laquelle le segment a été obtenu qui, à son tour, représente une petite fraction du nombre total de fibres dans le muscle. Les enquêteurs doivent donc examiner attentivement l&#39;échantillonnage requis pour appuyer des conclusions tirées des expériences. En outre, l&#39;évaluation de l&#39;impact d&#39;une intervention de l&#39;entraînement physique sur la fonction de la fibre présume que les fibres évalués ont en effet été recrutés au cours de la formation. Bien que le protocole tente d&#39;imiter le milieu intracellulaire naturel de la fibre, le procédé de perméabilisation de sarcolemme est non spécifique et permet nécessairement constituants intracellulaires solubles diffusent librement dans les solutions de bain. Une autre conséquence de la perméabilité de la membrane est un changement dans l&#39;équilibre osmotique mis en évidence par un gonflement en volume de fibres 33. Legonflement de la fibre augmente la distance entre l&#39;actine et la myosine résultant de la sensibilité réduite de calcium du système de myofilaments 34,35, mais peut être inversée par l&#39;introduction de grandes composés osmotiquement actifs 34. Une dernière limite à considérer est la conséquence de la technique utilisée pour fixer les fibres de l&#39;appareil expérimental. Cela exige invariablement fausser la relation spatiale au sein du système de filament à et à proximité des points d&#39;attache, à la participation à des déficits fonctionnels. Plus précisément, les régions de la fibre à et adjacente aux points de fixation sont fonctionnellement compromise et contribuent ainsi artéfactuelle série élasticité au système de mesure. En résumé, nous avons décrit un moyen permettant d&#39;évaluer la capacité de génération de force de fibres musculaires squelettiques perméabilisées chimiquement in vitro. Bien que l&#39;objet de cet article a été mis sur l&#39;évaluation des generatin maximale de force isométriqueg capacité des fibres musculaires squelettiques humaines, l&#39;approche expérimentale peut être modifiée et étendue afin de déterminer une variété de paramètres cinétiques et les relations à travers une gamme d&#39;espèces de mammifères, ou autrement.

La principale fonction du muscle squelettique est de générer de la force. la force musculaire est provoquée in vivo par une séquence complexe d&#39;événements qui comprend potentiels nerveuses motrices d&#39;action, la transmission neuromusculaire, fibres musculaires des potentiels d&#39;action, la libération de calcium intracellulaire, et l&#39;activation du système de protéines régulatrices et contractiles. Parce que la génération de force est le résultat final de cette séquence, un déficit en vigueur pourrait être causée par la défaillance d&#39;un ou plusieurs des étapes individuelles. Un attribut clé de la préparation de fibres perméabilisées est qu&#39;il élimine la plupart des étapes nécessaires à la génération de force in vivo, avec seulement les fonctions de réglementation et contractiles associés à l&#39;appareil myofibrillaire restant. L&#39;enquêteur assume le contrôle de la livraison de l&#39;activation de calcium et de l&#39;énergie (ATP), et est récompensé par un système simplifié qui permet l&#39;évaluation des structures de réglementation et contractiles isolés dans leur co natifnfiguration. Mesures de force utilisant des fibres musculaires squelettiques perméabilisées sont donc précieux lors de l&#39;évaluation des modifications de la fonction musculaire observée in vivo. Par exemple, nous avons utilisé cette technique pour caractériser la capacité de génération de force de fibres de myostatine souris déficientes 1 et d&#39;évaluer la cause de la faiblesse musculaire persistante exposé suivant rotateurs chronique rotateurs 2,3. Méthodologie de fibres perméabilisées moderne peut être attribuée à des études influentes début des 4,5 et est actuellement utilisé par un certain nombre de groupes de recherche. Bien que les techniques ont été décrites dans la littérature, il n&#39;a pas encore été présenté dans le format vidéo. Le but de cet article est d&#39;illustrer, une technique valide et fiable mise à jour pour mesurer la capacité maximale de production de force de fibres simples à partir d&#39;échantillons de muscles squelettiques perméabilisées chimiquement. Pour ce faire, un segment de fibre individuelle (désigné ici en tant que ̶0; fibre &quot;) est extraite à partir d&#39;un paquet pré-perméabilisées et de fibres placées dans une chambre contenant une solution expérimentale au repos, le trait caractéristique de ce qui est une concentration en calcium qui est &lt;10 nM. La fibre est ensuite fixé à une extrémité à un transducteur de force et à l&#39;autre extrémité à un dispositif de commande de longueur. Avec la fibre maintenu à une longueur de sarcomère optimale, il est transféré à une solution d&#39;activation qui a une concentration en calcium suffisante pour provoquer l&#39;activation maximale et la force de contraction isométrique ainsi maximale. Force données sont acquises, stockées et analysées à l&#39;aide d&#39;un ordinateur personnel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene culture test tube with cap</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-956-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL screw cap micocentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge cryobox</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>5055-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-757-11YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonsterile-suture 10-0 monofilament</td>
			<td>Ashaway Line Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer drives</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath circulator&#160;</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Aplha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Varied</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>802D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length-controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force-transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-proprionate</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imadizole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 58</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2ATP&#8226;0.56H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTA (acid)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>35113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CrP&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Fibres simples sains, perméabilisées chimiquement devraient apparaître uniforme en forme et avoir l&#39;espacement des stries cohérente lorsqu&#39;on les examine sous un fort grossissement. Les fibres qui sont inflexibles lorsqu&#39;il est manipulé avec les forceps ou avoir des dommages structurels évidents doivent être jetés. Des images numériques à fort grossissement prises au cours de l&#39;étape 15 sont analysées pour cinq mesures de diamètre par paires le long de la section médiane de la fibre. Fibre CSA est estimée en supposant une section transversale elliptique et une moyenne de 5 mesures de la CSA individuels comme représenté sur la figure 7A. Figure 7B sert également à illustrer comment les dimensions des fibres dans une vue peuvent être significativement différents par rapport aux dimensions appariés dans l&#39;autre vue (c.-à-cross les sections ne sont pas, en général, année). Traces de forces représentatifs de fibres lentes et rapides humains sont présentés sur les figures 8A et 8B, respectivement. Voltagsortie e du transducteur de force est acquise lors d&#39;un test et convertie de force (mN) à l&#39;aide d&#39;acquisition de données et des logiciels d&#39;analyse (LabVIEW). Figure 9 illustre l&#39;approche utilisée pour évaluer la force active maximale (F o), qui est calculé en soustrayant la force nécessaire pour maintenir la fibre à longueur optimale de sarcomère tandis que dans un état ​​de relaxation (force passive, F P), de la plus grande force isométrique développé lors de l&#39;activation de la fibre maximale (de la force totale, F T). Depuis la sortie du transducteur de force qui correspond à une force nulle est, en général, différente pour chacune des différentes chambres de bain, on desserrer brièvement la fibre à la fois dans la pré-activation et l&#39;activation de solutions pour capter le niveau du zéro de la force fiche expérimentale. Normalisation de la force active maximale par le CSA de fibre est utilisée pour générer le plus de valeur informative de la force spécifique (SF o). Parce qu&#39;elle prend en considération le CSA de la fibre, SF o </sub&gt; fournit une mesure de la capacité de génération de force intrinsèque de l&#39;appareil contractile de la fibre, ce qui permet des comparaisons fonctionnelles entre les fibres de dimensions disparates. Il convient toutefois de noter que les mesures de la CSA sont pas en mesure de distinguer la proportion de la fibre de filaments contractiles occupé par rapport à la proportion occupée par d&#39;autres structures sous-cellulaires. Les caractéristiques typiques de santé, des fibres adultes de Claflin et al., 2011 10 pour l&#39;homme, Mendias et al. 2011 1 pour la souris et Gumucio et al. 2012 2 pour rat sont détaillés dans le tableau 3. Toutes les données présentées dans le tableau 3 ont été générés en utilisant la techniques décrites dans cet article. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Humain (Vaste externe) </strong&gt; </td><td> Souris (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Rat (Infra) </td></tr><tr><td colspan="2"> Mâle </td><td colspan="2"> Femme </td><td> Mâle </td><td> Mâle </td></tr><tr><td> Type 1 </td><td> Type 2a </td><td> Type 1 </td><td> Type 2a </td><td> (Pas tapé) </td><td> (Pas tapé) </td></tr><tr><td> CSA (pm 2) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F o (mN) </td><td> 0,79 à 1,17 </td><td> De 1,02 à 1,54 </td><td> 0,64 à 0,97 </td><td> 0,71 à 1,07 </td><td> 0,14 à 0,25 </td><td> 0,55 au 0,97 </td></tr><tr><td> SF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Les caractéristiques typiques de la santé, des fibres adultes de vastus lateralis humaine 10, extenseur des orteils de la souris et le rat épineux 1 2 muscles. Longueurs de sarcomériques optimales ont été fixés à 2,7 um pour les fibres humaines 7,8 et 2,5 um à la fois pour la souris (36, 37) et des fibres de rat (38). Gammes expérimentale L f (25 e et 75 e quartiles) étaient de 1,39 à 1,73 mm, de 1,17 à 1,53 mm et de 1,32 à 1,59 mm pour l&#39;homme, la souris et le rat, respectivement. Plages indiquées indiquent les 25 ème et 75 ème quartiles et n est le nombre de fibres testées. Les problèmes les plus courants rencontrés lors des tests comprennent un bordereau de boucle de suture, ce qui en résulte une force responsabe avec un &quot;catch&quot;, telle que celle illustrée sur la figure 10A, et une déchirure d&#39;épaisseur partielle ou totale de la fibre, ce qui entraîne une réaction de force qui retourne brusquement vers ou à (pause) zéro tandis que la fibre est toujours immergée dans la solution d&#39;activation (Figure 10B). Si un lapsus, déchirure ou de bris lors d&#39;une expérience, la fibre doit être jeté et les données exclue, même si le maintien d&#39;un enregistrement sur ​​les défaillances de la fibre peut aussi être informative 11. Un autre résultat négatif qui peuvent être rencontrées est l&#39;activation prématurée de la fibre tandis que dans la solution (Figure 10C) pré-activation. Activation partielle dans la solution pré-activation suggère une contamination entre puits significative (soit une augmentation involontaire de la concentration de calcium dans le pré-activation bien). Dans ce cas, tous les bains devraient être aspirés et bien rincés à l&#39;eau déminéralisée. Séchage des surfaces de séparation entre les chambres est également recomded que l&#39;humidité ou de la condensation dans ces domaines peuvent conduire à l&#39;évacuation de solution entre les bains. La décision d&#39;inclure ou d&#39;exclure des données dépendra en définitive la mise au point expérimentale et devraient donc être considérées lors de la conception de l&#39;étude. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figure 1: boucle de suture (10-0 monofilament en nylon de suture). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figure 2:. Dissection Bundle Forceps sont dans la main gauche, des ciseaux de microdissection sont dans la main droite. La ligne rouge indique l&#39;orientation favorable du poignet et des ciseaux avec les axes longitudinaux des fibres. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figure 3: </strong&gt; (A) Appareil de test avec des composants marqués. (A) des chambres expérimentales avec des fonds transparents. (B) Longueur-contrôleur. (C) transducteur de force. (D) de la source lumineuse. (E) Longueur-contrôleur xyz micromètre entraînement avec affichage numérique. (F) Stade micromètre entraînement avec affichage numérique. (G) transducteur de force xyz micromètre entraînement. (H) Programme d&#39;calibré écran cible diffraction laser. Table de l&#39;isolement (i) de vibration. (B) Gros plan des chambres expérimentales. Surface (j) de fixation en acier inoxydable étendant à partir de la longueur-contrôleur. Surface (k) de fixation en acier inoxydable étendant à partir du transducteur de force. (L) Side-view prisme. (M) de logement pour les modules de refroidissement thermoélectrique. (N) thermocouple pour signaler chambre température. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figure 4: modification 100 pipette ul utilisé pour transférer des fibres de plat de dissection à la chambre expérimentale. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figure 5:. Montage fibre unique sur appareil expérimental (A) des boucles de suture préparés enfilés sur des surfaces de fixation en acier inoxydable. (B) Fibre transféré à la chambre expérimentale. (C) Fibre ancrée sur les surfaces de fixation en acier inoxydable selon la première paire de boucles de suture avec un excès de suture enlevés. (D) Deuxième paire de boucles de suture filetés sur le dessus de premières boucles de suture et attachés en place. <img alt="Figure 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figure 6: Sarcomère longueur est déterminée par la projection d&#39;un motif d&#39;interférence laser sur un écran cible calibré (a) la source de laser.. (B) Mirror. (C) l&#39;écran cible. Motif d&#39;interférence (d) au laser. <img alt="La figure 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="Figure 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figure 7: (A) Détermination de la zone fibre coupe à longueur optimale de sarcomère (humaine = 2,7 um). En supposant une section transversale elliptique, l&#39;ASC est calculé pour chacun des cinq emplacements le long de la section médiane de la fibre et la moyenne des cinq mesures individuelles est rapporté comme CSA de la fibre. 2a représente le diamètre supérieur de la vue et est<html> un axe de l&#39;ellipse, 2b représente diamètre vue latérale et l&#39;autre est l&#39;axe de l&#39;ellipse. (B) images de fibres représentatives illustrant chacune des cinq mesures de diamètre correspondantes prises à la fois dans la vue de dessus et de côté. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figure 8: traces de force représentatifs de vastus lateralis humain sain fibres musculaires (A) de type 1 fibres (CSA: 5710 um 2, F o: 0,89 mN et SF o: 156 kPa).. (B) le type de fibre 2a (CSA: 9510 um, 2 F o: 1,66 mN et SF o: 174 kPa). Fibre myosine type de chaîne lourde a été déterminée par l&#39;utilisation de séparation électrophorétique et l&#39;argent-coloration techniques 22. ADO / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figure 9: Calcul de la force active maximale (F o) (a) vue élargi de la réponse de la force de la fibre pendant le mouvement de mou induisant de la longueur contrôleur initié en solution de pré-activation.. F P est la force nécessaire pour maintenir une longueur de sarcomère de 2,7 um avec la fibre au repos. (B) de vue élargi de longueur contrôleur mouvement de slack-induisant. Notez que F o = F T - F P. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figure 10: (A) boucle de suture glissement, comme en témoigne une &quot;capture&quot; en vigueur trace lors de la montée de la force. Vérifiez que les boucles sont sécurisées avant d&#39;activer la fibre. (B) la rupture de la fibre lors de l&#39;activation. Peut-être en raison de l&#39;intégrité des fibres pauvres ou traitement de fibres agressif pendant suture boucle lieument. (C) l&#39;activation des fibres partielle prématurée due à la contamination de la chambre de pré-activation avec Ca 2+.

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Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

L&#39;analyse des propriétés contractiles des fibres musculaires squelettiques chimiquement peau, ou perméabilisées offre un puissant moyen permettant d&#39;évaluer la fonction musculaire au niveau de la cellule musculaire unique. Dans cet article, nous présentons une technique valide et fiable pour préparer et tester perméabilisées fibres musculaires squelettiques in vitro.

Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K vues.  University of Michigan Medical School.  L'analyse des propriétés contractiles des fibres musculaires squelettiques chimiquement peau, ou perméabilisées offre un puissant moyen permettant d'évaluer la fonction musculaire au niveau de la cellule musculaire unique. Dans cet article, nous présentons une technique valide et fiable pour préparer et tester perméabilisées fibres musculaires squelettiques in vitro. 

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Mesure de la cohésion globale par tensiométrie surface du tissu

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Bio-ingénierie

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilisation bactérienne pour l&#39;imagerie par microscopie à force atomique

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Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

Les tissus d&#39;ingénierie muscle squelettique de myoblastes murins cellules progénitrices et application d&#39;une stimulation électrique

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biocapteurs pour la détection de bactéries aux antibiotiques de staphylocoques résistants

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

Préparation des membranes sensibles à la lumière par une greffe de surface combiné et processus Modification ultérieure

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Surface de mesure potentielle de bactéries utilisant Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

des applications de<em&gt; In Vivo</em&gt; Tests fonctionnels du Rat jambier antérieur pour l&#39;évaluation de l&#39;ingénierie tissulaire Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Mesure de la dynamique des protéines sensibles à la Force dans les cellules vivantes à l’aide d’une combinaison de Techniques Fluorescent

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.