La recherche soutenue par la science naturelles et en génie du Canada.

1. Introduction <ol><li> Le laboratoire MacIntosh a utilisé la préparation de muscle gastrocnémien médial pendant plusieurs années, et avant cela, la préparation de muscle gastrocnémien ensemble, tel que développé avec le Dr Phil Gardiner 1. </li></ol> 2. Anesthésie <ol><li> Adultes Sprague-Dawley (200-300 g) sont généralement utilisés dans notre laboratoire pour l&#39;étude des propriétés contractiles in situ. Le rat peut être contraint dans un dispositif en plexiglas, disponible dans le commerce, ou en couvrant avec une serviette, et la tenue. </li><li> Nous utilisons la kétamine / xylazine, (100 mg · ml -1, chaque) mélangé à 85:15, et administrer 0,1 ml par 100 g de poids chez le rat par voie intramusculaire 2,3. Le pentobarbital sodique (50-60 mg · kg -1, intraperiteneal) ou à l&#39;isoflurane (2-3,5%, par inhalation) peut également être utilisé 4. </li><li> Alors que l&#39;anesthésie prend effet, un poids précis peut être obtenu et la gauche des membres postérieurs rasé. C&#39;est aussi une bonne time pour être sûr toute l&#39;électronique est sous tension et prêt. Cela comprend les ordinateurs, amplificateur de jauge de contrainte, chauffe l&#39;huile et d&#39;autres. </li><li> Vérifiez le retour de la réponse réflexe périodiquement et compléter l&#39;anesthésie si nécessaire (0,05 à 0,1 ml par 100 g). </li></ol> 3. Lancement de la chirurgie <ol><li> Nous utilisons une plate-forme sur laquelle plexiglas pour immobiliser le rat pour la chirurgie. Ruban de masquage simple fait le travail. Assurez-vous que l&#39;animal est étirée à partir de patte arrière gauche au membre antérieur droit. Ajouter une goutte de lubrifiant pour les yeux. Nous utilisons l&#39;huile de paraffine. Sinon, les yeux se dessèchent avec anesthésie à la kétamine. </li><li> Une petite lumière chirurgicale est utile. Celui-ci émet suffisamment de chaleur pour aider à garder l&#39;animal au chaud. Alternativement, une couverture chauffante eau peut être utilisée. Assurez-vous que les réflexes cornéens ou d&#39;un orteil-pincement sont absents avant de poursuivre. Technique stérile n&#39;est pas nécessaire, parce que cette procédure est aiguë. L&#39;animal ne peut reprendre de l&#39;anesthésie. Nous euthanasier le rat avec un anesthésiquesurdosage (0,2 ml, intracardiaque) lorsque toutes les procédures sont terminées. </li><li> La première incision à travers la peau du talon à la colonne vertébrale. Nous utilisons des ciseaux, car la profondeur de la coupe peut être contrôlée et les ciseaux sont utilisés pour séparer la peau des tissus sous-jacents. Les rats ont hémostase excellente, tant et aussi longtemps que vous évitez les gros vaisseaux sanguins, de saignements sera limité. Gardez les surfaces exposées recouvertes d&#39;une solution saline isotonique gaze imprégnée, chaque fois que possible. </li><li> Après que la peau est séparée du tissu conjonctif sous-jacent, la couche superficielle du muscle est coupé. Soyez sûr de ne pas aller trop profond, vous ne voulez pas endommager le nerf sciatique ou des vaisseaux sanguins, ou le muscle concerné. Commencez sur le muscle gastrocnémien et couper proximale, le long de la même ligne que l&#39;incision cutanée. Peek-dessous pour localiser et éviter le nerf sciatique. Une fois que vous voyez le nerf, vous pouvez suivre son chemin avec votre incision, mais restent bien au-dessus du nerf. Il ya une couture nette entre muscles. Localiser ce, et couper le long de cette couture vers le genou. Surveiller et éviter les vaisseaux sanguins. </li></ol> 4. Préparer trou dans le fémur pour la broche osseuse <ol><li> Couper à travers la couche mince de muscle au cours de la partie caudale du fémur, ce qui expose l&#39;os à nu. L&#39;utilisation d&#39;un outil à main rotatif, forage, ou vice broches, (0,9 mm en acier au carbone fraise), faire un petit trou pilote dans le cortex, et juste dans la moelle. Ne pas percer trop profondément, ou des saignements excessifs en résultera. Ce trou sera utilisé plus tard pour placer une pointe en os à immobiliser le fémur sur la base myographe. </li></ol> 5. Isoler innervation du muscle gastrocnémien médial <ol><li> L&#39;étape suivante nécessite un microscope à dissection. Repérez l&#39;endroit où le nerf poplité disparaît derrière le muscle gastrocnémien médial. Écartez doucement les différentes branches et couper tout ce qui ne innervent le muscle gastrocnémien médial. Innervation peut être déterminée par microstimulation. Au thistade de s, aussi assurez-vous que les branches superficielles du nerf sciatique sont coupés. </li><li> Maintenant, effacer le tissu conjonctif loin du nerf sciatique, de sorte qu&#39;il peut être glissé dans le bracelet nerveux (plus tard). Assurez-vous de traiter le nerf doucement. Toute portion du nerf peut conduire à inexcitabilité, et terminez votre expérience prématurément. </li></ol> 6. Isoler le tendon d&#39;Achille et le muscle jumeau <ol><li> Dissection, avec l&#39;aide occasionnelle de ciseaux, peuvent être utilisés pour séparer le muscle gastrocnémien d&#39;autres tissus. Le tendon du plantaire peut être sorti de sous le tendon d&#39;Achille, attaché et coupé. Le lien est simplement utilisé pour aider à maintenir le tendon et peut être coupé juste après le tendon est coupé et le plantaire est séparé du muscle gastrocnémien pendant une durée substantielle. Placez une ligature de soie n ° 1 autour du tendon d&#39;Achille, et une cravate dans un noeud carré. Ne tirez pas trop fort, ou le tendon d&#39;être endommagé. Nous utilisons rongeurs d&#39;os à couper le Calcan<html> eus, en laissant un petit morceau d&#39;os encore attaché au tendon d&#39;Achille. Gardez les surfaces de coupe horizontaux pour s&#39;assurer que l&#39;os est coupé, et pas seulement le tendon. Cela garantit que le tendon d&#39;Achille peut être apposée sur le myographe plus tard. </li><li> Le long de la face inférieure du gastrocnémien, soléaire peut être vu. Encore une fois, la dissection mousse peut être utilisé pour séparer le muscle soléaire du muscle gastrocnémien. Nous voulons isoler les gastrocnémien médial, il est donc le seul muscle encore attaché au tendon d&#39;Achille. Couper le tendon soléaire, à proximité de l&#39;extrémité distale. Ensuite, vous pouvez séparer les muscles gastrocnémiens médial et latéral, et couper le tendon latéral, laissant juste le muscle gastrocnémien médial attaché au tendon d&#39;Achille. Tirer le muscle gastrocnémien latéral loin de la médiane, le long de près de 50% de sa longueur. Au-delà de cette longueur, les fibres se croisent et se traduira par des dommages de plus de traction. Assurez-vous que le muscle est exempt de tissu conjonctif. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Couper le tibia <ol><li> Placez une ligature autour de la tige, juste au-dessus du point médian. Cela doit être serré, sans couper dans le tissu. Une seconde boucle avant la vente liée contribue éviter de glisser. Encore une fois utiliser un noeud carré pour le fixer. </li><li> En utilisant une petite scie, couper le bas de la jambe loin. Cette coupe doit être à mi-chemin le long du tibia. </li><li> Insérez une sonde pointue dans la moelle du tibia. Cette sonde sera utilisé pour immobiliser le tibia sur la base myographe. </li><li> Fixez les 2 élastiques de la peau, à l&#39;aide des clips Michel. Ces élastiques et supplémentaires seront utilisés pour maintenir la peau autour du muscle pour former un récipient qui sera rempli avec de l&#39;huile de paraffine chaude. </li></ol> [FACULTATIF] 8. Insérez cristaux sonométriques (étape optionnelle) 5 <ol><li> Placez l&#39;animal sur un coussin chauffant à basse température. Une sonde rectale, s&#39;il n&#39;est pas déjà insérée peut être introduite à ce stade. Utilisez une petite goutte d&#39;huile de paraffine pour lubrifier. </li><li>Utilisant microstimulation, identifier les extrémités d&#39;un fascicule dans le muscle. Enfoncer une aiguille de calibre 21 dans le site de l&#39;origine et à l&#39;insertion du muscle. </li><li> Faites glisser un cristal sonométriques dans le trou fait par l&#39;aiguille et joint avec vet-joint de colle chirurgicale. Utilisez une très petite goutte de colle; faire en sorte qu&#39;il soit placé juste au-dessus du cristal. L&#39;application de la colle sur une feuille de papier coupé avec un angle aigu contribue à l&#39;application de la colle avec précision. Nous plaçons un cristal supplémentaire à l&#39;insertion du fascicule qui a été identifié par microstimulation. </li></ol> [CONTINUER] 9. Montez dans l&#39;appareil (voir figure 1) <ol><li> Positionner le rat sur la base myographe, avec la sonde tibial orientée vers le levier. Placer la sonde dans le support, pour immobiliser la jambe. </li><li> Tirez la peau vers le haut sur les côtés, pour former un récipient et le fixer avec des élastiques. </li><li> Définir trépan (pouces 1/16 ème) dans le fémur, en utilisant le pilotetrou qui a été créé lors de la préparation chirurgicale. Assurez-vous que vous soutenez le fémur sur la partie antérieure que vous placez la mèche (dans un étau broches), une rupture du fémur peut entraîner, mettre fin à l&#39;expérience prématurément. Fixez le vice-broches à une barre transversale pour immobiliser le fémur. </li><li> Placer le moignon distal du nerf sciatique par le bracelet nerveux stimulant (cathode vers le muscle) et rentrer de nouveau près de l&#39;origine du muscle. Branchez le stimulateur à ces fils. </li><li> Attacher le tendon d&#39;Achille au levier, qui comporte des capteurs à jauges de contrainte sur celui-ci. Attachez câlins, mais laissez un peu de place pour l&#39;ajustement ultérieur. S&#39;assurer que l&#39;alignement du muscle est perpendiculaire au levier. </li><li> Remplir le récipient formé par la peau avec de l&#39;huile de paraffine chauffée. </li><li> Allumez la lampe de la chaleur et de boucliers de position faites de papier d&#39;aluminium sur la tête de l&#39;animal, et le capteur de force. Boucliers feuilles supplémentaires peuvent être nécessaires pour assurer la température centrale de l&#39;animal ne Exceed 38 ° C. La longueur du muscle peut être ajusté jusqu&#39;à ce que mou de la chaîne est retirée de la connexion entre les gastrocnémien médial et le capteur de force. </li></ol> 10. Régler la tension maximale et la longueur de référence <ol><li> Alors que le muscle se réchauffe, mis en place le stimulateur et tester la tension de stimulation. Il est important de s&#39;assurer que la stimulation est fixé à durée d&#39;impulsion très brève. Nous utilisons 50 ms. Tension maximale doit être inférieure à 1 V. À partir de 0,5 V, augmenter la tension jusqu&#39;à ce que l&#39;amplitude contraction n&#39;augmente pas. Tension maximale est la plus faible tension qui active toutes les unités motrices. Nous stimulent généralement au double de la tension maximale, ou 3 V le plus élevé. </li><li> En règle générale, les expériences commencent par le muscle à la longueur qui donne la plus forte contraction contraction. Une contraction est obtenue avec une seule impulsion de stimulation. La longueur du muscle est augmentée d&#39;environ 1 mm pour une autre secousse. Cette opération est répétée aussi longtemps que l&#39;amplitude contractionaugmente. Une fois contraction diminue l&#39;amplitude, la durée sera retourné à celui qui a donné la contraction plus grande amplitude. </li><li> Après ce réglage initial de longueur, nous testons le système avec ce que nous appelons une &quot;contraction tétanique conditionné&quot;. Le stimulateur est réglé pour délivrer des impulsions à 200 Hz pendant 500 ms. La livraison de cette stimulation se traduira par une contraction tétanique complètement fondu. La force générée par le muscle va resserrer toutes les connexions, y compris les noeuds sur le muscle. Après un repos convenable pour la dissipation de la potentialisation 4, la longueur de référence du muscle est remis à zéro (voir la partie 9.2). Habituellement, la contraction tétanique conditionné aura permis à certains raccourcissement de la longueur fascicule, le muscle devra être étirée un peu pour revenir à la longueur qui donne la contraction plus forte amplitude contraction. </li></ol> 11. Initier l&#39;expérience <ol><li> Une expérience typique comprendra ajustem longueurent et / ou une stimulation avec une variété de modes de stimulation. La collecte des données peut simplement signifier la force ou la force, la longueur, la longueur fascicule et un électromyogramme. </li></ol> [FACULTATIF] 12. Force-fréquence relation 2 <ol><li> Réglez la durée du train assez long pour atteindre un plateau de force à n&#39;importe quelle fréquence d&#39;intérêt. La force maximale isométrique est atteint dans le muscle gastrocnémien médial à 200 Hz. Durée du train doit être d&#39;au moins 200 ms; est plus préférable pour les basses fréquences, mais se traduira par une certaine fatigue si quelques contractions sont utilisés pour déterminer la gamme complète de la relation force-fréquence. Nous utilisons généralement des contractions à 0, 20, 40, 60, 80, 100 et 200 Hz. Cette gamme de fréquences va permettre à l&#39;ensemble de la relation force-fréquence à décrire. Un appui approprié entre les contractions doivent être permis d&#39;éviter la fatigue (1-10 min). </li></ol> 13. Force-longueur RELATIONSIP 6 <ol><li> Avec la longueur optimale estimée précédemment établi, une relation force-longueur peut être déterminée par réglage de la longueur systématiquement du muscle de -4 à 4 mm mm en utilisant un appareil de servo-moteur. Cela devrait être fait en utilisant une stimulation maximale (200 Hz), mais nous avons constaté que les contractions très brèves donnera la même longueur réelle optimal 7. Contractions sous-maximales, comme des secousses, peuvent être utilisés, mais cela donnera une longueur différente-dépendance entre la force 8. </li><li> Un aspect important de la détermination de la relation force-longueur est la nécessité d&#39;estimer la force passive à la longueur fascicule au cours de laquelle se produit la force mesurée. Force active est calculée comme la différence entre la force totale et la force appropriée passive. Étant donné que les structures élastiques parallèles supporter la force passive et ceux-ci sont en série avec les structures élastiques de la série, la contribution de la force de la force totale passif doit diminuer à mesure que la série elastructures STIC sont étirés au cours d&#39;une contraction de 3. Une fois que la force passive est connue pour toutes les longueurs musculaires concernés, la force appropriée passif peut être estimée avec la mesure en continu de la longueur à l&#39;aide fascicule sonomicrométrie, ou en estimant la conformité du système de mesure et les structures dans la série de l&#39;unité muscle-tendon. Si cela n&#39;est pas fait, la longueur optimale des forces de préparation et de pointe, sont sous-estimés. </li></ol> 14. Relation force-vitesse 9 <ol><li> Si vous souhaitez déterminer la relation force-vitesse, vous aurez besoin d&#39;attacher les capteurs de force à un système qui permet de contrôler soit la charge ou la vitesse de changement de longueur. La méthode la plus simple et la plus rentable est d&#39;utiliser la pression d&#39;air pour limiter le raccourcissement à une charge contrôlée. Dans notre système, le muscle est fixé au levier d&#39;un côté du point d&#39;appui et la pression de l&#39;air empêche le changement de longueur de l&#39;autre côté. Un capteur de longueur needs être employé afin que vous soyez en mesure de détecter le changement de longueur du muscle pendant les contractions isotoniques. Cette disposition permet de contractions afterloaded avec résistance pneumatique. Deux réservoirs peut permettre une contraction isométrique avec une libération à une charge isotonique. Un total de contractions 15-20 devrait être obtenue, avec des charges allant de presque vide à la force isométrique maximale. Lors du montage des données à une équation, des charges supérieures à 90% des isométrique ne doit pas être utilisé 9. </li></ol> 15. Les résultats représentatifs: Contractions exemples sont présentés dans la figure 2. Ces contractions ont été obtenus pour illustrer la relation force-fréquence. Calcul de la force maximale active de ces contractions, et de tracer la force active de la fréquence, les rendements Figure 3, la relation force-fréquence. Les données présentées dans la figure 2 peut être monté à l&#39;équation: FA = c / (1 + e ((AF) / b) + d); AF est la force active, F est la fréquence et un,<html> b, c et d sont des constantes. Pour le muscle gastrocnémien médial rat, la fréquence moitié du maximum de stimulation est typiquement 50-60 Hz en non-fatigue musculaire 2. Les résultats seront épouser la ligne décrite par l&#39;équation ci-dessus. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig1.jpg" /> Figure 1 Appareils et musculaire set-up:. Pneumatique set-up est affiché sur la gauche, isométrique sur la droite. Le système de levier indiqué sur la gauche est attachée à la table de traduction lorsque les contractions dynamiques sont souhaitées (adapté de 13). Le moteur pas à pas est commandé par un ordinateur (d&#39;après 14). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3167/3167fig2.jpg" /> . Figure 2 superposés contractions isométriques: 20, 40, 60, 80 Hz, 100 et 200. L&#39;amplitude de la contraction de 200 Hz est 8.13 N. les/ftp_upload/3167/3167fig3.jpg &quot;/&gt; . Figure 3 Force fréquence relation: la force active des contractions de la figure 2 sont tracées et la ligne représente la ligne de meilleur ajustement.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Résultats de bonne qualité contractiles peuvent être obtenues avec soin dans la préparation chirurgicale, bonne fixation dans l&#39;appareil et de l&#39;électronique de bonne qualité. Quand un élève est d&#39;apprendre ce type de chirurgie, quelques boutures communs incluent: étirement du nerf sciatique, ce qui perturbe le flux sanguin et le saignement excessif. Le nerf doit être manipulé avec soin pour éviter tout dommage. Vous saurez que vous avez endommagé le nerf si la force maximale tétanique à la longueur optimale est sensiblement inférieure à celle indiquée dans la figure 3, ou si la tension de stimulation nécessaire pour activer toutes les unités au maximum du moteur est supérieure à 5 volts. Il est relativement facile d&#39;éviter les vaisseaux sanguins qui servent de ce muscle pendant la chirurgie. Perturbation de ces navires peuvent se produire lorsque l&#39;outil de forage est placé dans la surface caudale du fémur. Si le trou n&#39;est pas sur la surface plate du fémur, le forage peut glisser. Lorsque cela se produit, il ya une possibilité que les vaisseaux poplités se perturbé. Sile sang s&#39;accumule dans le muscle après mise en place, c&#39;est un signe que vous avez perturbé ces navires. Saignement excessif peut également se produire si une grosse veine est coupée et non liées. Grosses veines à surveiller sont celles autour de la cheville. Le muscle en préparation in situ est une approche intéressante pour l&#39;étude des propriétés musculaires contractiles. Unités motrices individuelles peuvent être activées 10, mais en général, toutes les unités motrices sont activées de façon synchrone. Ceci est un inconvénient par rapport à l&#39;activation asynchrone normal qui se produit par le recrutement d&#39;unité motrice volontaire, constitue une limitation. Cependant, du côté positif, l&#39;activation synchrone permet la quantification d&#39;une réponse moyenne de toutes les unités motrices. Il existe deux approches qui ont été utilisées pour éviter l&#39;activation synchrone. La première consiste à utiliser un brassard électrode avec plusieurs paires de fils stimulantes. Ce qui permet l&#39;activation d&#39;une partie des unités motrices à chaque paire,et la stimulation peut tourner par l&#39;intermédiaire des paires de réaliser l&#39;activation asynchrone. Cette méthode d&#39;activation peut être combiné avec le bloc anodique 11 pour tenter d&#39;activer les unités motrices dans la séquence appropriée en fonction de la taille 12 principe. Dans cette approche, tous les blocs moteurs sont activés avec une paire d&#39;électrodes proximale, et un bloc de stimulation est imposée avec un courant continu. L&#39;amplitude de stimulation pour le bloc peut être modulée pour inhiber unités motrices pour l&#39;activation qui n&#39;est pas souhaité. Apparemment, le bloc affecte axones grands à la tension la plus basse, et affecte plus en plus petites unités. Le rat dans la préparation du muscle gastrocnémien situ est une approche précieuse physiologique à l&#39;étude de la contraction des muscles squelettiques et les propriétés biochimiques de la santé et dans la maladie.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de l&#39;équipement </th><th> Entreprise </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Clippers </td><td></td><td></td><td> Bonne coupe pour animaux de compagnie de qualité </td></tr><tr><td> Lampe chirurgicale </td><td> Dyna-Lume </td><td></td><td> Tout de plusieurs fera </td></tr><tr><td> Myographe </td><td></td><td></td><td> Construite sur mesure </td></tr><tr><td> Stimulateur </td><td> Herbe </td><td> S-88 </td><td> Tout de plusieurs fera </td></tr><tr><td> Filtrer amplificateur de jauge </td><td> CWE </td><td> PM-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Téléthermomètre </td><td> YSI </td><td> YSI-400 </td><td></td></tr><tr><td> Plate-forme robotique </td><td> Arrick Robotique </td><td> MD-2 </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur sonométriques </td><td> Sonometrics </td><td> Sonolab </td><td></td></tr><tr><td> Informatique et la collecte de données </td><td> PC avec NI boae </td><td></td><td> Personnalisée du logiciel (Labview) </td></tr><tr><td> Chauffe-bloc </td><td> Lab-line </td><td> Multibloc </td><td></td></tr><tr><td> Gaine de nerf </td><td></td><td></td><td> Sur mesure </td></tr><tr><td> Microstimulateur </td><td></td><td></td><td> Sur mesure </td></tr></tbody></table>

procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties

Il existe de nombreux cas où il est souhaitable d&#39;obtenir la réponse contractile du muscle squelettique dans des circonstances physiologiques: circulation normale, intacte muscle entier, à la température corporelle. Cela comprend l&#39;étude des réponses contractiles comme potentialisation, escalier posttetanic et la fatigue. En outre, les conséquences du traitement des maladies, la désuétude, de blessure, de la formation et de drogues peut être d&#39;intérêt. Cette vidéo montre des procédures appropriées pour mettre en place et utiliser cette préparation musculaire précieux. Pour mettre en place cette préparation, l&#39;animal doit être anesthésié, et le muscle gastrocnémien médial est chirurgicalement isolé, à l&#39;origine intact. Des précautions doivent être prises pour maintenir le sang et les fournitures nerveuses. Une longue section du nerf sciatique est effacée du tissu conjonctif, et rompu proximale. Toutes les branches de la souche distale qui ne innervent le muscle gastrocnémien médial sont coupés. Le moignon du nerf distal est insertionted dans une coiffe bordée de fils en acier inoxydable stimulantes. Le calcanéum est coupé, laissant un petit morceau d&#39;os encore attaché au tendon d&#39;Achille. Sonométriques cristaux et / ou des électrodes pour EMG peut être inséré. Immobilisation par des sondes en métal sur le fémur et du tibia empêche le déplacement de l&#39;origine du muscle. Le tendon d&#39;Achille est fixé au transducteur de force et de la peau desserrée est tiré vers le haut sur les côtés pour former un récipient qui est rempli avec de l&#39;huile de paraffine chauffée. L&#39;huile répartit uniformément la chaleur et minimise la perte de chaleur par évaporation. Une lampe chauffante est dirigé sur le muscle et le muscle et le rat sont autorisés à se réchauffer à 37 ° C. Bien qu&#39;il se réchauffe, la tension maximale et la longueur optimale peut être déterminée. Ce sont d&#39;importantes conditions initiales pour toute expérience sur le muscle entier intact. L&#39;expérience peut inclure la détermination des standards propriétés contractiles, comme la relation force-fréquence, force-longueur relation et la relation force-vitesse. </p&gt; Avec des soins chirurgicaux dans l&#39;isolement, l&#39;immobilisation de l&#39;origine du muscle et de l&#39;alignement de l&#39;unité muscle-tendon avec le capteur de force, et une bonne analyse des données, les mesures de haute qualité peut être obtenue avec cette préparation musculaire.

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Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Cette vidéo montre la préparation chirurgicale et les procédures nécessaires pour étudier les réponses contractiles du muscle gastrocnémien de rat préparation médial<em&gt; In situ</em&gt;. Cette préparation permet de mesurer les propriétés contractiles du muscle squelettique dans des conditions physiologiques. L&#39;animal est anesthésié et le muscle est séparée du tissu environnant à son extrémité distale. Le tendon d&#39;Achille est attaché à un transducteur de force, qui permet la mesure de la réponse contractile du muscle à 37 degrés C avec une circulation intact.

Procédures pour Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriétés contractiles musculaires squelettiques

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

28.5K vues.  University of Calgary. Cette vidéo montre la préparation chirurgicale et les procédures nécessaires pour étudier les réponses contractiles du muscle gastrocnémien de rat préparation médial In situ. Cette préparation permet de mesurer les propriétés contractiles du muscle squelettique dans des conditions physiologiques. L'animal est anesthésié et le muscle est séparée du tissu environnant à son extrémité distale. Le tendon d'Achille est attaché à un tr...

Vidéo: Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

In vivo la micro-circulation de mesure dans le muscle squelettique par voie intra-vitale microscopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Recherche

Biologie

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adultes et embryonnaires Culture squelettique Microexplant musculaire et isolement de cellules souches du muscle squelettique

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolement mitochondriale du muscle squelettique

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligé des blessures de poisson zèbre muscle squelettique embryonnaire

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of serially linked sarcomeres, the smallest contractile units in muscle. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in patients with mutations in genes encoding for sarcomeric proteins. The study of myofibril mechanics allows for the assessment of actin-myosin interactions without potential confounding effects of damaged, adjacent myofibrils when measuring the contractility of single muscle fibers. Ultrastructural damage and misalignment of myofibrils might contribute to impaired contractility. If structural damage is present in the myofibrils, they likely break during the isolation procedure or during the experiment. Furthermore, studies in myofibrils provide the assessment of actin-myosin interactions in the presence of the geometrical constraints of the sarcomeres. For instance, measurements in myofibrils can elucidate whether myofibrillar dysfunction is the primary effect of a mutation in a sarcomeric protein. In addition, perfusion with calcium solutions or compounds is almost instant due to the small diameter of the myofibril. This makes myofibrils eminently suitable to measure the rates of activation and relaxation during force production. The protocol described in this paper employs an optical force probe based on the principle of a Fabry-P&#233;rot interferometer capable of measuring forces in the nano-Newton range, coupled to a piezo length motor and a fast-step perfusion system. This setup enables the study of myofibril mechanics with high resolution force measurements.

Presented here is a protocol to assess the contractile properties of striated muscle myofibrils with nano-Newton resolution. The protocol employs a setup with an interferometry-based, optical force probe. This setup generates data with a high signal-to-noise ratio and enables the assessment of the contractile kinetics of myofibrils.

Isoler les myofibrils des biopsies des muscles squelettiques et déterminer la fonction contractile avec un transducteur de force de résolution nano-newton

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Préparation d’homogénats de muscles squelettiques de rat pour les mesures de nitrates et de nitrites

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Quantification de l’infiltration graisseuse des muscles squelettiques par décellularisation

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

Pleins feux sur l’auteur : Quantification de l’infiltration graisseuse des muscles squelettiques basée sur la décellularisation  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.