Supported by grants from the Department of Defense (W81XWH-09-1-0127), the NIH (2-R01-CA089569), the Elsa U. Pardee Foundation, a Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research Pilot Study Award, and generous philanthropic support from Section of Urology and Section of Research in the Department of Surgery, University of Chicago.

Toutes les souris ont été logées, entretenues et euthanasiés selon institutionnel soins des animaux et l&#39;utilisation du Comité (IACUC) directives et sous la supervision de l&#39;Université de Chicago Center des ressources animales. 1. Préparation animaux pour des études expérimentales <ol><li> Permettre aux animaux d&#39;acclimater à de nouveaux logements et de l&#39;environnement, se remettre des effets physiologiques potentiels de transport et de manutention. Remarque: La technique suivante est applicable à toutes les souches de souris disponibles dans le commerce. Le nombre d&#39;animaux qui seront utilisés pour une expérience dépend de la conception de l&#39;étude et devrait être fait en consultation avec un statisticien. </li></ol> 2. Identification et isolement de péritonéale Fat dépôts. <ol><li> Euthanasier les animaux via CO 2 surdose et une méthode physique secondaire pour confirmer la mort. </li><li> Comme récolte dépôts de graisse péritonéale constitue le prélèvement d&#39;organes internes (méthode secondaire), MAke Une incision médiane proche de la papilles inguinale à travers la paroi péritonéale pour exposer les organes internes (figure 1A). </li><li> Pour la Omental Fat (OM), exposer le complexe omental / pancréas en étendant la rate de la cavité péritonéale avec une pince (figure 1C). Relâchez épiploon par le pancréas et la rate en coupant près toutes les connexions de tissus. Assurez-vous que tous les tissus du pancréas restant est excisé 4. </li><li> Pour la gonadique Fat (GF), utiliser une pince pour soulever la graisse gonadique entourant les ovaires et de l&#39;accise en coupant les connexions de tissus (Figure 1A supérieure righ t) 4. </li><li> Pour l&#39;utérus Fat (UF), utiliser une pince pour soulever la graisse de l&#39;utérus qui entoure les cornes utérines et de l&#39;accise en coupant les connexions de tissus (figure 1A en bas à droite) 4. </li><li> Pour la mésentérique Fat (MF), couper la jonction entre l&#39;intestin grêle et du pylore. Utilisez une pince à saisir fermement l&#39;extrémité libre dul&#39;intestin grêle, et lentement &quot;peau&quot; à l&#39;écart de la graisse mésentérique. Relâchez la graisse mésentérique de la racine mésentérique l&#39;aide de ciseaux de dissection (figure 1A en bas à gauche) 4. </li><li> Pour la Splenoportal Fat (SF), soulever l&#39;extrémité distale de la rate en utilisant une pince pour exposer la bande mince gras de tissu reliant le hile de la rate au pancréas. Exciser la graisse splenoportal faisant d&#39;abord la libération par le pancréas, et ensuite soigneusement disséquer de la rate (figure 1B) 4. </li></ol> 3. Lactée spot d&#39;identification utilisant Giemsa <ol><li> Omenta d&#39;accise (voir l&#39;étape 2.3) à partir de souris C57BL / 6 et fixer 5% du formol tamponné neutre à 4 ° C pendant 16 heures (O / N). </li><li> Pour inclusion en paraffine le tissu fixe, choisissez un moule qui est approprié pour la taille du tissu. Verser la paraffine en fusion à partir du réservoir de paraffine pour remplir le moule. Ouvrez la cassette et l&#39;utilisation chaud pourcèpes, transférer le tissu dans le moule. <ol><li> Orienter soigneusement les tissus pendant inclusion dans la paraffine pour produire des sections longitudinales. Placez la cassette de tissu marqué sur le moulage et appuyez fermement en place. Laisser le moule refroidir pendant au moins 30 min. </li></ol></li><li> Couper des sections en série (4 um d&#39;épaisseur) de la paraffine fixés au formol intégré (FFPE) bloc de tissu. Placez une diapositive préalablement nettoyé sous les sections que le ruban de tissu se détache du bloc de paraffine. </li><li> Série section l&#39;ensemble épiploon; recueillir et tacher chaque troisième section pour Giemsa (voir 3.6). Autoriser la lame de verre avec les sections à l&#39;air sec, de préférence O / N à température ambiante. Diapositives secs sont prêts pour la fixation. Colorer la première section pour hématoxyline et l&#39;éosine pour les comparaisons à des diapositives Giemsa colorées. </li><li> Déparaffiner les lames par deux incubations séquentielles 5 min en xylenes. Réhydrater diapositives par deux incubations séquentielles dans les domaines suivants: l&#39;éthanol 100%, 95% d&#39;éthanol, et enfin puiser water. <ol><li> Prendre les précautions adéquates pour éviter les diapositives de séchage. Effectuez toutes les étapes à la température ambiante. </li></ol></li><li> Immerger complètement les lames dans une jarre de Coplin contenant une solution de Giemsa à 5% (p / v préparé dans l&#39;eau du robinet) et incuber pendant 4 min à température ambiante. Rincer les lames à l&#39;eau du robinet pendant 60 secondes, l&#39;air sec et monter avec lamelle en utilisant les médias de montage. </li><li> Image les lames colorées en utilisant un scanner de diapositives entier et processus avec le logiciel du fabricant. Quantifier le volume de tache laiteuse dans les sections omentales colorés au Giemsa en utilisant le logiciel ImageJ 4. </li></ol> 4. Propagation et préparation des cellules de cancer ovarien pour in vivo et ex vivo études <ol><li> Pré-chaud 15 ml de milieu de croissance de cellules à 37 ° C dans un bain thermique. Préparer un flacon de culture tissulaire de taille appropriée (par exemple, 75 cm zone 2 de surface) par marquage avec le nom de la lignée cellulaire, numéro de passage, la date et la personne qui a préparé le stock congelé, et la dateet personne qui dégèle / étalement des cellules. Remarque: Dans les études de la métastase de telles informations détaillées est crucial, que la date du gel et que le numéro de passage peut affecter le phénotype métastatique. </li><li> Utilisation de l&#39;environnement stérile de la hotte de sécurité biologique, une pipette 10 ml de milieu dans le ballon de culture T-75. Retirer un flacon de cellules du système de l&#39;azote liquide et vérifiez l&#39;étiquette pour confirmer le type de cellule. Décongeler un seul flacon de cellules à un moment par le réchauffement de 37 ° C bain de chaleur. </li><li> En utilisant une technique stérile, une pipette à 1x10 6 cellules décongelé dans le flacon de culture. Placer la fiole dans l&#39;incubateur pour permettre aux cellules de se fixer. Agitez doucement le flacon avant et en arrière pour former une suspension de cellules uniforme. <ol><li> Placer dans fiole de culture de tissus incubateur et maintenir à 37 ° C dans 5% de CO2 environnement. Permettre aux cellules d&#39;adhérer O / N. </li></ol></li><li> Aspirer le milieu, et les remplacer par des milieux de croissance préchauffé frais. Placer la fiole dans l&#39;incubateur et toutOW cellules à croître. Surveiller la croissance des cellules quotidiennement par inspection visuelle tous les 2-3 jours en utilisant un microscope inversé. Utiliser des techniques de culture cellulaire standard aux cellules de passage lorsqu&#39;il atteint 70-80% de confluence. Remarque: Pour les essais expérimentaux récolter les cellules à 70% de confluence pour assurer que les cellules se multiplient activement. </li><li> Aspirer le milieu de culture et rincer avec 10 ml de solution saline tamponnée phosphate stérile (PBS). Aspirer le PBS et ajouter 0,25% trypsine / EDTA (2 à 3 ml d&#39;une 2 surface de 75 cm) et on incube 5 min à 37 ° C. Visuellement confirment que les cellules ont détaché et ajouter un volume égal de milieu de croissance, et la pipette en douceur les cellules de haut en bas pour obtenir une suspension de cellule unique. Remarque: Il est essentiel que le milieu de culture contient du sérum car il inactive la trypsine. Préparer au moins 2 à 4 fois plus de cellules que le nombre requis pour une expérience donnée pour compenser la perte des cellules au cours des étapes subséquentes </li><li> Déterminer le pourcentage de cellules viables dans lasuspension par l&#39;intermédiaire d&#39;un dosage d&#39;exclusion du bleu trypan en utilisant un hématimètre ou un compteur de cellules automatisé. Remarque: Ici, seulement utiliser des préparations cellulaires dans lesquelles ≥ 96% des cellules sont viables. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à partir de la fiole dans un tube conique de 50 ml. Pellet cellules par centrifugation 5 min à 1100 xg, à 4 o C. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS à une concentration de 2x10 6 cellules par ml. </li></ol> 5. injection intrapéritonéale de cellules Remarque: Dans nos expériences, les souris sont traitées dans un flux d&#39;air laminaire ou enceinte de sécurité biologique au sein de notre centre de barrière afin de limiter le risque d&#39;exposition aux agents pathogènes, Afin de démontrer cette technique clairement, les procédures de la vidéo qui l&#39;accompagne ont été effectuées dans un laboratoire agréé pour le travail des animaux. Cette technique particulière ne nécessite pas que les animaux sont sous anesthésie. Sous protocoles approuvés, effectuer cette technique sur les animaux vivants. Utiliser des souches appropriées de souris pour cette étude. Par exemple: utiliser la souris nude athymiques immunodéprimés, pour l&#39;étude des cellules de cancer ovarien humain (SKOV3ip.1 et HeyA8) la colonisation; utiliser immunocompétents souris C57BL / 6 pour l&#39;étude des souris des cellules de cancer de l&#39;ovaire (ID8) colonisation. <ol><li> Charge 500 pi de la suspension de cellule unique dans la seringue et mettre dans l&#39;aiguille de 25 G plafonné stérile. Cela réduit le cisaillement de la cellule avant l&#39;injection. </li><li> Choisissez la souris par la peau du cou et maintenez la queue avec la paume et l&#39;index et fixer la patte arrière gauche entre l&#39;annulaire et l&#39;auriculaire (lorsque la souris est retenu avec la main gauche). Remarque: Pour éviter les organes abdominaux traumatisantes, retenir la souris bien de sorte qu&#39;il ne peut pas bouger pendant l&#39;injection. </li><li> Imaginez une ligne à travers abdomen, juste au-dessus des genoux, et de localiser un point sur le côté droit de l&#39;animal et à proximité de la ligne médiane. Le point d&#39;entrée est crânien et légèrement médialdu dernier mamelon. Remarque: Insertion de l&#39;aiguille sur le côté droit de la souris permet d&#39;éviter le caecum et réduit le risque de perforer les intestins 11. </li><li> Insérer l&#39;aiguille dans la zone latérale inférieure de l&#39;abdomen de la souris à une profondeur d&#39;environ 0,5 cm. Tirer sur le piston afin de confirmer que l&#39;aiguille n&#39;a pas pénétré dans un vaisseau sanguin ou d&#39;autres organes péritonéaux. <ol><li> Si du liquide est aspiré jeter la seringue (et l&#39;échantillon) 11. Une aspiration brun verdâtre ou jaune indique pénétration de l&#39;aiguille dans les intestins ou la vessie, respectivement. </li></ol></li><li> Injecter l&#39;échantillon en utilisant pression lente et régulière. Retirer l&#39;aiguille et le retour de la souris dans sa cage. Ne pas résumer la seringue avant de les jeter dans un récipient pour objets tranchants. </li><li> Souris Sacrifice par asphyxie au CO2 et l&#39;enlèvement d&#39;organes vitaux à des moments spécifiques après l&#39;injection. </li></ol> 6. Lactée place colonisation in vivo <ol><li> Quantitàtion des cellules de cancer de la localisation des taches laiteuses en utilisant la cytométrie en flux <ol><li> Isoler dépôts de graisse péritonéale de souris (comme décrit dans l&#39;étape 2.3 au 2.7) injecté avec fluorescence taggés cellules cancéreuses et place des tissus immédiats dans PBS glacé. <ol><li> Pour cette technique particulière, le poids-match de tous les tissus adipeux graisse pour épiploon. Tissus de transfert pour séparer les tubes de 5 ml contenant 1,5 ml de DMEM exempt de sérum et 0,1% (p / v) de sérum-albumine bovine. Tissus Piscine récoltées à partir de trois souris indépendants pour assurer un rendement suffisant de cellules pour la cytométrie de flux. </li></ol></li><li> Mince de tissus à l&#39;aide de ciseaux chirurgicaux et ajouter 1,5 ml de DMEM sans sérum contenant 0,4% (p / v) de la collagénase I. Incuber la suspension tissulaire à 37 ° C pendant 30 min sous agitation rotative. <ol><li> Comme une étape facultative, dissocier davantage les tissus par la mastication. Dans ce cas, le transfert de la suspension tissulaire collagénase à un sac de microstomacher, mastiquer pendant 10 min à feu, tourner l&#39;orientationdes sacs après 5 min. </li></ol></li><li> Filtrer les échantillons à travers un filtre de nylon mesh (60 um des pores) pour enlever les gros débris. Recueillir les cellules par centrifugation à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter la fraction de surnageant. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 pi de PBS combinées avec 900 pi de tampon de lyse ACK et incuber à température ambiante pendant 1 min. Centrifuger les cellules à 250 g pendant 5 min et éliminer le surnageant. <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 250 pi de PBS glacé. Filtrer les échantillons à travers un tamis de 60 um pores de nylon pour assurer suspension cellulaire unique. Rincer le filtre avec 250 ul de PBS glacé. </li></ol></li><li> Quantifier le nombre de cellules marquées par fluorescence dans la population en utilisant un cytomètre de flux équipé d&#39;un laser jaune-vert 561 nm et a / 15 nm filtre passe-bande 585 nm. Réglez la porte pour les cellules tdTomato positive basées sur l&#39;analyse des cellules parentales et / ou des contrôles négatifs appropriés 4. </li></ol&gt; </li><li> La quantification des métastases macroscopiques et microscopiques <ol><li> Au point limite expérimental souhaité (s), d&#39;isoler et placer immédiatement les tissus dans les médias de fixation appropriée. Fixez échantillons plus larges, tels que gonadique intacte, de l&#39;utérus, et de dépôts de graisse mésentériques à 10% du formol tamponné neutre pendant 48 heures à 4 ° C. Fixer des échantillons plus petits (omental et graisses splenoportal, ainsi que des équivalents de tissus de l&#39;utérus et de la graisse mésentérique) dans 5% du formol tamponné neutre à 4 ° C pendant 2-16 h. <ol><li> Alternativement, snap geler les tissus en les plaçant dans un milieu tel que le gel PTOM et déposez-les dans une quantité appropriée de l&#39;azote liquide. </li></ol></li><li> Transfert fixé tissus à 70% d&#39;éthanol et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;intégration dans de la paraffine. Incluez et le tissu de processus comme décrit dans 3.2 et 3.3. <ol><li> Utilisez la section colorées H &amp; E pour évaluer les tissus pour la présence ou l&#39;absence de métastases microscopiques (par exemple, des groupes de 50 cellules). Confirmez til présence de métastases microscopiques par un procédé secondaire tel qu&#39;un colorant IHC pour la cytokératine 8/18 pour détecter des cellules de cancer de l&#39;ovaire. </li></ol></li></ol></li></ol> 7. Lactée spot colonisation Ex Vivo <ol><li> Mise en place de conditions ex vivo de culture d&#39;organes de base omental <ol><li> Placez chaque épiploon en un seul insert de plaque de culture et sa place dans un puits d&#39;une plaque de culture de tissus de douze puits contenant 500 pi de DME médias / F12 contenant 20% de FCS. Maintenir des cultures d&#39;organes à 37 ° C dans un environnement de CO 2 de 5% pendant 24 à 48 h et / ou des points de temps supplémentaires. Utilisez trois omenta indépendante (échantillons en triple) pour chaque condition (par exemple, le type de support / point de temps). </li><li> Pour confirmer l&#39;intégrité des tissus aux extrémités expérimentales, fixer et échantillons de procédé tel que décrit à l&#39;étape 3. Compter saine par rapport adipocytes nécrotiques sur les sections H &amp; E peut évaluer l&#39;intégrité des tissus. Un minimum de 120 cellules de ~5 échantillons biologiques est nécessaire de formuler un pourcentage de tissus vivants présente 10. </li><li> Pour mesurer la fonction des tissus, lieu omenta (n = 3) dans les puits individuels d&#39;une plaque de 24 puits contenant 500 pi de DME médias / F12 avec 20% de FCS. Laisser omenta de conditionner les médias à 37 ° C dans un environnement de CO 2 de 5% pendant 24 heures, puis retirez 250 pl pour une utilisation dans un IL-6 ELISA 10. </li></ol></li><li> Ex vivo co-culture de l&#39;épiploon de la souris avec des cellules GFP-SKOV3ip.1 <ol><li> Développer et préparer des cellules par fluorescence marqués comme décrit dans la section 4 et remettre en suspension à une concentration de 2 × 10 6 cellules par ml. </li><li> Appliquer ~ 6 ul de la colle pour tissus de la membrane de l&#39;insert de culture et laisser sécher à l&#39;air. Laver la membrane deux fois avec de l&#39;eau stérile pour éliminer tout excès de colle. Sécher à l&#39;air les membranes sous une hotte laminaire. </li><li> Exciser soigneusement la omenta et l&#39;attacher à la memb encolléeRane l&#39;aide de pinces stériles. Laisser le tissu d&#39;adhérer à la membrane pendant 1 min avant l&#39;addition de médias. Ajouter 500 ul de la suspension cellulaire sur le dessus de l&#39;épiploon dans chaque insert de culture. Remplissez la zone autour de la chambre de transwell avec 2,5 ml de DME / F-12 10. </li><li> Incuber omenta avec la suspension de cellules pendant 6 heures à 37 ° C dans un environnement de CO 2 à 5%. Retirez délicatement et laver le omenta avec ~ 10 ml de PBS. Visualiser fluorescent foyers de cellules de cancer en utilisant un système d&#39;imagerie approprié 10 fluorescent. </li></ol></li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+and+ovarian+cancer+incidence+in+BRCA1-mutation+carriers.+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.">Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).</li><li>Rebbeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Oophorectomy+in+Carriers+of+BRCA1or+BRCA2Mutations.">Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations.</a> New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).</li><li>Olivier, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcome+of+prophylactic+oophorectomy+in+BRCA1/BRCA2+mutation+carriers+and+events+during+follow-up.">Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up.</a> British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Développement de thérapies pour cibler les cellules disséminées nécessite une compréhension des mécanismes de la colonisation métastatique, la première étape critique dans le développement de la maladie péritonéale. Pour répondre à ces questions que nous signalons approches qui peuvent être utilisés pour discerner comment unique de tissu composition et l&#39;architecture de l&#39;épiploon promouvoir le cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation. Traits distinctifs de notre approche sont...

Contrairement à la plupart des tumeurs solides, des métastases de cancer de l&#39;ovaire séreux de haut grade (HGSC) sont limités à la cavité péritonéale 1. Ainsi, les thérapies efficaces péritonéale pourraient contrôler ou d&#39;éradiquer HGSC. Actuellement, une approche thérapeutique norme est cytoréduction chirurgicale combinée avec la chimiothérapie 1-3. Malheureusement, la grande majorité des patients expérience et succomber à des complications de récurrence de la maladie. Ces statistiques lamentables montrent la nécessité d&#39;améliorer la compréhension de la colonisation métastatique, le processus par lequel les cellules cancéreuses à localiser, utiliser, et proliférer dans les tissus de l&#39;hôte pour former des métastases 2. L&#39;épiploon est un site début préféré de HGSC métastases 4-7. Contrairement à d&#39;autres adipeux péritonéale, le tissu adipeux épiploïque contient des structures inhabituelles immunitaires appelées taches laiteuses, qui contiennent B, T et les cellules NK et les macrophages, qui jouent des rôles clés dans Homeos péritonéalesTASIS 8,9. En plus de leurs fonctions physiologiques, nous avons constaté que des taches laiteuses jouent un rôle actif dans le cancer ovarien métastatique 4 colonisation. Dans les dosages de métastases expérimentales, SKOV3ip.1, Caov3, et HeyA8 (humain) et ID8 (murine; C57BL / 6) cellules de cancer ovarien rapidement à domicile points laiteux, ce qui suggère que les cellules se dirigent vers un facteur chimiotactique sécrétée. Fait intéressant, les cellules cancéreuses ne colonisent adipeux péritonéale manque taches laiteuses (c.-à-gonadiques et de la graisse de l&#39;utérus) 4. Afin d&#39;identifier les mécanismes de régulation de la colonisation laiteuse place, nous avons optimisé des modèles de xénogreffes qui permettent l&#39;interrogation des événements cellulaires et moléculaires au cours du temps de la colonisation métastatique 4. Un avantage particulier des approches décrites ici est l&#39;accent mis sur l&#39;architecture et la fonction des tissus, qui permet aux utilisateurs de tester des hypothèses dans entièrement intégré in vivo et ex vivo modèles de metastatic 4,10 de la colonisation. En comparant la localisation des cellules cancéreuses et la croissance dans les dépôts de graisse péritonéale qui soit contiennent ou manquent des taches laiteuses, les enquêteurs peuvent tester la contribution (s) relative des adipocytes et des cellules à l&#39;intérieur des taches laiteuses à l&#39;hébergement et de la croissance progressive des cellules du cancer de l&#39;ovaire dans les tissus physiologiquement pertinents.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geimsa</td>
			<td>Fluka/Sigma Aldrich</td>
			<td>48900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Without calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher</td>
			<td>Seward Labsystems</td>
			<td>Stomacher 80 Biomaster</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microstomacher bag</td>
			<td>Stomacher Lab Systems</td>
			<td>BA6040/Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture plate insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer metastatic colonization of milky spot structures in peritoneal adipose

Haute qualité de l&#39;ovaire séreux cancer (HGSC), la cause de métastases péritonéales répandues, continue d&#39;avoir un très mauvais pronostic; moins de 30% des femmes sont en vie 5 ans après le diagnostic. L&#39;épiploon est un site privilégié de la formation de métastases HGSC. Malgré l&#39;importance clinique de cette microenvironnement, la contribution du tissu adipeux épiploïque à la progression de cancer de l&#39;ovaire reste peu étudié. Omental adipeux est inhabituel en ce qu&#39;il contient en tant que structures connues taches laiteuses, qui sont constitués de B, T, et les cellules NK, des macrophages et des cellules progénitrices autour de nids denses de système vasculaire. Taches laiteuses jouent un rôle clé dans les fonctions physiologiques de l&#39;épiploon, qui sont nécessaires pour l&#39;homéostasie péritonéale. Nous avons montré que des taches laiteuses favorisent également le cancer de l&#39;ovaire métastatique de la colonisation adipeux péritonéale, une étape clé dans le développement de métastases péritonéales. Nous décrivons ici les approches que nous développés pour évaluer et quantifier les taches laiteuses en paritoneal adipeux et étudier leur contribution fonctionnelle à la cellule de cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation des tissus omentales fois in vivo et ex vivo. Ces approches sont plus généralisables à des modèles de souris et des lignées cellulaires, ce qui permet l&#39;étude de l&#39;ovaire de la formation de métastases de cancer localisation initiale des cellules de structures ponctuelles laiteux pour le développement de métastases peritoneales généralisées.

Identification et histologique examen des dépôts de graisse péritonéale Dissection anatomique brute permet l&#39;identification de quatre des cinq principales sources de graisse péritonéale (figure 1A). Déplacement dans le sens horaire à partir du haut au centre sont: l&#39;épiploon (OM; décrit) situé sur l&#39;estomac et de la rate, la graisse des gonades (GF) entourant l&#39;ovaire gauche (vo), la graisse de l&#39;utérus (UF) attachée aux corn...

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In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Dans vivo et ex vivo approches pour étudier Cancer de l&#39;ovaire métastatique colonisation de Lactée spot Structures en péritonéale adipeux

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

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In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

12.9K vues.  The University of Chicago. We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

L&#39;infection ex vivo de tissus vivants avec des virus oncolytiques

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

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Médecine

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Une In Vitro Système d&#39;étude dormance tumorale et le commutateur à la croissance métastatique

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

Un humain<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Plaque athéroscléreuse modèle pour étudier la biologie de la lésion

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo 19 F IRM pour le suivi cellulaire

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Profil moléculaire du microenvironnement de la tumeur invasive dans un modèle 3-dimensionnelle des cellules du cancer colorectal et<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblastes

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validation des Nanobodies et Anticorps Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Expériences tumeur xénogreffe NIRF-imagerie dans des souris en utilisant<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cytométrie en flux et microscopie

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Human Dupuytren de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture pour l&#39;étude de myofibroblastes et de matrice extracellulaire Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Télémétrie intra-utérine mesurer souris contractile pression<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...