This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

<ol>
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Le valutazioni delle proprietà contrattili di fibre muscolari scheletriche singole permeabilizzate sono usati per studiare la funzione muscolare in un&#39;ampia varietà di contesti. Alcuni esempi sono gli studi che hanno valutato gli effetti dell&#39;invecchiamento 12, esercitare 10,13,14, 15 voli spaziali, lesioni 2,3,16, trattamenti farmacologici 17,18, malattie 19 e di manipolazione genetica 20,21 sulla struttura e la funzione delle fibre. A causa della capacità di valutare direttamente le prestazioni contrattile miofibrille nella loro configurazione nativa, questa tecnica fornisce una piattaforma interessante da cui formare una comprensione della funzione miofibrillare assente di effetti potenzialmente confondenti che sono presenti quando la trasmissione del segnale neuromuscolare e rilascio di calcio di eccitazione indotta sono inclusi nel sistema studiato. Inoltre, collaudo funzionale di singole fibre può essere utilizzato per integrare proteine ​​contrattili risultati di identificazione come quelliottenuta attraverso immunoistochimica o elettroforesi su gel + Western Blot 22. Una delle funzioni primarie del muscolo scheletrico è quello di generare forza. Conseguentemente sF o, una misura della capacità di forza generatrice intrinseca di un sistema di contrazione, è di grande interesse per fisiologi muscolari. Stime attendibili di sF o richiedono misure accurate di entrambi fibra CSA e F o. Poiché le fibre sono, in generale, non circolare in sezione trasversale, né uniformi in CSA lungo la loro lunghezza, molta cura deve essere presa nella stima CSA. A tal fine, le misurazioni vengono effettuate a diverse posizioni lungo la lunghezza della fibra e, in ogni posizione, da due prospettive separate di 90 °. Misure affidabili di F o richiedono attenzione ai diversi dettagli, tra cui la contabilità per forza passiva, regolando la lunghezza sarcomero per massimizzare sovrapposizione di filamenti spessi e sottili, impiegando una soluzione attivante con una concentrazione di calcio trisultati cappello di attivazione massima, mantenendo la temperatura desiderata sperimentale, e mantenere condizioni ottimali (temperatura e durata) delle fibre precedenti il ​​giorno dell&#39;esperimento. Mentre la procedura descritta descrivono la procedura di valutazione massima forza isometrica, è spesso desiderabile per valutare altri importanti caratteristiche funzionali delle fibre muscolari scheletriche. Ciò può essere ottenuto estendendo il protocollo sperimentale per includere ulteriori manipolazioni meccaniche della fibra. Ad esempio, la misurazione della velocità con cui la fibra accorcia contro una serie di carichi diversi permette di determinare il rapporto forza-velocità, da cui i rapporti forza potenza e velocità-potenza possono essere calcolati 10,23,24. Inoltre, la velocità di accorciamento a vuoto può essere determinato utilizzando il &quot;test slack&quot; 25, che consistono di applicare una serie di passaggi di accorciamento-allentamento indurre e misng il tempo richiesto dalla fibra per eliminare l&#39;allentamento. Un altro parametro cinetica che viene spesso segnalato è k tr, la costante di velocità per la forza di riqualificazione a seguito di una perturbazione meccanica che distacca temporaneamente tutti crossbridges 26. Infine, il rapporto tra la concentrazione di calcio e la generazione forza attiva (la &quot;relazione forza-APC&quot;) è spesso di interesse 18 e può essere determinata esponendo la fibra ad una serie di soluzioni con concentrazioni di calcio che vanno da sotto la soglia di attivazione del contractile Sistema a quelli sufficienti per suscitare massima attivazione e quindi la massima forza (F o). Anche se gran parte del materiale di cui è necessaria per valutare la contrattilità singola fibra, altre apparecchiature non è assolutamente necessario. Il regolatore di lunghezza, per esempio, è essenziale per qualsiasi protocollo sperimentale che richiede allungamento rapida e precisa o accorciamento della fibra,ma non è assolutamente necessaria per valutare la forza isometrica massima (anche se un livello zero forza nel record forza deve ancora essere identificato da alcuni mezzi). I prismi che permettono l&#39;osservazione della fibra dal lato, mentre utile per valutare sezione trasversale, non sono assolutamente necessarie durante il posizionamento della fibra all&#39;interno della camera sperimentale. Inoltre, mezzi alternativi per esporre la fibra alle varie soluzioni sperimentali potrebbe essere impiegato, compresi l&#39;ideazione di un sistema di azionamento manuale di camere o un&#39;unica camera che permette un rapido riempimento e svuotamento delle soluzioni. Infine, mentre le temperature sperimentali sub-fisiologiche come 15 ° C sono comunemente utilizzati per migliorare la riproducibilità delle misurazioni meccaniche 1,2,3,5,8,12,17,27, è possibile generare dati validi ad altre temperature 23 , 28 purché gli effetti della temperatura sulla proprietà della soluzione (concentrazione di calcio, pH, etc.) sono presi in considerazione. </p&gt; Le composizioni delle soluzioni di prova sono tra gli aspetti più critici delle tecniche fibre permeabilizzate qui descritte. Considerazioni riguardanti composizione della soluzione sono complesse e al di là della portata di questo articolo. Le soluzioni descritte al punto 5 della sezione di protocollo sono stati progettati con particolare attenzione alla rapida attivazione delle fibre permeabilizzate sul suo trasferimento da pre-attivazione per attivare soluzioni, pur mantenendo una forza costante ionica, la composizione cationica, e osmolarità 6,29. Altri approcci alla composizione della soluzione sono stati impiegati con notevole successo da parte di altri gruppi di ricerca e di solito fare uso di costanti di legame pubblicati e strumenti computazionali 27,30,31. Le concentrazioni di ioni calcio nelle varie soluzioni attivanti è particolarmente importante negli studi che coinvolgono l&#39;attivazione submassimale come valutazioni forza-PCA. Per gli esperimenti in cui le fibre sono completamente attivati, come quelli descrivered qui, la concentrazione di calcio nella soluzione attivante supera tipicamente da un margine comodo quella necessaria per ottenere la massima forza, rendendo la sua precisa conoscenza meno critica. L&#39;aggiunta di creatina fosfato è importante per la bufferizzazione fluttuazioni ATP e ADP intramyofibrillar che altrimenti essere associati con attività contrattile. La creatina chinasi è necessaria per catalizzare il trasferimento di fosfato da creatina fosfato a ADP. In condizioni sperimentali che determinano elevati tassi di turnover ATP, compresi lavorare ad alte temperature o di misura accorciamento ad alta velocità in fibre veloci 32, creatina chinasi deve essere aggiunto alla soluzione per integrare la creatina chinasi endogena che rimane legata alla fibra. Per le condizioni sperimentali meno impegnative, il sistema di rigenerazione ATP è meno critica 27. Limitazioni della tecnica singola fibra permeabilizzate sono i seguenti. I dati generati da queste prove definiscono laproprietà contrattili dell&#39;unità miofibrillare specifico che è stato attaccato alla apparato sperimentale. Di conseguenza, questo cattura solo una piccola parte dell&#39;intera fibre multinucleate da cui è stato ottenuto il segmento che, a sua volta, rappresenta una piccola frazione del numero totale di fibre all&#39;interno del muscolo. Gli investigatori dovrebbero pertanto considerare attentamente il campionamento necessaria per supportare tutte le conclusioni tratte dagli esperimenti. Inoltre, la valutazione dell&#39;impatto di un intervento allenamento sulla funzione fibra presume che le fibre valutati sono stati effettivamente assunti durante l&#39;allenamento. Sebbene il protocollo cerca di imitare il naturale ambiente intracellulare della fibra, il processo permeabilizzazione sarcolemma è aspecifica e necessariamente permette costituenti intracellulari solubili a diffondersi liberamente nelle soluzioni balneari. Un&#39;ulteriore conseguenza della permeabilità della membrana è un cambiamento nell&#39;equilibrio osmotico evidenziato da un rigonfiamento in volume delle fibre 33. Ilfibra gonfiore aumenta la distanza tra actina e miosina conseguente ridotta sensibilità al calcio del sistema myofilament 34,35, ma può essere invertito con l&#39;introduzione di grandi composti osmoticamente attivi 34. Una limitazione finale da considerare è la conseguenza della tecnica utilizzata per collegare fibre all&#39;apparato sperimentale. Ciò richiede invariabilmente distorcere il rapporto spaziale all&#39;interno del sistema filamento in e in prossimità dei punti di attacco, con frequentando deficit funzionali. In particolare, le regioni della fibra alla e adiacente ai punti di aggancio sono funzionalmente compromesse e contribuendo così serie artefatta elasticità al sistema di misura. In sintesi, abbiamo descritto un mezzo per valutare la capacità di generare forza delle fibre muscolari scheletriche permeabilizzate chimicamente in vitro. Anche se il focus di questo articolo è stato sulla valutazione di massima forza isometrica generating capacità delle fibre muscolari scheletriche umane, l&#39;approccio sperimentale può essere modificato ed esteso per determinare una serie di parametri e relazioni cinetici in una vasta gamma di specie di mammiferi, o in altro modo.

La funzione primaria del muscolo scheletrico è di generare forza. Forza muscolare è suscitato in vivo attraverso una complessa sequenza di eventi che comprende i potenziali nervose motorie azione, la trasmissione neuromuscolare, potenziali d&#39;azione delle fibre muscolari, il rilascio di calcio intracellulare, e l&#39;attivazione del sistema di proteine ​​regolatrici e contrattili. Poiché la generazione di forza è il risultato finale di questa sequenza, un deficit in forza potrebbe essere causato da guasto di una o più delle singole fasi. Una caratteristica fondamentale della preparazione di fibre permeabilizzate è che elimina la maggior parte dei passaggi necessari per la generazione di forza in vivo, con solo le funzioni di regolamentazione e contrattili associati con l&#39;apparato miofibrillare residuo. L&#39;investigatore si assume il controllo della consegna di attivare calcio e di energia (ATP), e viene ricompensato con un sistema semplificato che consente la valutazione dei isolate strutture normative e contrattili nella loro co nativonfiguration. Le misurazioni della forza utilizzando fibre muscolari scheletriche permeabilizzate sono quindi preziosi nel valutare alterazioni della funzione muscolare osservata in vivo. Per esempio, abbiamo usato questa tecnica per caratterizzare la capacità di forza generatrice di fibre da miostatina topi deficienti 1 e per valutare la causa della debolezza muscolare persistente esposto seguente rotatori cronica della cuffia lacrime 2,3. Metodologia fibra permeabilizzate moderna può essere fatta per primi studi autorevoli 4,5 ed è attualmente in uso da parte di un certo numero di gruppi di ricerca. Sebbene le tecniche sono state descritte in letteratura, che non sono ancora stati presentati in formato video. L&#39;obiettivo di questo articolo è quello di illustrare una versione aggiornata, tecnica valida e affidabile per misurare la capacità massima forza generatrice di singole fibre da campioni muscolari scheletriche permeabilizzate chimicamente. Per realizzare ciò, un segmento singola fibra (qui indicata come ̶0; fibre &quot;) viene estratto da un fascio pre-permeabilizzate di fibre e posto in una camera sperimentale contenente una soluzione rilassante, la caratteristica principale che è una concentrazione di calcio che è &lt;10 nM. La fibra viene quindi collegato ad una estremità ad una forza-trasduttore e all&#39;altra estremità ad un regolatore di lunghezza. Con la fibra presso una lunghezza ottimale sarcomere, viene trasferito a una soluzione attivante che ha una concentrazione di calcio sufficiente per provocare la massima forza di attivazione e quindi massima contrazione isometrica. Dati Force sono acquisiti, archiviati e analizzati utilizzando un personal computer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene culture test tube with cap</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-956-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL screw cap micocentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge cryobox</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>5055-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-757-11YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonsterile-suture 10-0 monofilament</td>
			<td>Ashaway Line Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer drives</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath circulator&#160;</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Aplha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Varied</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>802D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length-controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force-transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-proprionate</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imadizole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 58</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2ATP&#8226;0.56H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTA (acid)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>35113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CrP&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Sano, permeabilizzate chimicamente singole fibre dovrebbero apparire uniformi in forma e avere una spaziatura striatura coerente se visto sotto alto ingrandimento. Fibre che sono inflessibile quando manipolato con le pinze o hanno evidenti danni strutturali devono essere eliminate. Alto ingrandimento immagini digitali scattate durante la fase 15 vengono analizzati per 5 misure di diametro accoppiati lungo la parte centrale della fibra. Fibra CSA calcola assumendo una sezione trasversale ellittica e una media di 5 misurazioni individuali CSA come illustrato nella Figura 7A. Figura 7B serve anche a illustrare come dimensioni fibra in una vista può essere significativamente diverso rispetto a dimensioni associato nel altra vista (cioè, incrociata sezioni non sono, in generale, rotondo). Rappresentativi forza tracce di fibre lente e veloci umani sono illustrati nelle figure 8A e 8B, rispettivamente. Voltage uscita della forza-trasduttore è acquisito durante un test e convertito forzare (mN) utilizzando software di acquisizione e analisi (LabVIEW). Figura 9 illustra l&#39;approccio utilizzato per valutare la forza attiva massima (F o), che è calcolato sottraendo la forza richiesta per mantenere la fibra alla lunghezza ottimale sarcomere mentre in uno stato rilassato (forza passiva, F P), dalla massima forza isometrica sviluppato durante l&#39;attivazione della fibra massimale (forza totale, F T). Poiché l&#39;uscita del trasduttore di forza che corrisponde alla forza zero è, in generale, diverso per ciascuna delle diverse stanze da bagno, brevemente allentare la fibra sia nel pre-attivazione e attivare soluzioni di catturare il livello zero forza nel disco sperimentale. Normalizzazione della massima forza attiva da fibra CSA viene utilizzato per generare il valore più informativo di forza specifica (SF o). Poiché prende in considerazione la CSA della fibra, SF o </sub&gt; fornisce una misura della capacità intrinseca forza generatrice dell&#39;apparato contrattile della fibra, consentendo così confronti funzionali tra fibre di dimensioni diverse. Va tuttavia osservato che le misurazioni CSA non sono in grado di distinguere la proporzione della fibra occupata da filamenti contrattili contro la proporzione occupata da altre strutture subcellulari. Caratteristiche tipiche di sano, fibre adulti di Claflin et al. 2011 10 per l&#39;uomo, Mendias et al. 2011 1 per mouse e Gumucio et al. 2012 2 per ratto sono dettagliati in tabella 3. Tutti i dati riportati nella tabella 3 sono stati generati utilizzando il tecniche descritte in questo articolo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> Umano (Vasto laterale) </strong&gt; </td><td> Topo (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> Ratto (Sottospinato) </td></tr><tr><td colspan="2"> Maschio </td><td colspan="2"> Femminile </td><td> Maschio </td><td> Maschio </td></tr><tr><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> Tipo 1 </td><td> Tipo 2a </td><td> (Non digitato) </td><td> (Non digitato) </td></tr><tr><td> CSA (micron 2) </td><td> 4880 - 6900 </td><td> 5270 - 8380 </td><td> 3870 - 5470 </td><td> 4010 - 5610 </td><td> 1850 - 3080 </td><td> 5290 - 8010 </td></tr><tr><td> F o (Mn) </td><td> 0,79-1,17 </td><td> 1,02-1,54 </td><td> 0,64-0,97 </td><td> 0,71-1,07 </td><td> 0,14-0,25 </td><td> 0,55-0,97 </td></tr><tr><td> sF o (kPa) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> n </td><td> 129 </td><td> 160 </td><td> 149 </td><td> 207 </td><td> 37 </td><td> 94 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Caratteristiche tipiche di fibre, adulti sani dal vasto umano lateralis 10, mouse estensore lungo delle dita 1 e ratto infraspinato 2 muscoli. Lunghezze sarcomero ottimali sono stati fissati a 2,7 micron per le fibre umane 7,8 e 2,5 micron sia per mouse (36, 37) e le fibre di ratto (38). Gamme Sperimentale L F (25 ° e 75 th quartili) erano 1,39-1,73 mm, 1,17-1,53 mm e 1,32-1,59 mm rispettivamente per uomo, topo e ratto. Intervalli mostrati indicano il 25 e 75 th quartili e n è il numero di fibre testate. I problemi più comuni emersi durante i test includono una scivolata cappio di sutura, che si traduce in una forza response con un &quot;catturare&quot; come quello illustrato in Figura 10A, e uno spessore rottura parziale o totale della fibra, che si traduce in una risposta forza che restituisce bruscamente verso o per (break) zero, mentre la fibra è ancora immersa in soluzione attivazione (Figura 10B). Se un lapsus, strappo o rottura si verifica nel corso di un esperimento, la fibra deve essere eliminata e esclusi i dati, pur mantenendo un record di fallimenti in fibra può anche essere informativo 11. Un altro risultato negativo che possono verificarsi è l&#39;attivazione prematura della fibra mentre nel pre-attivazione della soluzione (Figura 10C). Attivazione parziale nella soluzione pre-attivante suggerisce un notevole contaminazione incrociata bene (cioè, un aumento non intenzionale della concentrazione di calcio nel pre-attivazione ben). In questo caso, tutte le vasche devono essere aspirati e risciacquati con acqua deionizzata. Asciugatura le superfici divisorie tra le camere è anche raccoded come umidità o condensa in queste aree può portare a traspirazione di soluzione tra bagni. La decisione di includere o escludere i dati dipende in ultima analisi l&#39;attenzione sperimentale e devono pertanto essere considerati quando si progetta lo studio. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> Figura 1: ciclo di sutura (10-0 monofilamento di nylon di sutura). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> Figura 2:. Dissezione Bundle forcipe sono in mano sinistra, le forbici di microdissezione sono nella mano destra. Linea rossa indica l&#39;orientamento favorevole del polso e forbici con gli assi longitudinali delle fibre. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> Figura 3: </strong&gt; (A) Apparecchio di prova con i componenti etichettati. (A) camere sperimentali con fondo trasparente. (B) Lunghezza-controller. (C) Forza-trasduttore. (D) sorgente luminosa. (E) di lunghezza controllore xyz auto micrometrica con display digitale. (F) unità Fase micrometrica con display digitale. (G) Forza trasduttore auto xyz micrometro. (H) Piattaforma per lo schermo l&#39;obiettivo di laser-diffrazione calibrato. Tavolo isolamento (i) Vibrazione. (B) Close-up vista delle camere sperimentali. Di superficie (j) allegato in acciaio inox che si estende dal controller lunghezza. Di superficie (k) allegato in acciaio inox che si estende dalla forza-trasduttore. (L) Side-view prisma. (M) alloggiamento per moduli di raffreddamento termoelettrici. (N) termocoppia per la segnalazione di te da cameramperature. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> Figura 4: Modificato 100 microlitri punta pipetta utilizzato per trasferire la fibra da piatto dissezione a camera sperimentale. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> Figura 5:. Montaggio singola fibra su dispositivi sperimentali (A) loop di sutura preparati infilate su superfici di fissaggio in acciaio inox. (B) fibra trasferito alla camera sperimentale. (C) Fiber ancorata alle superfici di fissaggio di acciaio inossidabile dalla prima coppia di anelli di sutura con eccesso suture rimosso. (D) Seconda coppia di anelli di sutura filettati sulla sommità di loop prima sutura e legato in posizione. <img alt="Figura 6"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6: lunghezza sarcomero è valutata dalla proiezione di un modello di interferenza laser su uno schermo di destinazione calibrato (a) sorgente laser.. (B) Mirror. (C) schermo di destinazione. Pattern di interferenza (d) Laser. <img alt="Figura 7A" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="Figura 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> Figura 7: (A) Determinazione della zona della fibra in sezione ed in lunghezza ottimale sarcomero (umana = 2,7 um). Assumendo una sezione trasversale ellittica, CSA è calcolato per ciascuna delle cinque posizioni lungo la parte mediana fibra e la media dei cinque misurazioni individuali è segnalato come fibra CSA. 2a rappresenta top diametro vista ed è<html> un asse dell&#39;ellisse, 2b rappresenta vista laterale diametro ed è l&#39;altro asse dell&#39;ellisse. (B) immagini fibra Rappresentante illustrano ciascuna delle cinque misurazioni del diametro corrispondente, sia nella vista dall&#39;alto e laterale. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> Figura 8: Rappresentante forza tracce di sano vasto umano lateralis fibre muscolari (A) Tipo 1 fibre (CSA: 5710 micron 2, F o: 0.89 milioni di euro e sF o: 156 kPa).. (B) Tipo fibra 2a (CSA: 9510 micron 2, F o: 1.66 mN e SF o: 174 kPa). Fibra miosina a catena pesante è stato determinato attraverso l&#39;utilizzo di separazione elettroforetico e argento-colorazione tecniche 22. OAD / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9: Calcolo della forza attiva massima (F o) (a), vista espansa della risposta forza fibra durante il-gioco che induce il movimento di lunghezza controller avviato in soluzione pre-attivazione.. F P è la forza richiesta per mantenere una lunghezza sarcomero di 2,7 micron con la fibra a riposo. (B) Vista estesa di lunghezza-controller di movimento-gioco che inducono. Si noti che F o F = T - F P. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> Figura 10: slittamento (A) cappio di sutura, evidenziato da un &quot;fermo&quot; in vigore traccia durante l&#39;aumento di forza. Controllare per essere sicuri i cicli siano sicuri prima di attivare la fibra. (B) rottura della fibra durante l&#39;attivazione. Può essere dovuta a integrità fibra poveri o trattamento fibra aggressivo durante sutura posto ciclomento. (C) l&#39;attivazione della fibra parziale prematura a causa della contaminazione di camera di pre-attivazione con Ca 2+.

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Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analisi delle proprietà contrattili delle fibre muscolari chimicamente dalla pelle, o permeabilizzate, scheletriche offre un potente strumento con cui valutare la funzione muscolare a livello della cellula muscolare singolo. In questo articolo descriviamo una tecnica valida e affidabile per preparare e testare permeabilizzate fibre muscolari scheletriche in vitro.

Misurazione della massima isometrica forza generata dal permeabilizzate scheletrici fibre muscolari

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K Views.  University of Michigan Medical School.  Analisi delle proprietà contrattili delle fibre muscolari chimicamente dalla pelle, o permeabilizzate, scheletriche offre un potente strumento con cui valutare la funzione muscolare a livello della cellula muscolare singolo. In questo articolo descriviamo una tecnica valida e affidabile per preparare e testare permeabilizzate fibre muscolari scheletriche in vitro. 