Nous sommes reconnaissants à M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valence, K. Dufu, H. Cheng pour des discussions utiles. Des cellules HeLa ont été obtenues de la National Culture Cellulaire Centre (Minneapolis, MN). Nous remercions également Eisai Co., Ltd pour fournir E7107 et le Nikon Imaging Center à Harvard Medical School de l&#39;aide pour la microscopie optique. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH GM043375 à RR et de l&#39;EGF et NRSA bourse pour JLH.

1. Les cellules HeLa croissance pour l&#39;extraction nucléaire <ol><li> Plate cellules HeLa sur trois plaques de 150 mm avec du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline / streptomycine. Croître dans une étuve à 37 ° C avec 5% de CO 2, jusqu&#39;à cellules sont confluentes 90%. </li></ol> Astuce-Split cellules 1:10 d&#39;une plaque de confluence et de la récolte 3 jours après la séparation. Tip-Une plaque supplémentaire peut être cultivé dans le cas où il ne sont pas suffisamment de cellules avec trois plaques (par exemple, si les cellules sont moins de 90% de confluence). 2. Préparer et Chill Solutions extrait nucléaire <ol><li> Préparer de nouvelles solutions comme indiqué dans le tableau 2. </li><li> Aliquote de 10 ml de tampon hypotonique dans un tube Falcon de 15 ml. Aliquote de 1 ml de tampon de sel et 1 ml de tampon de faible teneur en sel dans tubes Eppendorf de 1,5 ml. Réfrigérer les tampons sur la glace. Ajouter les volumes appropriés de PMSF et de la TNT à chaque tampon juste avant d&#39;utiliser (voir <strong&gt; Tableau 1). </li></ol> 3. La récolte des cellules HeLa pour l&#39;extraction nucléaire <ol><li> Aspirer les médias à partir des cellules et laver les cellules une fois avec 13 ml de PBS 1X à température ambiante par plaque. </li><li> Aspirer le PBS de lavage. </li></ol> Tip-Aspirer le plus de PBS que possible par aspiration d&#39;abord, puis debout la plaque sur le côté, en attendant quelques secondes, et l&#39;aspiration du reste. <ol start="3"><li> Utilisation d&#39;un dispositif de levage cellule, racler cellules sur le bord inférieur des plaques, puis transférer les cellules à un tube Eppendorf. Évitez de faire des bulles. Les 3 plaques de cellules grattées doivent s&#39;inscrire dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. </li></ol> Tip-Il est plus facile d&#39;estimer le volume des cellules, si un tube Eppendorf est utilisé. Pour l&#39;échelle, utilisez des tubes Falcon. <ol start="4"><li> Centrifuger à 4 ° C dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 100 xg à pellets des cellules. </li></ol> 4. Swell cellules HeLa dans un tampon hypotonique </p&gt; <ol><li> Aspirer soigneusement le PBS à partir du culot cellulaire et d&#39;estimer la valeur d&#39;hématocrite (PCV) en regardant la gradation sur le tube. Trois plaques confluentes de cellules HeLa rapporterait environ 500 pi de PCV. </li><li> Ajouter 2 fois la PCV du tampon hypotonique au culot de cellules. Agiter doucement pour remettre les cellules. Utilisez un Pipetman P1000 doucement remettre les cellules en pipetant de haut en bas si nécessaire. </li><li> Centrifuger à 4 ° C dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 100 xg à pellets des cellules. * Les cellules ont commencé à gonfler en ce moment, et le volume de la cellule devrait maintenant être d&#39;environ 750 pi-1000 pl. </li><li> Aspirer soigneusement le tampon hypotonique et ajouter de nouvelles tampon hypotonique à un volume final de 1,5 ml. Remettre en suspension les cellules. </li><li> Incuber les cellules remises en suspension gonflées sur la glace pendant 10 min. </li></ol> 5. Lyse des cellules en utilisant un homogénéisateur Dounce <ol><li> Utilisez un tampon hypotonique pour rincer le Dounce puis le refroidir sur glace. Essuyez le sec pilon avec un wip tâche délicateer (par exemple Kimwipe). Retirer le tampon restant de la Dounce l&#39;aide d&#39;un embout 1000 ul micropipette prolongée. </li><li> Transfert des cellules gonflées dans le Dounce. Déplacez lentement le pilon serré de la Dounce de haut en bas 5 fois pour lyser les cellules, en faisant attention d&#39;éviter les bulles. </li><li> Essai pour la lyse des cellules en utilisant une partie aliquote de 5 ul de cellules provenant de la Dounce. Placez la partie aliquote dans un tube Eppendorf et ajouter un volume égal de bleu trypan. Mettez le mélange sur une lame et d&#39;examiner les cellules à l&#39;aide d&#39;un microscope optique. Les noyaux des cellules lysées seront apparaissent en bleu. Environ 90% de lyse est idéal. </li></ol> Tip-Le nombre de fois où les cellules doivent être dounced variera en fonction de l&#39;étanchéité de la Dounce. Lors de ce protocole pour la première fois, de déterminer le nombre de fois à Dounce en effectuant l&#39;étape 5.3 après chaque course avec la Dounce. Ne pas trop Dounce, douncing excessive va détruire les noyaux. <ol start="4"><li> Transférer les cellules lysées à une pré-chilled tube Eppendorf et de spin dans une micro-4 ° C pendant 5 min à 1500 x g. Le culot contient les noyaux. Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube, sans perturber les noyaux. Le surnageant contient le cytoplasme. </li></ol> Tip-Le cytoplasme peut être utilisé tel quel ou traitées ultérieurement à un S100 en utilisant le même à haute vitesse de rotation utilisée pour les extraits en vrac (voir 1 pour la préparation d&#39;un actif S100 à partir d&#39;extraits en vrac). 6. Sel-Extraire le noyaux <ol><li> Estimer le volume emballé nucléaire (PNV) en regardant la gradation sur le tube. Un PCV de 500 ul donne généralement un PNV de 400 pi. </li><li> Ajouter ½ X PNV de tampon de sel faible aux noyaux en insérant une extrémité micropipette au fond du tube et lentement presser le tampon dans le noyau tout en mélangeant doucement. Ne pas pipeter de haut en bas. Tapoter doucement les tubes afin de s&#39;assurer que le culot est complètement remises en suspension dans le tampon faible teneur en sel avant de continuer. </li> &lt;li&gt; Ajouter ½ X PNV de tampon élevée en sel et mélanger rapidement 1 fois en inversant le tube. Ne secouez pas. Tournent à 4 ° C pendant 30 min. </li></ol> Tip-Soyez doux avec les noyaux quand ils sont dans le tampon de sel pour éviter de les lyser. <ol start="4"><li> Centrifuger à 4 ° C dans une microcentrifugeuse pendant 15 min à 18000 x g. Le surnageant est l&#39;extrait le sel nucléaires de haute activité (HS-NE). Trois plaques de cellules généralement céder 500-600 pi de HS-NE. </li></ol> 7. Concentrez-vous et Dialyser l&#39;extrait nucléaire <ol><li> Transférer 500 ul de la HS-NE en réfrigérés mini-centricons (Amicon) et de spin pendant 50 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse à 14000 x g. Inverser le mini-centricon (Amicon) et le placer dans un nouveau tube Eppendorf. Spin pendant 2 min à 4 ° C 1000 xg pour récupérer le HS-NE. Le HS-NE seront concentrées à environ 115 pi. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un Pipetman P200, transférer 45 aliquotes de la HS-NE en mini-dialyse Slide-A Lyzers les et placez-les dans 500 ml de tampon de dialyse réfrigérés. Faire en sorte que le fond de la diapositive-A-Lyzer est aligné avec le fond du flotteur. Remuer pendant 1-2 heures à 4 ° C. Le NE apparaît trouble après la dialyse. </li></ol> Tip-Ne pas centrifuger pour éliminer le précipité trouble que l&#39;on observe après la dialyse, que cette centrifugation réduit l&#39;activité de l&#39;extrait. <ol start="3"><li> La NE peut être utilisé immédiatement ou aliquotés. Aliquotes devraient être éclair congelés dans l&#39;azote liquide et stockés à -80 ° C. La NE peut être stocké et subissent au moins deux cycles gel-dégel sans perdre l&#39;activité. </li></ol> 8. Les résultats représentatifs Récemment, l&#39;efficacité des systèmes in vitro pour le couplage de la transcription ARNP II à l&#39;épissage ont été mis au point 2-5. Ces systèmes travaillent cellules HeLa cultivées en vrac et donc ne se prêtent pas à tester rapidement les effets de certains traitements cellulaires sur des échantillons multiples. Sur la base de ce besoin d&#39;une l&#39;utilité générale d&#39;un protocole extrait à petite échelle (voir Discussion), nous avons établi une solide petite échelle méthode extrait nucléaire. Les données représentatives de comparaison du ARNP II de transcription / épissage de réaction dans l&#39;extrait à petite échelle avec l&#39;extrait nucléaire vrac nucléaire est représenté sur la figure 2. Produit d&#39;assemblage CMV-ADN, qui contient le promoteur de CMV et qui code pour un substrat d&#39;épissage standard (Ftz 3, figure 2A) a été utilisé pour l&#39;analyse. Lorsque cette construction a été incubé dans la masse (voies 1-3) ou à petite échelle (voies 4-6), extrait des niveaux similaires de la naissante pré-ARNm ont été synthétisés par le point 5 min le temps (Figure 2, les pistes 1 et 4 ). Après l&#39;addition de α-amanitine de bloquer la transcription en outre, les intermédiaires et les produits d&#39;épissage épissés accumulée au fil du temps avec une cinétique similaire dans les deux types d&#39;extraits (Figure 2, pistes 2, 3, 5, 6). Ces résultats représentatifs montrent que l&#39;efficacité du coup d&#39;Etat<html> dirigée par ARNP II de transcription / épissage système est similaire dans les extraits en vrac et à petite échelle nucléaires. Pour démontrer l&#39;utilité de la méthode extrait à petite échelle, des extraits ont été préparés à partir de cellules HeLa traitées avec l&#39;inhibiteur de l&#39;épissage, E7107, ou le pladiénolide contrôle négatif composé F 6,7, puis le couplage ARNP II de transcription / épissage essai a été effectué. Comme le montre la figure 3, la transcription par ARNP II produite efficacement dans des extraits préparés à partir à la fois le F pladiénolide et E7107 cellules traitées (10 points dans le temps min). En revanche, l&#39;épissage a eu lieu normalement dans l&#39;extrait préparé à partir des pladiénolide F-cellules traitées, mais a été abolie dans les cellules E7107-traitées (Figure 3, points 20-60 min de temps). Ces données fournissent la preuve de concept pour l&#39;utilisation des extraits nucléaires à petite échelle pour le traitement spécial de cellules à petite échelle. jpg &quot;/&gt; Figure 1. Schéma du protocole Extrait à petite échelle. Étape P1. Les cellules sont cultivées en monocouche, récolté à partir de plaques en utilisant un dispositif de levage et de cellules gonflées par l&#39;addition d&#39;un tampon hypotonique. Etape P2. Les cellules sont lysées en utilisant un homogénéisateur Dounce et centrifugé pour obtenir un culot des noyaux. Etape P3. Les noyaux sont séparés du cytoplasme et de subir une extraction du sel. Etape P4. L&#39;extrait nucléaire est concentrée et dialysée. Etape P5. Les résultats sont obtenus, qui montrent que des extraits nucléaires sont fonctionnels (voir la figure 2 pour plus de détails). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig2.jpg" /> Figure 2. Les petits extraits nucléaires sont robustes dans un couplage ARNP II de transcription / épissage dosage. A. Schéma de la matrice d&#39;ADN CMV-Ftz utilisé pour couplage ARNP II de transcription / épissage. Le promoteur de CMV et les tailles de l&#39;intron et les exons sont indiquées. B. Comparaison des couplé ARNPII transcription / épissage dosage en utilisant soit extrait en vrac nucléaire ou à petite échelle extrait nucléaire. α-amanitine a été ajouté, après 5 min de la transcription et épissage a été autorisé à se produire pour 30 et 60 min. L&#39;ARN a été extrait et fractionné sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 5% et détectés par phosphoimager. Les intermédiaires d&#39;épissage et les produits sont indiqués. Le endogène U6 snRNA et ARNt présents dans l&#39;extrait et qui sont marqué au 32P pendant l&#39;incubation sont indiqués. Voir 3 pour un protocole détaillé sur le couplage ARNP II de transcription / épissage système. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4140/4140fig3.jpg" /> Figure 3. Les petits extraits nucléaires préparés à partir de cellules HeLa traitées avec le médicament inhibiteur de l&#39;épissage E7107 sont défectueux dans l&#39;épissage. Cellules ont été traitées avec 3 pladiénolide uM F ou E7107 comme6 et décrit ensuite utilisé pour préparer des petits extraits nucléaires. Une évolution dans le temps a été réalisée en utilisant la même transcription / épissage dosage comme dans la Figure 2. Les intermédiaires d&#39;épissage et des produits, et U6 ARNsn et ARNt sont indiqués.

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	<li>Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+and+mutant+human+beta-globin+pre-mRNAs+are+faithfully+and+efficiently+spliced+in+vitro.">Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro.</a> Cell. 36, 993-1005 (1984).</li><li>Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+in+vitro+synthesis+and+splicing+of+RNA+polymerase+II+transcripts.">Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts.</a> Rna. 6, 1325-1334 (2000).</li><li>Das, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+coupling+of+RNAP+II+transcription+to+spliceosome+assembly.">Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly.</a> Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).</li><li>Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+splicing+to+Pol+II+transcription+stabilizes+pre-mRNAs+and+influences+splicing+patterns.">Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns.</a> PLoS Biol. 4, e147 (2006).</li><li>Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+in+vitro+system+for+co-transcriptional+splicing.">A model in vitro system for co-transcriptional splicing.</a> Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).</li><li>Kotake, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+factor+SF3b+as+a+target+of+the+antitumor+natural+product+pladienolide.">Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide.</a> Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).</li><li>Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-tumor+drug+E7107+reveals+an+essential+role+for+SF3b+in+remodeling+U2+snRNP+to+expose+the+branch+point-binding+region.">The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region.</a> Genes. 25, 440-444 (2011).</li><li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+nuclei.">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei.</a> Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).</li><li>Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-scale+procedure+for+preparation+of+nuclear+extracts+that+support+efficient+transcription+and+pre-mRNA+splicing.">A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing.</a> Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).</li></ol>

La production et l&#39;accès gratuit à cet article est sponsorisé par Abcam, Plc.

Nous avons établi une méthode rapide et reproductible pour la préparation d&#39;extraits nucléaires de petites quantités de cellules HeLa cultivées en monocouche. Nous avons démontré que ces extraits sont robustes, en montrant que la cinétique et de l&#39;efficacité de ARNP II de transcription / épissage tests sont similaires dans les extraits à petite échelle et en vrac nucléaires. Nous avons montré l&#39;utilité des extraits en démontrant que des extraits préparés à partir de cellules traitées avec un médicament inhibiteur de l&#39;épissage sont actifs pour la transcription qui est défectueuse dans l&#39;épissage. Notre méthode pour la préparation de petits extraits nucléaires a été créée en combinant et en optimisant les méthodes précédemment établies pour en prendre des extraits de cellules HeLa cultivées en suspension à grande échelle 1,8 et une méthode pour la petite préparation d&#39;extraits 9. Nous avons établi notre protocole parce que les précédentes petits extraits ne sont pas fonctionnels pour certains tests, tels que la transcription couplé / splicing dosage. Une différence importante entre l&#39;ancienne petite échelle protocole 9 et le nôtre, c&#39;est que nous avons optimisé les conditions de lyse des cellules en utilisant un mini-Dounce alors que le protocole précédent lysées cellules en les poussant à travers une aiguille de petit calibre 9. Les résultats d&#39;aiguille de lyse dans des bulles, ce qui peut expliquer pourquoi les extraits étaient inactifs et / ou difficiles à reproduire pour certains dosages. Nous avons également ajouté une étape de concentration de notre protocole. Cette étape augmente l&#39;activité des extraits, qui sont extrêmement sensibles à la concentration, et limite également la variabilité entre les extraits qui est inhérente aux petits préparatifs. Enfin, notre préparation est systématiquement réalisée avec seulement trois plaques de 150 mm de monocouches de cellules, sans effet significatif sur l&#39;activité par rapport à des extraits en vrac. Ainsi, la procédure est susceptible d&#39;être réduits pour les petits préparatifs qui nécessitent des réactifs coûteux ou de la disponibilité limitée des cellules. Par exemple, nous avons préparé small échelle des extraits de cellules knock-down RNAi et de chroniques des cellules de leucémie lymphoïde patients (CLL), et utilisé ces extraits pour les essais fonctionnels et / ou biochimiques (FEM, JLH, TY et RR, non publié). Nous avons constaté que les extraits sont précieux pour l&#39;ARNi suivie par des dosages biochimiques spécifiques, tels que immunopreciptations, les westerns, et coloration à l&#39;argent. Après avoir établi l&#39;efficacité de renverser une protéine particulière, une étude plus détaillée peut être effectuée en faisant un effet de choc stable lignée cellulaire, qui peut être utilisé pour préparer des extraits supplémentaires à moindre coût. La spectrométrie de masse des protéines présentes dans immunoprécipités obtenu à partir de ces lignées de cellules knock-down sera également une application utile de la méthode. En plus de la transcription couplé / épissage test que nous avons utilisé comme exemple pour notre description du protocole ici, les extraits à petite échelle devraient être généralement applicable à de nombreux tests fonctionnels et biochimiques, tels que ceux utilisés pour la st différenteeps dans l&#39;expression des gènes (par exemple le plafonnement, l&#39;épissage, la transcription, la transformation microARN polyadénylation,). Le protocole peut également être adapté pour les types cellulaires de patients qui peuvent être obtenus soit en suspension (comme les cellules de LLC) ou cultivés dans la culture (telles que les fibroblastes des patients). Enfin, la fraction cytoplasmique obtenus au cours de la procédure devrait se révéler utile pour des analyses à la fois fonctionnelles et biochimiques qui nécessitent le cytoplasme.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Nom complet du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 4 - (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique </td><td> Sigma </td><td> H3375-500G </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Chlorure de magnésium hexahydraté </td><td> Sigma </td><td> M2670-500G </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Chlorure de potassium </td><td> Pêcheur </td><td> P335-212 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluorure de phénylméthanesulfonyle </td><td> Sigma </td><td> P7626-100G </td></tr><tr><td> TNT </td><td> Dithiothreitol </td><td> Américaine bioanalytique </td><td> AB00490-5G </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Éthylènediaminetétraacétate de disodium, dihydrate </td><td> Américaine bioanalytique </td><td> AB00500-01000 </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td></td><td> MP Biomedicals </td><td> 800689 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Dulbecco milieu essentiel minimal </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Sérum fœtal bovin </td><td> Gibco </td><td> 16140 </td></tr><tr><td> Pénicilline / streptomycine </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Cellgro </td><td> 21-040-CV </td></tr><tr><td> Bleu de Trypan Stain 0,4% </td><td></td><td> Gibco </td><td> 15250 </td></tr><tr><td> Lifters cellulaires </td><td></td><td> Corning </td><td> 29442-200 </td></tr><tr><td> Plaques 150mm </td><td></td><td> VWR </td><td> 353025 </td></tr><tr><td> Étendue Micropipette Astuce </td><td></td><td> Denville </td><td> P1126 </td></tr><tr><td> Dounce homogénéisateur, 1ml, avec un pilon serré </td><td></td><td> Wheaton </td><td> 357538 </td></tr><tr><td> Slidealyzers, MWCO 10 kDa </td><td></td><td> ThermoScientific </td><td> 69572 </td></tr><tr><td> Mini-Centricons, MWCO 3kDa </td><td></td><td> Millipore (Amicon) </td><td> UFC500396 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Réactifs et équipements spécifiques. <table border="1"><tbody><tr><td> Solution </td><td> Finale </td><td> Stock </td><td> Dispenser </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hypotonique </td><td> HEPES 10 mM, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td> &lt;td&gt; 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 750 pi </td></tr><tr><td></td><td> 10 mM de KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 1,67 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM de PMSF </td><td> 200 mM de PMSF </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM de DTT </td><td> 2M TNT </td><td> 125 pi </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Amener à 500 ml avec de l&#39;eau </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Faible teneur en sel </td><td> 20 mM d&#39;HEPES, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 pi </td></tr><tr><td></td><td> 20 mM de KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 667 pi </td></tr><tr><td> &amp; Nbsp; </td><td> 0,2 mM d&#39;EDTA </td><td> EDTA 0,5 M </td><td> 40 pl </td></tr><tr><td></td><td> 25% de glycérol </td><td> Glycérol </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM de PMSF </td><td> 200 mM de PMSF </td><td> 100 pi </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM de DTT </td><td> 2M TNT </td><td> 25 pl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Amener à 100 ml avec de l&#39;eau </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Concentration en sel élevée </td><td> 20 mM d&#39;HEPES, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td></td><td> 1,5 mM MgCl 2 </td><td> 1M MgCl 2 </td><td> 150 pi </td></tr><tr><td></td><td> 1,4 M de KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 48 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM d&#39;EDTA </td><td> EDTA 0,5 M </td><td> 40 pl </td></tr><tr><td></td><td> 25% de glycérol </td><td> Glycérol </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM de PMSF </td><td> 200 mM de PMSF </td><td> 100 pi </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM de DTT </td><td> 2M TNT </td><td> 25 pl </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Amener à 100 ml avec de l&#39;eau </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dialyse </td><td> 20 mM d&#39;HEPES, pH 7,9 </td><td> HEPES 1M, pH 7,9 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM de KCl </td><td> 3M KCl </td><td> 16.625 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM d&#39;EDTA </td><td> EDTA 0,5 M </td><td> 200 pi </td></tr><tr><td></td><td> Glycérol 20% </td><td> Glycérol </td><td> 100 ml </td></tr><tr><td></td><td> 0,2 mM de PMSF </td><td> 200 mM de PMSF </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td></td><td> 0,5 mM de DTT </td><td> 2M TNT </td><td> 125 pi </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Amener à 500 ml avec de l&#39;eau </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Solutions pour la préparation extrait nucléaire.

small-scale nuclear extracts for functional assays of gene-expression machineries

Une grande partie des progrès réalisés dans l&#39;expression des gènes compréhension a été faite en utilisant des systèmes in vitro. Pour la plupart des études, des analyses fonctionnelles sont réalisées en utilisant des extraits qui sont préparés en vrac à partir de 10-50 litres ou plus de cellules cultivées en suspension. Toutefois, ces préparations à grande échelle ne se prêtent pas à tester rapidement les effets in vitro qui résultent d&#39;une variété de traitements cellulaires in vivo ou de conditions. Cet article journal vidéo montre un procédé de préparation fonctionnels petits extraits nucléaires, en utilisant des cellules HeLa comme un exemple. Cette méthode est réalisée à l&#39;aide aussi peu que trois plaques de 150 mm de cellules cultivées sous forme de monocouches adhérentes. Pour illustrer l&#39;efficacité des extraits à petite échelle, nous montrons qu&#39;elles sont aussi actifs que des extraits nucléaires en vrac pour couplés ARN polymérase II de transcription / épissage réactions. Pour démontrer l&#39;utilité du protocole extrait, nous montrons que l&#39;épissage est abolie dans les extraits préparés à partir de cellules HeLas traités avec le médicament inhibiteur de l&#39;épissage E7107. Le protocole à petite échelle devrait être d&#39;application générale à tout processus ou type de cellule qui peut être étudié in vitro en utilisant des extraits cellulaires. Il s&#39;agit notamment de cellules de patients qui ne sont disponibles en quantités limitées ou des cellules exposées à de nombreux agents tels que les médicaments, les agents endommageant l&#39;ADN, ARNi, ou transfection, qui nécessitent l&#39;utilisation de populations de cellules de petite taille. En outre, de petites quantités de cellules fraîchement cultivées sont pratiques et / ou nécessaire pour certaines applications.

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Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Un protocole pour la préparation de solides, des extraits HeLa nucléaires à petite échelle est décrite. Ce protocole est valable pour les essais qui exigent l&#39;utilisation de petites populations de cellules, telles que les cellules traitées avec des médicaments ou ARNi. La méthode devrait être applicable à une grande variété de tests d&#39;expression génique et d&#39;autres types cellulaires, y compris les cellules du patient.

Les petits extraits nucléaires pour les dosages fonctionnels de l&#39;expression génétique Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

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25.8K vues.  Harvard Medical School. Un protocole pour la préparation de solides, des extraits HeLa nucléaires à petite échelle est décrite. Ce protocole est valable pour les essais qui exigent l'utilisation de petites populations de cellules, telles que les cellules traitées avec des médicaments ou ARNi. La méthode devrait être applicable à une grande variété de tests d'expression génique et d'autres types cellulaires, y compris les cellules du patient.

Vidéo: Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

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Biologie

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d&#39;œufs de Xénope

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 2 of 3.

Infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: Partie 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord électrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Un allèle spécifique Assay expression du gène pour l&#39;épreuve la base fonctionnelle des associations génétiques

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...