This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

1. Préparation des parasites des cultures cellulaires, Collection de Parasite Pellets <ol><li> Préparer un milieu RPMI-1640-HEPES en ajoutant 10 g de poudre de milieu RPMI-1640, 66 mg de sulfate de gentamycine, 2 g de bicarbonate de sodium, un tampon de HEPES 5,9 g, 50 mg d&#39;hypoxanthine et 3,8 g de dextrose dans 1 L stérile dH 2 O. Mélanger à l&#39;aide tableau agitateur magnétique jusqu&#39;à ce que tous les poudre se dissout dans l&#39;eau distillée 1 L. Effectuer micro filtration de milieux utilisant filtre de 0,22 um. Rangez les médias dans des flacons stériles. </li><li> Lavez non infectés (frais) de type A + érythrocytes utilisant RPMI. Préparer 5% d&#39;hématocrite des érythrocytes (0,5 ml de globules rouges frais lavés dans 9,5 ml 10% RPMI + sérum humain). </li><li> Faire 15% de sérum humain + RPMI (15 ml de sérum humain et 85 ml de RPMI) pour initier la culture des parasites. Faire 10% de sérum humain et du milieu RPMI (10 ml de sérum humain et 90 ml de RPMI) à poursuivre la culture des parasites dans les globules rouges. </li><li> Culture P. falciparum (3D7 et FCR-3 souches) dans le typeA + érythrocytes humains à 5% d&#39;hématocrite et 20% de parasitémie en boîte de Pétri ou un flacon de culture de 75 cm 3. Maintenir la culture in vitro selon la méthode de Trager et Jensen bougie pot 26. Alternativement, maintenir les cultures sont dans un incubateur à 37 ° C en maintenant 9,5% de CO 2 et de 3,4% du gaz N2. Culture P. falciparum dans du RPMI 1640-HEPES milieu supplémenté avec 10% de sérum humain. </li><li> Synchroniser P. culture falciparum en ajoutant 65% percoll (65 ml de percoll + 35 ml de RPMI-1640 sans sérum humain) à la culture concentrer 27. </li><li> Centrifuger le concentré de culture avec percoll à 2500 g pendant 5 min, ce qui résulte en 3 couches. Soigneusement, en utilisant une pipette de transfert isoler schizontes du transfert de couche intermédiaire dans un tube séparé dans des conditions aseptiques 27. </li><li> Laver les cultures isolées avec 10% de sérum humain + RPMI-1640 à deux reprises pour enlever l&#39;excès de percoll par centrifugation à 7500 g pendant 5 min. DiSCard le surnageant à chaque fois dans des conditions aseptiques 27. </li><li> Continuer la culture de la P. synchronisée schizontes falciparum dans 10% de sérum humain RPMI-1640 + 27. </li><li> Recueillir schizontes en traitant Plasmodium érythrocytes infectés par avec 10 mM Tris pH 8,8 et centrifugation à 15000 g pendant 15 min 23. Granulés parasites de magasin à -70 ° C après addition de 5 ul d&#39;inhibiteur de protéase (aprotinine) pour les pastilles. Utilisation des granulés de parasites pour l&#39;extraction des protéines, l&#39;isolement d&#39;ADN génomique et l&#39;isolement de l&#39;ARN. </li></ol> 2. Préparation de vecteur plasmidique <ol><li> Isoler l&#39;ADN génomique de P. Granulés schizontes falciparum préparés à partir de cultures d&#39;environ 20% de parasitémie. </li><li> Ajouter 600 ul de 10 mM de Tris-HCl de pH 7,6, 50 mM d&#39;EDTA pH 8,0, 0,1% de SDS et 1 mg / ml de proteinase K, de pastilles dans un tube de microcentrifugeuse, homogénéiser pastille en utilisant une seringue de 1 ml fixée à une aiguille 26 G. Autre remplissage de la seringueavec le mélange de granulés et de vidange dans un tube de microcentrifugeuse 20 fois. Incuber tube contenant homogénat O / N dans un bain-marie à 50 °. </li><li> Effectuer phénol - chloroforme (P + C) l&#39;extraction en ajoutant 600 pl de P + C (300 pi de phénol et 300 pi de chloroforme) pour culot homogénéisé. Cap le tube hermétiquement et agitez vigoureusement le mélange en inversant le tube fin à la fin. Tube à centrifuger à 14000 g pendant 2 min et recueillir solution aqueuse supérieure à l&#39;aide d&#39;une micropipette dans un nouveau tube. Répéter deux fois cette étape. </li><li> Ajouter 600 ul de chloroforme à la phase aqueuse dans le nouveau tube à partir de l&#39;étape 2.1.2. Vortex le tube pendant 10 secondes et centrifuger à 14 000 g pendant 2 min. Mesurer la couche aqueuse supérieure avec une micropipette et le transférer à un nouveau tube. </li><li> Ajouter 0,1 volume d&#39;acétate de sodium 5 M pH 5,5 et 1 vol de l&#39;isopropanol (si la couche aqueuse est de 300 pi ajouter 30 ul d&#39;acétate de sodium 5 M pH 5,5 + 330 pl de l&#39;isopropanol) à laïque aqueuseer de l&#39;étape 2.1.3. Incuber le tube à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Centrifuger le tube à 14 000 g pendant 10 min pour précipiter l&#39;ADN culot. Jeter le surnageant et laver culot avec 100 pi d&#39;éthanol à 70% (70 pi d&#39;éthanol et 30 pi de dH 2 O) pour éliminer l&#39;excès de sel à partir de l&#39;ADN. ADN de magasin dans 50 pi de dH 2 O à -20 ° C. </li><li> Concevoir amorces directe et inverse en utilisant un logiciel ou manuellement pour l&#39;amplification de P. PF3D7_1361800 gènes falciparum, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 et PF3D7_0114100 précédemment identifiées dans les études protéomiques 16,18 avec des sites de restriction appropriés pour permettre le clonage des séquences de gènes dans les multiples sites de clonage du plasmide d&#39;expression pT7CFE1-CHIS, comme indiqué dans le tableau 2. </li><li> Ajouter un mélange réactionnel de 50 ul en ajoutant; 5 pi de isolé P. ADN génomique falciparum, 5 pi de tampon 10x, 5 ul de MgCl2, 1,5 pl de amorce avant, 1,5 pi deamorce inverse, 0,5 ul de l&#39;ADN polymerase T7 et 31,5 ul de dH 2 O et d&#39;effectuer la réaction en chaîne par polymerase (PCR) à 94 ° C pendant 8 min pour la dénaturation, 50 ° C pendant 1 min 30 sec d&#39;extension à 72 ° C pendant 9 min pour le recuit et renaturation pour amplifier des gènes présentés dans le tableau 1. </li><li> Les produits de PCR séparés sur gel d&#39;agarose à 1% (1 g d&#39;agarose et 100 ml de Tris acétate EDTA (TAE) tampon) 32. </li><li> Couper les bandes d&#39;ADN amplifiés par PCR à partir du gel d&#39;agarose, placer les tranches de gel contenant de l&#39;ADN dans une colonne d&#39;extraction de filage de gel d&#39;ADN et congeler à -20 ° C pendant 5 min. Ajouter 100 ul d&#39;isopropanol pour les tranches de gel congelés et centrifuger à 14 000 xg pendant 5 min. </li><li> Mesurer l&#39;écoulement aqueux filtré dans le tube de collecte de l&#39;étape 2.5, en utilisant une micro-pipette et transférer dans un nouveau tube. Ajouter 0,1 volume de 5 M d&#39;acétate de sodium et centrifuger à 14 000 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant et ajouter 10 ul de dH 2 O THe culot d&#39;ADN. </li><li> Digérer le vecteur d&#39;expression pT7CFE1-CHIS et des fragments d&#39;ADN purifié de (2,6) dans deux tubes séparés en ajoutant 3 ul de plasmide et 5 pi de produits de gènes de PCR à chaque tube. Ajouter à chaque tube, une pi d&#39;enzymes de restriction spécifiques, 2 ul de tampon de réaction et 14 ul de dH 2 O. </li><li> Ajouter 3 ul de plasmide digéré, 5 ul de fragments d&#39;ADN digérés, 2 ul de tampon ligase 10X, 1 ul de ligase et 9 pl de dH 2 O dans un tube de microcentrifugation. Incuber à 12 ° CO / N. </li><li> Ajouter 0,1 volume de 3 M d&#39;acétate de sodium à pH 5,5 et 2 volumes d&#39;éthanol (si le volume des tubes de ligature est 20 ul ajouter 2 ul de 3 M d&#39;acétate de sodium + 44 ul d&#39;éthanol) pour le tube de l&#39;étape 2.14. Bien mélanger et incuber à 20 ° C pendant 15 min. </li><li> Centrifuger le tube à 14 000 g pendant 15 min. Retirer délicatement le surnageant en utilisant un micro pipette sans perturber le culot. </li><li> Ajouter 100 pi de 70% d&#39;éthanol to le culot provenant de l&#39;étape 2.10. Centrifuger le tube à 14 000 g pendant 5 min. Retirer et jeter le surnageant. Ajouter 10 ul d&#39;eau exempte de nuclease à la pastille d&#39;ADN. </li></ol> 3. Utilisation de l&#39;expression des protéines dans la cellule humaine Expression System gratuit Vitro <ol><li> Préparer 20 pi de mélange de transcription en mesurant 2 pi de la pT7CFE1 CHIS à ADN recombiné plasmide, 4 pi de tampon 5x de transcription, 4 pi de NTP mélange, 2 pl de la T7 RNA Polymerase et 8 ld&#39;eau exempte de nucléase pour 2 étapes humain in vitro Protein Expression en utilisant des modèles d&#39;ADN. Mélanger les composants dans un tube de microcentrifugation et incuber pendant 75 min à 30 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Prendre 2 pi du mélange de transcription et l&#39;ajouter à 23 pl de mélange de traduction contenant 12,5 pi de lysat de cellules HeLa, 2,5 ul de protéines accessoires, 1 ul de solution de sel A, 0,5 ul d&#39;acides aminés -Met, 0,5 ul d&#39;acides aminés Leu, 181; l d&#39;inhibiteur de RNase, 1,25 ul de mix énergétique et 3,75 ld&#39;eau exempte de nucléase. </li><li> Incuber le mélange de traduction de l&#39;étape 3.2 à 30 ° C pendant 90 min. Magasin produits traduits à -20 ° C. </li><li> Préparer 25 pi de la transcription et de mélange de traduction en ajoutant 3 pi de la pT7CFE1 Chis-ADN recombinant plasmidique, 2 ul d&#39;eau sans nucléase, 5 pi de mélange réactionnel, 12,5 pi de HeLa lysat et 2,5 pi de protéines accessoires pour 1 étape Couplé Human Expression IVT de protéines pour des matrices d&#39;ADN. </li><li> Incuber le mélange réactionnel de l&#39;étape 3.4 pendant 90 min à 6 h à 30 ° C. Stockez les produits de traduction à -20 ° C. </li></ol> 4. Purification de protéines recombinantes exprimées <ol><li> Ajouter 75 ul de tampon de purification 1x à 25 pl de produit de traduction de 100 ul de rendre mélange de purification. </li><li> Ajouter 100 ul de résine de chelation de nickel pour 100 ul de mixte de purificationure. Lavage de la résine Ni-deux fois en ajoutant 300 ul de dH 2 O et 300 pi de tampon de liaison. Re-suspendre la résine et centrifuger à 14 000 g pendant 1 min pour éliminer l&#39;excès d&#39;éthanol. </li><li> Ajouter 100 ul de mélange provenant de l&#39;étape de purification de 4,2 à 100 ul de résine de chelation de nickel et incuber le mélange pendant 60 min à température ambiante. </li><li> Centrifuger le mélange à 14 000 g pendant 1 min et de recueillir surnageant dans un nouveau tube étiqueté comme «circuler à travers&quot;. </li><li> Laver la résine avec 100 ul de tampon de lavage 1 x (20 mM d&#39;imidazole, mM de NaH 2 PO 4 à pH 8, NaCl 2,5 M et dH 2 O 250). Centrifuger à 14 000 g pendant 1 min et de recueillir surnageant dans un tube frais étiqueté &quot;lavage&quot;. Répétez l&#39;étape deux fois 4.5. </li><li> Ajouter 100 ul de 1 x tampon d&#39;élution (100 mM d&#39;imidazole, 250 mM de Na 2 PO 4 à pH 8,0, 2,5 M de NaCl et dH 2 O) à la résine et incubation pendant 15 min. Centrifuger à 14 000 g pendant 1 min. Faire deux fois l&#39;étape d&#39;élution. Chaquetemps ramasser le surnageant dans des tubes de microcentrifugation frais et que l&#39;étiquette «éluat». </li><li> Après élution, laver la résine deux fois comme décrit dans l&#39;étape 4.5. Magasin couler à travers, lavages et des échantillons d&#39;élution à -20 ° C ou moins. Résine doit être stockée à 4 ° C. Utiliser 30 ul de chaque échantillon pour SDS-PAGE et analyse d&#39;immunotransfert. </li></ol> 5. Coomassie (Bradford) 34 Protein Assay <ol><li> Préparer des solutions d&#39;albumine de sérum bovin norme (BSA) avec la concentration 20 pg / ml (mélanger 10 ul de BSA (2 mg / ml) et 90 ul de dH 2 O), 40 ug / ml (mélanger 20 ul de BSA (2 mg / ml) et 80 ul de dH 2 O), 60 ug / ml (mélange 30 ul de BSA (2 mg / ml) et 70 ul de dH 2 O), 80 ug / ml (mélanger 40 ul de BSA (2 mg / ml) et 60 ul de dH 2 O), 100 ug / ml (mélange 50 ul de BSA (2 mg / ml) et 50 ul de dH 2 O), 160 ug / ml (mélanger 80 ul de BSA (2 mg / ml) et 20 ul de dH2 O) et 200 ug / ml (100 ul de BSA (2 mg / ml). </li><li> Mesure 5 pi de l&#39;écoulement à travers, lavages et des échantillons d&#39;élution de l&#39;étape 4.7. Ajouter 95 pi de dH 2 O. </li><li> Ajouter 5 ml de Coomassie réactif bleu pour les mélanges des étapes 5.1 et 5.2. Couvrez les tubes avec du parafilm et vortex pendant 10 secondes puis incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> En utilisant un spectrophotomètre, mesurer la densité optique (DO) à une longueur d&#39;onde de 650 nm pour les tubes de protéines provenant de l&#39;étape 5.3. la concentration de la parcelle contre OD lecture pour déterminer les concentrations de protéines 34. </li></ol> 6. Western Blot <ol><li> Ajouter 5 ul d&#39;extraits de schizontes de P. falciparum, 2 ul d&#39;Escherichia coli exprime rhOP-3 protéines recombinantes 31, 5 ul de protéines recombinantes exprimées selon deux étapes et une étape dans des systèmes in vitro d&#39;expression humains et 10 pi de produits de la protéine purifiée en utilisant la méthode d&#39;affinité pour séparer les tubes. </li&gt; <li> Ajouter du tampon d&#39;échantillon d&#39;électrophorèse contenant du mercaptoéthanol à chaque tube pour un volume final de 20 ul à faire des échantillons de protéines solubilisées. Faire bouillir tubes pendant 2 min. </li><li> Charger échantillons de protéines solubilisées sur 10% de gels de SDS-PAGE pour séparer les protéines. </li><li> Transfert protéines séparées de gels de SDS-PAGE à papier de nitrocellulose (NCP) par électrophorèse à 35 mA par gel dans une chambre western blot semi-sèche pendant 2 heures. </li><li> Bloquer les PCN après le transfert de 2% de lait écrémé. </li><li> Incuber bloqué PCN avec les anticorps polyclonaux suivants dilué 1: 100 dans 2% de lait d&#39;effectuer un transfert de Western; anticorps de lapin # 676 21 spécifique de P. rhoptries mérozoïtes falciparum, des anticorps de souris 20 spécifiques pour P. yoelii et P. berghei rhoptries mérozoïtes, antisérums # 685 spécifiques pour le P. falciparum protéines vacuole parasitophore, SERA (sérine riche antigène) 22 et des anticorps spécifiques de l&#39;Maurer217; protéines fente s GCFP-2TM 28. </li><li> Incuber PCN également en 1: 100 souris et de sérum de lapin et un surnageant de culture usé (SCS) à partir de cellules de myélome SP2 contrôles négatifs normales dilué. </li><li> Incuber PCN avec des anticorps et des contrôles à 4 ºC O / N. </li><li> Laver PCN 4x avec Blot tampon et incuber PCN avec des espèces anticorps secondaires spécifiques conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) diluée à 1: 1000 dans le lait 2%. </li><li> Laver PCN 4x avec un tampon Blot. Incuber lavé PCN avec la solution de développement de couleur A + B (solution A: ajouter 50 ml de 1 x Blot tampon et 30 ul de H 2 O 2; Solution B: ajouter 10 ml de methanol et 30 mg de 3-chloro-naphtol) pour 30 min dans l&#39;obscurité. Analyser les résultats de Western blot colorimétrie. </li></ol>

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	<li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania.+cell-free+expression+system.">Leishmania. cell-free expression system.</a> Methods. 55 (1), 58-64 (2011).</li><li>Alexandrov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+construction+of+expressed+proteomes+using+a+Leishmania+tarentolae.+based+cell-free+expression+system.">Towards the construction of expressed proteomes using a Leishmania tarentolae. based cell-free expression system.</a> PLOS One. 5 (12), e14388 (2010).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+A+method+for+high-level+over-expression+of+Plasmodium.+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: A method for high-level over-expression of Plasmodium. and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Birkholtz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+plasmodial+proteins+for+structural+studies+and+functional+annotation.">Heterologous expression of plasmodial proteins for structural studies and functional annotation.</a> Malar. J. 7, 197 (2008).</li><li>Doolan, D. L., Mu, Y., Unal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+humoral+immune+responses+to+P.+falciparum.+infection+with+protein+microarrays.">Profiling humoral immune responses to P. falciparum. infection with protein microarrays.</a> Proteomics. 8 (22), 4680-4694 (2008).</li><li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production.">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 17 (4), 373-380 (2006).</li><li>Fern&#225;ndez-Robledo, J. A., Vasta, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+from+protozoan+parasites.">Production of recombinant proteins from protozoan parasites.</a> Trends Parasitol. 26 (5), 244-254 (2010).</li><li>Gowda, D. C., Davidson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+the+malaria+parasite.">Protein glycosylation in the malaria parasite.</a> Parasitol. Today. 15 (4), 147-152 (1999).</li><li>Goshima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+protein+factory+for+converting+the+transcriptome+into+an+in+vitro-expressed+proteome.">Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome.</a> Nat. Methods. 5, 1011-1017 (2008).</li><li>Hinnebusch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mechanism and regulation of initiator methionyl-tRNA binding to ribosomes. 5, 185-243 (2000).</li><li>Hino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+cell-free+protein+synthesis+based+on+a+crude+cell+extract+from+Escherichia+coli.,+wheat+germ,+and+rabbit+reticulocytes.">Efficiency of cell-free protein synthesis based on a crude cell extract from Escherichia coli., wheat germ, and rabbit reticulocytes.</a> Journal of Biotechnology. 133 (2), 183-189 (2008).</li><li>Le Roch, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+gene+function+by+expression+profiling+of+the+malaria+parasite+life+cycle.">Discovery of gene function by expression profiling of the malaria parasite life cycle.</a> Science. 301 (5639), 1503-1508 (2003).</li><li>Makrides, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+achieving+high-level+expression+of+genes+in+Escherichia+coli.">Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli.</a> Microbiol. Rev. 60 (3), 512-538 (1996).</li><li>Mehlin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+proteins+from+Plasmodium+falciparum.:+results+from+1000+genes.">Heterologous expression of proteins from Plasmodium falciparum.: results from 1000 genes.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 148 (2), 144-160 (2006).</li><li>Mikami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+cell-derived+in+vitro+coupled+transcription/translation+system+optimized+for+production+of+recombinant+proteins.">A human cell-derived in vitro coupled transcription/translation system optimized for production of recombinant proteins.</a> Protein Expr. Purif. 62 (2), 190-198 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+rhoptry:+Enriched+isolated+from+Plasmodium.+merozoites.">Proteome analysis of rhoptry: Enriched isolated from Plasmodium. merozoites.</a> Journal of Proteome Research. 3 (5), 995-1001 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Aikawa, M., Hall, T., Drazbar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+protein+located+in+Maurer&#8217;s+clefts+underneath+knobs+and+protein+localization+in+association+with+Rhop-3+and+SERA+in+the+intracellular+network+of+infected+erythrocytes.">Plasmodium falciparum. protein located in Maurer&#8217;s clefts underneath knobs and protein localization in association with Rhop-3 and SERA in the intracellular network of infected erythrocytes.</a> Parasitol Res. 87 (3), 173-185 (2001).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Plasmodium.+gene+family+encoding+Maurer&#8217;s+cleft+membrane+proteins:+Structural+properties+and+expression+profiling.">A Plasmodium. gene family encoding Maurer&#8217;s cleft membrane proteins: Structural properties and expression profiling.</a> Genome Res. 14 (6), 1052-1059 (2004).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Banks, T. L., Fujioka, H., Drazba, J. A., Yadav, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+yoelii.:+Novel+rhoptry+proteins+identified+within+the+body+of+merozoite+rhoptries+in+rodent+Plasmodium+malaria.">Plasmodium yoelii.: Novel rhoptry proteins identified within the body of merozoite rhoptries in rodent Plasmodium malaria.</a> Exp Parasitol. 120 (1), 113-117 (2008).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Rio, D., Fujioka, H., Aikawa, M., Yang, J. C., Yakubu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+merozoite+rhoptries,+identification+of+novel+rhoptry+associated+proteins+from+P.+yoelii.,+P.+chabaudi.,+P.+berghei.+and+conserved+interspecies+reactivity+of+organelles+and+proteins+with+P.+falciparum.+rhoptry-specific+antibodies.">Isolation of merozoite rhoptries, identification of novel rhoptry associated proteins from P. yoelii., P. chabaudi., P. berghei. and conserved interspecies reactivity of organelles and proteins with P. falciparum. rhoptry-specific antibodies.</a> Exp Parasitol. 89 (3), 271-284 (1998).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Fujioka, H., Masamichi, A., Messineo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum.+rhoptry+proteins+of+140/130/110kd+(Rhop-H)+are+located+in+an+electron+lucent+compartment+in+the+neck+of+the+rhoptries.">Plasmodium falciparum. rhoptry proteins of 140/130/110kd (Rhop-H) are located in an electron lucent compartment in the neck of the rhoptries.</a> J Euk Microbial. 42 (3), 224-231 (1995).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Hishashi, F., Masamichi, A., Messineo, D. G., Leash, A. M., Hall, T., Drazba, J. A., Ndengele, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Organization+and+cross+linking+analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+erythrocyte+binding+proteins+Rhop-H+and+SERA.">Molecular Organization and cross linking analysis of the Plasmodium falciparum erythrocyte binding proteins Rhop-H and SERA.</a> J Protozool. Res. 10 (3), 128-154 (2000).</li><li>Sam-Yellowe, T. Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

We do not have any competing financial interests in this study.

Les étapes importantes pour l&#39;expression réussie de protéines en utilisant deux étapes dans le système de cellule humaine de la libre expression et la purification vitro sont: 1) l&#39;amplification réussie et le clonage de gènes dans le vecteur plasmidique pT7CFE-Chis; 2) la transcription de l&#39;ARN à 30 ° C; 3) la traduction de protéine à 30 ° C en présence d&#39;inhibiteur de la RNAse; 4) le développement du protocole de purification par affinité en utilisant des billes à base de rés...

Dans la recherche du paludisme, l&#39;expression de protéines immunogènes en utilisant des systèmes à base cellulaires procaryotes ou eucaryotes reste un défi. L&#39;AT richesse du génome de Plasmodium et les mécanismes post-traductionnelles inconnus 14,7, contribuent aux difficultés liées à l&#39;obtention des protéines correctement repliées et immunogènes pour les études de production d&#39;anticorps et de vaccins. Des systèmes procaryotes tels que Escherichia coli ont été utilisés pour l&#39;expression de protéines recombinantes. Systèmes procaryotes sont à faible coût, efficaces, produisent des rendements élevés de protéine recombinante et disposer de plusieurs vecteurs de clonage. Hôte E. coli cellules sont faciles à transformer et les cellules croissent rapidement. Cependant, les systèmes procaryotes ont des limitations telles que le manque de substitution d&#39;acides aminés, la modification post-traductionnelle, le risque de contamination, les produits hétérogènes et l&#39;accumulation de protéines recombinantes à l&#39;intérieur des corps d&#39;inclusion 24. Dans unétude de Mehlin et al. (2006), 1000 cadres de lecture ouverts (ORF) ont été exprimés. Environ 7% des protéines exprimées étaient solubles 14. L&#39;insolubilité est observée en raison de la nature polarisée de gènes et la haute fréquence de codons qui sont utilisés de préférence par le Plasmodium riche en AT 14 génome. Une autre stratégie pour surmonter ce problème a été mis au point en utilisant des plasmides ou des cellules hôtes contenant les ARNt qui reconnaissent les codons ou des codons qui correspondent aux fréquences 3 rares. Même après l&#39;exécution de ces optimisations, de très petites portions de protéines sont exprimées comme soluble, active et immunogène 14. Les systèmes d&#39;expression sans cellules contiennent tous les composants nécessaires pour la transcription et la traduction tels que les ribosomes, les facteurs d&#39;initiation, les facteurs d&#39;allongement (traductions facteurs), et ARNt aminoacyl-ARNt synthétases. Les deux réactions de transcription et de traduction sont couplées en une étape procédure 11,29. Le transcriréaction d&#39;ption est effectuée dans un tube avant quantité appropriée d&#39;ARNm est incubée avec de la machinerie de traduction dans un tube différent 11,29. Bien que ces méthodes sont efficaces dans Plasmodium sp. Expression de la protéine, un inconvénient majeur est la longueur de temps pour l&#39;expression de la protéine, ce qui est environ 22 h 29. En outre, le coût élevé des fournitures pour l&#39;inclusion dans les protocoles 29, les préparatifs de la main-d&#39;œuvre du lysat cellulaire et des incohérences dans les préparations de composants, de rendre ces systèmes inaccessible. L&#39;objectif principal de chercheurs pour le développement d&#39;un système d&#39;expression sans cellule dépend de facteurs tels que la modification génétique rapide, les rendements rapides avec des concentrations élevées et droites préparations de lysat à terme 1. Les systèmes eucaryotes tels que les levures, les lignées cellulaires de mammifères, de baculovirus système d&#39;expression à médiation par, Tetrahymena thermophilie, Dictyostelium discoideum et des systèmes d&#39;expression parasites such comme Leishmania ont été utilisées pour l&#39;expression de protéines recombinantes 7. Les systèmes eucaryotes part relation phylogénétique et donc part également des caractéristiques telles que la glycosylation, l&#39;acylation, la formation de liaison disulfure, une interaction chaperonne, la protéolyse et sous-compartimentalisation cellulaire. Protéines événements de sécrétion chez les eucaryotes empêchent l&#39;accumulation et diminue la toxicité pour les systèmes d&#39;expression 13. L&#39;utilisation de systèmes de levure est préféré comme ils sont indiqués pour l&#39;expression de protéines à grande échelle et pour obtenir des rendements élevés 4. Deux P. protéines falciparum PFCP-29 et Pvs25 ont été produits en utilisant le système de levure 4. Cependant, un inconvénient majeur dans la synthèse de la plupart des protéines était motifs irréguliers N et O-glycosylation, pliage impropre et la troncature des protéines à partir de leur forme native 4. L&#39;utilisation de cellules de mammifères pour la synthèse de protéines recombinantes est laborieux et il est expensive pour maintenir des lignées de cellules recombinantes stables 4. Par conséquent, les cellules de mammifères ont été limitées pour l&#39;analyse de la signalisation de protéine, les interactions entre protéines et d&#39;interactions hôte-parasite et également pour tester des vaccins à ADN 4. L&#39;ADN et l&#39;ARNm humain vitro système exempt de cellules d&#39;expression de protéine décrite ici est dans un système à base de mammifère dérivé des cellules HeLa qui exprime des protéines dans 3 heures. Protéines exprimées en utilisant le vecteur d&#39;expression pT7CFE1-CHIS ont une étiquette de C-terminal de faciliter l&#39;identification et la purification. Le système basé sur des cellules HeLa est complétée avec des facteurs d&#39;initiation de traduction et un régulateur de traduction, ce qui améliore l&#39;efficacité du système de traduction. Les protéines peuvent être rapidement traduits, sélectionnés, vérifiés et traités pour une utilisation dans diverses applications immunologiques et structurelles 15. Des systèmes d&#39;expression eucaryotes acellulaires tels que le germe de blé et de reticulocytes de lapin sont actuellement utilisés pour l&#39;expression de varprotéines eucaryotes dif- y compris les protéines de Plasmodium 11,29. En outre, E. des systèmes exempts de cellules sur la base coli sont également employés pour l&#39;expression des protéines eucaryotes 11. Le tableau 1 résume les différents systèmes d&#39;expression de cellules libres en comparant les caractéristiques des systèmes, ainsi que la facilité d&#39;utilisation des systèmes pour l&#39;expression des protéines. Le système exempt de cellules humaines par rapport aux autres a la capacité d&#39;effectuer et soumettre co-traductionnelle modifications et est moins coûteux. L&#39;optimisation des codons est possible et l&#39;ensemble des réactions peut être effectuée en 3 heures. Le système HeLa est un système de traduction idéal pour la synthèse des protéines dans le laboratoire. Un avantage majeur de connexion des systèmes d&#39;expression cellulaires humaines par rapport aux autres systèmes acellulaires est la disponibilité de plusieurs lignées cellulaires différentes provenant de différents organes et tissus. Plusieurs variétés de systèmes exempts de cellules peuvent être conçues en fonction de la lignée cellulaire. L&#39;extraits dérivés de cellules de mammifère ont un rendement plus élevé pour synthétiser de grandes protéines que les autres systèmes d&#39;expression de cellules libres. Ces systèmes d&#39;expression de cellule libre peuvent également être utilisés dans des applications de diagnostic et de caractérisation des protéines telles que 30 microréseaux. Les lignes de cellules HeLa populaires sont les plus largement utilisés pour réaliser l&#39;expression de protéines 33. Le réticulum endoplasmique dans les lignées cellulaires HeLa est peu développé, d&#39;où l&#39;absence de glycosylation post-traductionnelle 33 activité de modification. Cependant, ce système est considéré comme étant avantageux pour la synthèse des protéines de Plasmodium comme Plasmodium manque également de glycosylation après modification de traduction 29. La connexion de protocole de transcription-traduction cellule HeLa est facile à réaliser, peu coûteux et de protéines peut être exprimée en 90 min, prêt pour la purification et d&#39;autres applications en aval.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

Le paludisme entraîne une morbidité et une mortalité importantes mondiale. Aucun vaccin de routine est actuellement disponible. Une des principales raisons de l&#39;absence d&#39;un vaccin est le défi d&#39;identifier des candidats vaccins appropriés. Protéines paludéennes exprimés en utilisant des systèmes d&#39;expression à base de cellules procaryotes et eucaryotes sont mal glycosylés, généralement insolubles et subissent pliage impropre menant à immunogénicité réduite. Les systèmes d&#39;expression exempt de germes de blé, de reticulocytes de lapin et Escherichia coli lysat cellulaire de lysat sont actuellement utilisés pour l&#39;expression de protéines paludiques. Toutefois, la durée de temps d&#39;expression et inappropriée glycosylation des protéines reste un défi. Nous démontrons l&#39;expression de protéines de Plasmodium in vitro en utilisant des systèmes de la libre expression de cellules HeLa base, appelées &quot;cellules sans systèmes d&#39;expression in vitro humains». Les systèmes d&#39;expression de cellules HeLa 2 basé libres transcrire l&#39;ARNm en 75 min et 3 ul de transcribed ARNm est suffisante pour traduire des protéines en 90 min. Le système d&#39;expression est une étape de transcription et une traduction couplé système d&#39;expression; la transcription et la traduction co-produit dans 3 heures. Le processus peut également être prolongé pour 6 heures en fournissant une énergie supplémentaire. Dans le système d&#39;expression en 2 étapes, l&#39;ARNm est transcrit premier et ensuite ajouté au mélange de traduction de l&#39;expression des protéines. Nous décrivons comment exprimer des protéines de paludisme; hydrophobe Fente de PF3D7_0114100 Maurer - 2 transmembranaire (GCFP-2TM) protéine, une protéine de PF3D7_0925900 hydrophile et une répétition de tatou contenant des protéines PF3D7_1361800, en utilisant le système de la libre expression dans des cellules HeLa base. Les protéines sont exprimées dans des micro volumes utilisant des stratégies d&#39;expression en 2 étapes et 1-étape. Procédé de purification par affinité pour purifier 25 ul de protéines exprimées à l&#39;aide du système cellulaire humaine libre d&#39;expression in vitro est également décrit. le rendement en protéines est déterminée par le test de Bradford et l&#39;a expriméet des protéines purifiées peuvent être confirmés par une analyse Western blot. Protéines recombinantes exprimées peuvent être utilisées pour des analyses immunologiques et des vaccinations, le séquençage de protéines.

Validation des protéines recombinantes exprimées par la réactivité avec des anticorps spécifiques est une première étape importante en confirmant le bon pliage des protéines exprimées. Protéines recombinantes paludisme ont été exprimées à l&#39;aide d&#39;une étape et en deux étapes dans des systèmes in vitro de la libre expression de cellules humaines. Les protéines recombinantes sont méthode d&#39;affinité Ni-chélateur purifié. Nous avons ensuite utilisé des antiserums contre rhoptries mérozoï...

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HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

L&#39;expression des protéines paludisme dans les systèmes à base de cellules reste difficile. Nous démontrons deux systèmes cellule libre expression étape et une IVT de l&#39;étape (la traduction in vitro) pour exprimer des protéines recombinantes de rhoptries paludisme à partir de cellules HeLa. On utilise un système de purification par affinité à base de résine Ni-à purifier les protéines de rhoptries.

Systèmes cellules HeLa base de la libre expression pour l&#39;expression des<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptries Protéines

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

12.0K vues.  Cleveland State University.  L'expression des protéines paludisme dans les systèmes à base de cellules reste difficile. Nous démontrons deux systèmes cellule libre expression étape et une IVT de l'étape (la traduction in vitro) pour exprimer des protéines recombinantes de rhoptries paludisme à partir de cellules HeLa. On utilise un système de purification par affinité à base de résine Ni-à purifier les protéines de rhoptries. 

Vidéo: HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Recherche

Biologie

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloration des protéines dans les gels de Coomassie G-250, sans solvant et l&#39;acide acétique organique

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Evaluation de l&#39;expression de GFP et viabilité en utilisant le Tali Image Based Cytomètre

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Les petits extraits nucléaires pour les dosages fonctionnels de l&#39;expression génétique Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Protocoles pour la mise en œuvre d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sur la base du système d&#39;expression cellulaire gratuit TX-TL pour la biologie synthétique

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...