1. Préparation et comptage des cellules Namalwa <ol><li> Éliminer les cellules du flacon de culture et centrifuger les cellules à granules. Retirer les cellules surnageant et remettre dans un volume connu de PBS. Les cellules utilisées dans ce protocole sont les cellules en suspension. Si vous utilisez des cellules adhérentes, vous devrez trypsiniser avant de recueillir. </li><li> Pour déterminer le nombre de cellules vivantes, aux taches une aliquote de la suspension cellulaire en mélangeant l&#39;1:1 avec une solution de 0,4% de bleu trypan et pipeter 10 ul du mélange sur une lame de comptage, puis insérer la lame dans la cellule TC10 automatisé compteur (Bio-Rad Laboratories, Inc.) </li><li> Le compteur de cellules TC10 sera autofocus pour assurer le résultat le plus précis, et puis procéder au comptage. Il détermine automatiquement la densité des cellules vivantes et cellules totales dans l&#39;échantillon. </li><li> Sélectionnez Afficher l&#39;image pour afficher les cellules sur la viewscreen. Ensuite, sélectionnez le calculateur de dilution pour le compteur de cellules TC10 calculer automatiquement la quantité de mélange de cellules qui seront nécessaires. </li><li> Cette expérience est d&#39;utiliser un total de trois siRNA: un siRNA contrôle et deux siRNA différents ciblant le gène STAT6, plus les contrôles non transfectées. Cela nécessite 3,6 ml à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules par ml. </li><li> Entrez la concentration désirée et des valeurs volume final de dilution dans le calculateur, et il calcule le volume de suspension cellulaire nécessaire basée sur le comptage de cellules vivantes pour cet échantillon. Sinon, effectuer le calcul manuellement. Puis transférer le volume requis de mélange de cellules pour ces expériences dans un nouveau tube. </li><li> Faites tourner les mélanges de cellules d&#39;un culot cellulaire et de supprimer tous les CPE. Remettre en suspension dans 3,6 ml de tampon de Gene Pulser électroporation (Bio-Rad Laboratories). Transfert 800 aliquotes dans des tubes contenant les siRNA approprié et mélanger délicatement. Les cellules sont maintenant prêts pour l&#39;électroporation. </li></ol> 2. Électroporation dans les cellules des plaques 96 puits <ol><li> La plaque de 96 puits électroporation permet les répétitions pour les quatre traitements à électroporées ensemble. </li><li> Transfert 150 pi de la suspension de cellules dans les puits appropriés d&#39;une plaque de 96 puits électroporation. </li><li> Insérer la plaque dans la chambre de la plaque MXcell électroporation et fermer le couvercle. </li><li> Électroporation en utilisant des paramètres optimisés pour la lignée cellulaire et le tampon utilisé. Ces cellules sont électroporées utilisant une vague de décroissance exponentielle avec réglages de l&#39;instrument de 250 V, 350 uF, et la résistance 1000 Ω. </li><li> Après électroporation est terminée, une pipette de haut en bas doucement dans chaque puits pour mélanger et ensuite transférer les cellules à une plaque de culture de tissus contenant préchauffé médias. Cellules Namalwa sont cultivées dans du RPMI (Life Technologies) supplémenté avec 7,5% de SVF et 1% de pyruvate. </li><li> Les échantillons de contrôle qui n&#39;ont pas été électroporées sont tirées de la suspension de cellules restantes et ajouté à des boîtes de culture de milieu de culture pré-chauffé à l&#39;identique pour les cellules par électroporation. </li><li> Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li><li> Après 24 h, un ensemble de cellules a été induite avec 10 concentration finale ng / ml d&#39;IL-4 recombinante (R &amp; D Systems). La deuxième série de cellules de contrôle ne reçoivent que des supports supplémentaires. Toutes les cellules sont incubées une supplémentaire de 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol> 3. Extrait et vérifier l&#39;ARN <ol><li> Après un total de 48 heures de croissance, de compter les cellules dans chaque puits, et le transfert une aliquote de chaque puits d&#39;un tube de micro pour l&#39;extraction de l&#39;ARN, et de geler une seconde aliquote d&#39;analyse western blot des protéines ou autres. </li><li> Centrifuger les échantillons pour culotter les cellules, puis retirez et jetez le surnageant de chaque tube. </li><li> Procéder à l&#39;extraction d&#39;ARN. Nous utilisons généralement l&#39;Aurum ARN total kit (Bio-Rad) selon le protocole inclus. </li><li> Lors de la surveillance inactivation génique médiée siARN il est particulièrement important de vérifier la qualité de l&#39;ARN, car l&#39;ARN dégradé va donner des résultats trompeurs. Le rapport n&#39;indique pas 260/280 intégrité de l&#39;ARN par conséquent, il est important d&#39;exécuter les échantillons sur un gel ou d&#39;un dispositif microfluidique pour confirmer l&#39;ARN ne sont pas dégradés. </li><li> Pour évaluer la qualité et la quantité en une seule étape, ces échantillons seront analysés en utilisant le système Experion électrophorèse automatisé (Bio-Rad). </li><li> Tout d&#39;abord, des échantillons de la chaleur. Puis, le premier, la charge, et le vortex de la puce Experion ARN. Insérer la puce dans la station d&#39;électrophorèse Experion et commencer courir. </li><li> Après la course est terminée, le logiciel affichera Experion entraîne automatiquement sous la forme d&#39;un électrophérogramme, tableau des résultats (qui affiche la concentration d&#39;ARN ribosomal rapport, et le nombre d&#39;ARN indicateur de qualité), et un gel virtuel (qui ressemble à un traditionnel ARN gel). Haute qualité totale échantillons d&#39;ARN ont en général une RQI de 8-10. </li&gt; </ol> 4. PCR en temps réel <ol><li> Après vérification de la qualité de l&#39;ARN, procéder à des réactions d&#39;ADNc. Cette expérience a utilisé le iScript une étape de RT-PCR mélange (Bio-Rad) pour combiner la synthèse d&#39;ADNc et PCR en temps réel dans une réaction. </li><li> Faites un mélange maître contenant tous les composants de la réaction autres que les matrices d&#39;ARN pour chaque ensemble d&#39;amorces, et distribuer ces dans la plaque PCR. </li><li> Après dilution de l&#39;ARN à une concentration uniforme, ajouter les échantillons d&#39;ARN dans les puits appropriés. Chaque réaction est mis en place en trois exemplaires. </li><li> Sceller la plaque, et placez-le dans la CFX384 système en temps réel de PCR (Bio-Rad). Sélectionnez le protocole approprié et commencer la course. </li><li> Une fois la course terminée, l&#39;expression des gènes est déterminé en comparant l&#39;expression génique du gène d&#39;intérêt normalisé à un gène de référence dans les cellules par électroporation avec le siRNA expérimentales pour la même normalisation des cellules électroporation avec un contrôle siARN. </li></ol> 5. Analyse des knockdown siARN <ol><li> L&#39;expression de CCL17 a été contrôlée à l&#39;aide quantitative PCR en temps réel pour enquêter sur le rôle de l&#39;activateur transcriptionnel STAT6 de l&#39;IL-4 par induction dépendante de CCL17. Pour cette expérience, GAPDH a été utilisé comme un gène de référence. Gènes de référence suppléant ou plusieurs gènes de référence peut être utilisé de la même manière. </li><li> Le logiciel Gestionnaire CFX automatiquement normalisées CCL17 expression à l&#39;expression du gène de référence à partir du même échantillon et automatiquement comparés aux valeurs normalisées résultant de contrôler les traitements en sélectionnant simplement la GAPDH comme «référence» et le traitement de contrôle (siRNA contrôle, sans induction de l&#39;IL-4) comme «contrôle» dans l&#39;expérience la fenêtre des paramètres du logiciel CFX gestionnaire. </li><li> Sans l&#39;IL-4 par induction, la transcription de CCL17 est resté à peu, les niveaux constitutifs comparable au traitement de contrôle. </li><li> Cellules induites par l&#39;IL-4 et en conservant une normale STAT6 voie (ie, le siRNA contrôle ou le contrôle des traitements non transfectées) a montré l&#39;induction 80-10 pli de CCL17 expression. </li><li> Les cellules induite par l&#39;IL-4, mais avec STAT6 expression inhibée par l&#39;introduction de siARN soit STAT6 montré une expression CCL17 seulement environ 2 fois plus élevé que les cellules non induits confirmant le rôle de STAT6 dans l&#39;IL-4 expression induite de CCL17. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Aperçu de la voie de signalisation de l&#39;IL-4. Une reliure) de l&#39;IL-4 à son récepteur entraîne la dimérisation et l&#39;activation de STAT6. Activé STAT6 translocation vers le noyau et active la transcription de ses gènes cibles, tels que CC17. B) Sans l&#39;IL-4 par induction, la transcription de CCL17 restera à peu, les niveaux constitutifs. C) Après siARN médiée taire du gène STAT6, le traitement par l&#39;IL4 devrait conduire à augmenter peu ou pas de CCL17 expression. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. L&#39;induction de CCL17 par IL4 mesurée par des conditions différentes par quantitative PCR en temps réel. A) Les échantillons cultivés sans IL-4 avait un faible niveau d&#39;expression constitutive indépendamment de l&#39;expression génique. B) Comme indiqué en vert et bleu, des échantillons de contrôle réagi normalement à un traitement par l&#39;IL-4, avec une induction de 80 à 10 fois de CCL17. Cependant, les cellules transfectées avec des siRNA ciblant STAT6, en rouge et rose, avaient diminué CCL17 expression en réponse à l&#39;IL-4, soutenant l&#39;idée que STAT6 joue un rôle dans l&#39;expression de l&#39;IL-4 induit de CCL17.

L&#39;auteur est employé par la société Bio-Rad Laboratories, qui produit des réactifs et des instruments utilisés dans cet article.

Cet article a montré comment électroporation dans un siRNA difficiles à transfecter une lignée cellulaire de suspension et la façon de suivre l&#39;expression des gènes dans ces cellules. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de garder les choses aussi cohérentes que possible dans tous les échantillons.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

L&#39;utilisation d&#39;inactivation génique siARN médiation continue à être un outil important dans les études d&#39;expression génique. Des études sont menées siARN non seulement d&#39;étudier les effets de la régulation négative des gènes uniques, mais aussi d&#39;interroger les voies de signalisation et d&#39;autres réseaux d&#39;interactions complexes. Ces analyses voie exigent à la fois l&#39;utilisation de modèles cellulaires pertinents et des méthodes qui causent moins de perturbations de la physiologie cellulaire. L&#39;électroporation est de plus en plus utilisé comme un moyen efficace d&#39;introduire siRNA et d&#39;autres acides nucléiques dans les difficiles à transfecter des lignées cellulaires et cellules primaires, sans modifier la voie de signalisation de l&#39;enquête. Il ya plusieurs étapes essentielles à une expérience réussie siARN, et il ya des façons de simplifier le travail tout en améliorant la qualité des données à plusieurs étapes expérimentales. Pour vous aider à démarrer votre projet de siRNA médiation inactivation génique, nous allons démontrer comment effectuer une étude complète de la voie collecte et le comptage des cellules avant l&#39;électroporation par transfection après l&#39;analyse PCR en temps réel l&#39;expression des gènes. L&#39;étude qui suit examine le rôle de l&#39;activateur transcriptionnel STAT6 de l&#39;IL-4 expression des gènes dépendant de CCL17 dans une ligne de lymphome de Burkitt (Namalwa). Les techniques démontrées sont utiles pour un large éventail de siARN basé sur des expériences sur les deux adhérentes et les cellules en suspension. Nous montrerons également comment rationaliser le comptage de cellules avec le compteur de cellules automatisé TC10, comment électroporation plusieurs échantillons simultanément en utilisant le système d&#39;électroporation MXcell, et comment évaluer simultanément la qualité et la quantité d&#39;ARN avec le système Experion électrophorèse automatisé.

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Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Cette procédure décrit un workflow rapide et facile à introduire dans les siARN difficiles à transfecter des lignées cellulaires et de suivre l&#39;expression génique par PCR en temps réel. L&#39;utilisation d&#39;un compteur de cellules automatisé, plaque électroporation multi-puits et la station d&#39;électrophorèse automatisé de fournir des résultats rapides et fiables, sans la nécessité pour la manipulation robotisée cher.

Aide d&#39;un compteur de cellules automatisé pour simplifier les études d&#39;expression génique: Knockdown siRNA de l&#39;IL-4 dans l&#39;expression des gènes dépendant cellules Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Recherche

Biologie

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Spinal Cord électrophysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilisation du système d&#39;électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robotique et d&#39;analyse d&#39;images dynamiques pour les études d&#39;expression génique dans les tissus végétaux

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

La reconstitution in vitro de l&#39;actif T. La télomérase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

Préparation de lignées cellulaires pour Knockdown conditionnelle de l&#39;expression génétique et évaluation des effets sacrifiés sur la mort cellulaire induite par E4orf4

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analyse de Global ARN de synthèse à la Cellule Plain suivante hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA contrôle pour la ubiquitine et les régulateurs du système ubiquitine-comme des voies biologiques dans des cellules de mammifères en culture

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...