Nous tenons à remercier le Dr Hesham Abdelbary pour fournir des spécimens humains chirurgicales pour les données présentées dans la figure 2.

1. Le traitement des tissus <ol><li> Pour de meilleurs résultats, ce protocole doit être effectuée à l&#39;aide de tissus isolés fraîchement déposés dans des milieux DMEM contenant 10% de FBS, 1% Pennicilin / streptomycine solution, et de 0,1% Amphothericin solution B immédiatement après la chirurgie avant la transformation. Si cela n&#39;est pas possible, les tissus peuvent être laissés la nuit dans ce milieu à 4 degrés avant la transformation. </li><li> Avant le traitement de l&#39;échantillon, stériliser une pince en métal et des lames jetables en les déposant dans une solution d&#39;éthanol à 70% pendant au moins 5 minutes. Aussi préparer une plaque de 24 puits avec 2 ml de milieu DMEM contenant 10% de FBS, 1% Pennicilin / streptomycine solution, et de 0,1% Amphothericin B. </li><li> Recueillir l&#39;échantillon de tissu dans une hotte à flux laminaire de culture cellulaire à l&#39;aide des pinces stérilisées et déposer le tissu dans un plat vide de 15 cm de Pétri, en gardant le couvercle sur le côté, côté stérile en place. </li><li> Dans la hotte de culture cellulaire, l&#39;utilisation de 2 mm biopsie afin d&#39;obtenir différents noyaux d&#39;une variété de régions dans le tissu comme dans la Figure 1. Dépôt des carottes dans le couvercle de l&#39;Pétri de 15 cm à l&#39;aide d&#39;une pince, en laissant assez d&#39;espace entre chaque coeur afin qu&#39;ils puissent être facilement coupé le long de l&#39;axe horizontal. </li><li> Fendez chaque coeur en 4 quarts, même en utilisant une lame de rasoir stérilisée comme dans la Figure 1. </li><li> En utilisant une pipette, mettre chaque trimestre coeur d&#39;un noyau donné dans un puits différent de A1 à A4 comme dans la figure 1, déjà contenant 1,5 ml de DMEM contenant 10% de FBS, 1% Pennicilin / streptomycine solution, et de 0,1% Amphothericin solution B . Répétez l&#39;opération pour chaque core. Cela devrait permettre d&#39;échantillonnage représentatif de la tumeur, tout en minimisant les biais dans un puits donné / état. Pour une meilleure représentation, d&#39;augmenter le nombre de cœurs. </li></ol> 2. Évaluation de la viabilité des tissus <ol><li> Après le traitement des tissus, ajouter 25 pi bleu Alamar à bien # A1 et A2 # comme le montre la figure 1 et incuber pendant 1 heure à 37 degrés dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. </li><li> Après incubation avec du bleu Alamar, enlever 3 fois 100 pi de chaque A1 et A2 ainsi et le transfert à 6 différents puits d&#39;une plaque de 96 puits. Lire le signal en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence (530 d&#39;excitation, 590 émissions) et conserver les données pour vos dossiers. </li><li> Après le signal bleu Alamar a été lu, le transfert de tous les morceaux de tissu en utilisant un embout de la pipette, à partir de puits A1 à C1 qui contient du DMEM, 10% de FBS + PS + AmphoB. Soyez prudent de ne pas transférer une quantité excessive de médias de puits A1. </li><li> Infect godets A3 et A4 respectivement avec 10 6 pfu de la GFP et la luciférase exprimant exprimant virus de la vaccine dilué dans 25 ul de médias. Eh bien A2 peut être infecté par un virus qui exprime que toute transgène donnée, y compris rien du tout. </li><li> 72 heures plus tard, ajouter 25 ul bleu Alamar aux puits C1 et D1 et répétez l&#39;étape 2.2 </li></ol> 3. Visualisation de l&#39;expression du transgène GFP par microscopie de fluorescence <ol><li> Retirez tous les supports de culture de cellules couvrant les morceaux de tissu afin de prendre de bonnes photos de fluorescence. </li><li> En utilisant un microscope à fluorescence de dissection capables, d&#39;abord prendre une image à contraste de phase à une résolution appropriée </li><li> Passer en mode fluorescence et prendre une photo en utilisant le filtre approprié pour visualiser le transgène d&#39;intérêt, dans ce cas, la GFP. </li><li> Utilisez un filtre de fluorescence pour une autre longueur d&#39;onde dans la mesure du possible, une de celle du transgène d&#39;intérêt (comme DP) pour prendre une photo de fluorescence de fond </li></ol> 4. Visualisation d&#39;expression luciférase utilisant un système d&#39;imagerie in vivo (IVIS) <ol><li> Assurez-vous que l&#39;IVIS est initialisé avant de commencer. </li><li> En format A4 et B4 puits, ajouter 5 ul de substrat luciférine 10 mg / ml, bien mélanger et laisser incuber pendant 5 minutes à température ambiante. </li><li> Réglez le temps d&#39;exposition IVIS à 5 secondes et prendre une photo de votre puits. Si l&#39;image est saturée, répéter avec le temps faible exposition. S&#39;il n&#39;y a pas de signal, d&#39;augmenter le temps d&#39;exposition. </li><li> Utilisation du logiciel d&#39;imagerie IVIS, vous pouvez retirer de fond en utilisant le signal de même B4 et sélectionnez la région d&#39;intérêt pour quantifier le signal de luminescence. </li></ol> 5. Évaluation des titres viraux par dosage de plaque <ol><li> Avant de quantifier les titres viraux, les tissus doivent d&#39;abord être homogénéisés pour la libération des particules virales. Cela peut être fait quelques mois plus tard dans les échantillons de tissus infectés sont stockés à -80 </li><li> Peser l&#39;échantillon qui doit être homogénéisé en utilisant une échelle d&#39;analyse. Dans ce cas, nous allons utiliser l&#39;échantillon prélevé dans le godet A2. </li><li> Placer le tissu est dans un tube de 5 ml en polystyrène à fond rond faucon et ajouter 1 ml de PBS. Homogénéiser le tissu en utilisant un homogénéisateur de tissu. Si nécessaire, conserver l&#39;homogénat à -80 pour l&#39;évaluation des titres viraux à une date ultérieure. </li><li> Pour un titre virus de la vaccine, première plaque 1 million de cellules U2OS dans une plaque à 6 puits et incuber pendant la nuit dans un degré 37, 5% de CO 2 et humideified tels qu&#39;ils ont atteint environ 95% de confluence le lendemain incubateur. </li><li> Utilisez milieux exempts de sérum pour faire des dilutions en série du virus, en veillant à changer trucs entre chaque étape de dilution. Généralement nous faisons 1 sur 10 dilutions et utiliser 100 ul de transférer dans 900 pi. Combien de dilutions sont faites dépend du rendement du virus prévu. </li><li> Suite à faire les dilutions, retirez le support couvrant les cellules U20S plaqués, puis ajouter 500 ul de stock de virus dilué (pour chaque dilution) pour infecter les cellules U2OS. Incuber les cellules pendant 1 minutes heures à 37 degrés Celsius dans un 5% de CO 2 incubateur humidifié. </li><li> Pendant ce temps, faites chauffer le X 2 concentrés DMEM contenant 20% de FBS, et la solution 3% de CMC dans un bain d&#39;eau 37 degrés. </li><li> Après l&#39;incubation de 1 heure, retirer le support couvrant les cellules infectées U2OS. Mélanger 01:01 volumes de 3% de CMC: 2X DMEM, 20% de FBS ensemble et utiliser 2 ml de ce mélange pour couvrir chaque puits des cellules infectées U2OS. </li><li> Mettez les cellules de retour dans un 37 degré 5% de CO 2 incubateur humidifié pour un autre 48 heures. </li><li> Après 48 heures, ajouter 2 ml de méthanol acide acétique fixatif sur le dessus de la superposition de CMC dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 10 minutes dans une hotte de culture cellulaire. </li><li> Jeter la superposition fixe et lavez restant hors des puits en utilisant l&#39;eau du robinet. </li><li> Colorer les cellules fixées U2OS avec 2 ml d&#39;une solution de bleu de Coomassie par puits et incuber pendant 30 minutes à température ambiante à basse vitesse sur un agitateur assiette. </li><li> Retirer la tache de Coomassie des puits et laver les plaques avec de l&#39;eau du robinet. Laisser sécher avec Couvercle pendant environ une heure. </li><li> Les plaques résultant virale peut être facilement visualisés dans la figure 2C. Les plaques peuvent être stockées indéfiniment à ce stade. </li><li> Nombre de plaques à l&#39;étape de dilution, où entre 10 et 100 plaques sont visibles. </li><li> Multiplier le nombre de plaques comptées par la dilution utilisée et multiplier le nombre obtenu par 2 pour donner un titre en PFU / ml. Par exemple, si 25 plaques sont comptées dans le puits où une dilution million de fois a été utilisé, le titre de l&#39;échantillon initial non dilué est de 25 multiplié par 1 million multiplié par 2 ou 50 millions d&#39;UFP / ml. En outre diviser ce nombre par le poids initialement mesure pour l&#39;échantillon de rendre compte des titres en PFU / g </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Afin de déterminer avec précision si un échantillon de tissu obtenu chirurgicalement normale / tumeur est ou n&#39;est pas infectables par un virus, il faut d&#39;abord s&#39;assurer que l&#39;échantillon de tissu est moins viable. Figure 1A montre que la viabilité peut être évaluée en utilisant un colorant métaboliques (bleu Alamar) et que les tissus normaux et tumoraux peut rester métaboliquement active pendant une période d&#39;au moins 72h. Ceci suggère que les tissus in vivo cultivées ex peut supporter la réplication virale. Un avantage significatif de virus oncolytiques est qu&#39;elles peuvent être modifiées pour exprimer des transgènes thérapeutiques ou d&#39;imagerie. Figure 2D-E montre que la GFP ou luciférase peut être détectée à partir des tissus infectés ex vivo, d&#39;autres soutenant que ces tissus sont viables et aussi infectables. Bien que l&#39;expression du transgène accrue est généralement associé à la réplication virale, il n&#39;est pas nécessairement synonyme d&#39;un cycle de vie virale productive qui conduit à l&#39;auto-amplification et de propagation, ce qui est pensé pour être important pour l&#39;activité thérapeutique. Pour cette raison, il est nécessaire de déterminer si davantage de virus est produit que ce qui était initialement utilisé pour infecter les tissus. Figure 2B montre que, lors de la quantification virale par dosage de plaque, plus le virus est obtenue après 72 heures, puis une infection des tissus prélevés immédiatement après l&#39;infection. Globalement, ces données montrent que le tissu tumoral excisée chirurgicalement peuvent rester viables dans la culture cellulaire pour une période d&#39;au moins 72 heures, au cours de laquelle la réplication virale du temps peut être pris en charge. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de l&#39;échantillonnage des tissus / sectionnement protocole. Échantillon de tissu est traité par la suppression de plusieurs noyaux 2 mm qui sont ensuite divisés en quatre quartiers qui sont distribuées au hasard dans les puits A1 à A4. Les codes de couleur indiquent les réactifs utilisés dans chaque puits. Les carrés en gris dans le puits représentent chaque trimestre depuis le 6 cœurs individuels représentés. Le tissu dans le puits A1 est transféré à un nouveau puits (C1) avec les médias après la lecture initiale du bleu Alamar. Une seconde lecture est effectuée à la fin de l&#39;incubation de 72 heures avec des virus. Wells A4 et B4 sont complétées par Luciférine après l&#39;incubation 72 heures post-infection <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Viabilité et infectabilité des échantillons de tissus des patients. La viabilité des tissus A) telle que mesurée par Alamar Blue signal à 2 heures et 72 heures après la collecte. L&#39;axe Y représente la vierge corrigées Alamar Blue signal. B) titrage de virus de la vaccinerecueillies par gramme d&#39;échantillons de tissus 2 et 72 heures post-infection. C) Exemple de plaques virus de la vaccine sur les cellules après coloration coomassie U2OS. D) signal de luminescence obtenu à partir de patients VV-luciférase tissu infecté imagées par IVIS. E) photos microscopie à fluorescence d&#39;échantillon de tissu du patient infecté par VV-GFP.

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Une des étapes cruciales dans ce protocole est d&#39;obtenir des échantillons de tissus frais. Si l&#39;échantillon est mis en culture cellulaire après une longue attente à la salle d&#39;opération dans un média approprié (par exemple PBS), cela peut compromettre la viabilité des tissus et prévenir infectabilité. Fait à noter, les tissus normaux est intrinsèquement plus enclins à ces effets que les tissus tumoraux. Un autre point critique est le nombre de cœurs utilisés pour échantillonner les tissus et la cohérence de leur taille. Incohérences dans la taille va entraîner une variabilité entre les échantillons des patients, car des facteurs tels que l&#39;hypoxie tissulaire et de la surface infectectable va fluctuer en fonction de la taille des noyaux et des quarts de base. Bien que cela puisse être partiellement résolu en utilisant des tissus trancheuses, un avantage de la méthode présentée ici est qu&#39;il est relativement facile, moins sujettes à la contamination, et largement applicable à une variété de types de tissus, y compris les tissus mous ou visqueux, qui ne sont pas facilement se prêtent pour les tissus de trancher. Notamment, le nombre de cœurs peut être augmentée afin d&#39;obtenir une meilleure représentation des tissus. En outre, les noyaux peuvent être coupées en plusieurs morceaux (ex. 5-8) pour accueillir d&#39;autres dosages potentiel d&#39;être fait en parallèle tels que ADN, ARN, ou l&#39;extraction des protéines. Toutefois, le nombre de pièces dans lesquelles les noyaux peuvent être coupés à la taille reproductibles dépendra de la taille réelle des cœurs, qui peut être modifié en utilisant différents carottiers entreprises. Optionnellement, une façon d&#39;aider à obtenir des morceaux de tissu de façon reproductible taille est d&#39;égaliser la longueur des carottes à l&#39;aide d&#39;une règle avant de poursuivre en les subdivisant en petits morceaux. Le protocole peut naturellement être modifiés pour tenir compte d&#39;autres virus et nous avons constaté que les tissus peuvent être viables et le soutien de réplication pour un maximum de 6 jours. Le protocole peut encore être étendu à d&#39;autres mesures viro-transgènes exprimés notamment cytrokines. Après l&#39;infection, les tissus peuvent également être inclus dans la paraffine pour les autres coupes et coloration par des méthodes immunohistochimiques, ce qui permet d&#39;affiner davantage de l&#39;histologie des tissus et comment il se rapporte à une infection virale 10-12.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> De glucose à haute DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> NorthBio Inc </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Amphothericin solution B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Utilisez à 0,1% </td></tr><tr><td> Pennicilin-streptomycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Utilisez moins de 1% </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> Sel de potassium D-luciférine </td><td> Produits d&#39;imagerie moléculaire </td><td> D-luciférine 1g de sel de potassium </td><td> Remettre en suspension dans du PBS à 10 mg / ml et filtrer sur filtre de 0,22 um </td></tr><tr><td> MEM en poudre </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> Faire de la moitié du volume proposé de faire 2X MEM et filtrer sur filtre de 0,22 um avant utilisation </td></tr><tr><td> Carboxyméthyl cellulose (CMC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9481 </td><td> Faire une solution à 3% dans de l&#39;eau déminéralisée et autoclave. Notez que la poudre peut prendre un certain temps à remettre en suspension </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mm biopsie </td><td> Miltex </td><td> MX-33-31 </td><td></td></tr><tr><td> Double Lames Prep Bord </td><td> Personna Medical Care </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope de fluorescence dissection </td><td> Leica </td><td> le modèle M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;imagerie in vivo du système (IVIS) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> IVIS ® série 200 </td><td></td></tr><tr><td> Tearor tissus </td><td> Produits Biospec </td><td> modèle de 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses

Virus oncolytiques (OVS) sont les nouvelles thérapeutiques qui reproduire sélectivement dans les cellules tumorales et tuer 1. Plusieurs essais cliniques évaluant l&#39;efficacité d&#39;une variété de plates-formes, y compris oncolytiques HSV, réovirus, et VO vaccine comme traitement pour le cancer sont actuellement en cours 2-5. Une caractéristique clé de virus oncolytiques est qu&#39;ils peuvent être génétiquement modifiées pour exprimer des transgènes journaliste qui permet de visualiser l&#39;infection des tissus par microscopie ou bio-luminescence imagerie 6,7. Cela offre un avantage unique car il est possible d&#39;infecter les tissus de l&#39;ex vivo les patients avant le traitement afin de déterminer la probabilité de succès virothérapie oncolytiques 8. À cette fin, il est essentiel d&#39;échantillon de tissu de façon appropriée pour compenser l&#39;hétérogénéité des tissus et d&#39;évaluer la viabilité des tissus, en particulier avant l&#39;infection 9. Il est également important de suivre la réplication virale utilisant des transgènes journaliste si elle est exprimée par la plateforme oncolytiques, ainsi que par titrage direct de tissus après homogénéisation afin de discriminer entre l&#39;infection abortive et productive. L&#39;objet de ce protocole est de répondre à ces questions et décrit aux présentes 1. Le prélèvement et la préparation des tissus tumoraux pour les deux cultures cellulaires. L&#39;évaluation de la viabilité des tissus en utilisant les colorants métaboliques Alamar Blue 3. Infection ex vivo des tissus cultivés avec des virus de la vaccine exprimant soit la GFP ou luciférase de luciole 4. La détection de l&#39;expression du transgène par microscopie à fluorescence ou en utilisant un système d&#39;imagerie in vivo (IVIS) 5. Quantification de virus par dosage de plaque. Cette méthode globale présente plusieurs avantages, notamment la facilité de traitement des tissus, la rémunération de l&#39;hétérogénéité des tissus, le contrôle de la viabilité des tissus, et la discrimination entre l&#39;infection abortive et les os réplication virale foi.

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Les virus oncolytiques sont prometteurs pour traiter le cancer. La capacité de vérifier l&#39;infectabilité des échantillons de tissus provenant de patients vivent avant le traitement est un avantage unique de cette approche thérapeutique. Ce protocole décrit comment traiter les tissus pour les<em&gt; Ex vivo</emInfection&gt; un virus oncolytiques et la quantification ultérieure virale.

L&#39;infection ex vivo de tissus vivants avec des virus oncolytiques

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

12.6K vues.  Ottawa Hospital Research Institute (OHRI). Les virus oncolytiques sont prometteurs pour traiter le cancer. La capacité de vérifier l'infectabilité des échantillons de tissus provenant de patients vivent avant le traitement est un avantage unique de cette approche thérapeutique. Ce protocole décrit comment traiter les tissus pour les Ex vivo un virus oncolytiques et la quantification ultérieure virale.

Vidéo: Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Culture ex vivo des tissus du patient et l&#39;examen de la livraison de gènes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Recherche

Médecine

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manipulation du Rat coton en études pour l&#39;évaluation pré-clinique de virus oncolytiques

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo l&#39;imagerie en direct de métastases pulmonaires et leur microenvironnement

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Administration transartérielle de virus oncolytiques pour locorégionale thérapie de Orthotopique HCC chez le rat

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

Le lait maternel stimule la croissance des Enteroids : un modèle Ex Vivo de la prolifération cellulaire

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant&#039;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Évaluation rapide In Vivo des fonctions de génération de l’Adjuvant T cytotoxique Lymphocytes pour le développement de vaccins

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Un petit modèle Animal de Perfusion hépatique normothermique Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Un modèle de Culture tissulaire Ex Vivo pour fibrovasculaire Complications dans la rétinopathie diabétique proliférante

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescence Étiquetage des pièges extracellulaires de l'homme et de la murine Neutrophil dans les tissus paraffins

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Optocardiographie et études d'électrophysiologie des coeurs perfusés d'Ex Vivo Langendorff

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...