This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Toutes les expériences décrites ici ont été approuvés par le conseil local pour l&#39;expérimentation animale de l&#39;Université Radboud de Nimègue, conformément aux lois et règlements (RU par DEC 2013-205) néerlandais. 1. Spots Gel matrice extracellulaire <ol><li> Effectuez les étapes suivantes un jour avant l&#39;isolement: <ol><li> Décongeler un gel de matrice extracellulaire aliquote (100 ul) à 4 ° C pendant au moins 1,5 h. Diluer au 1/10 dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco; avec 4,500 mg / L de glucose, 4 mM de L-glutamine et 110 mg / ml de pyruvate de sodium (DMEM). Conserver le gel de la matrice extracellulaire à 4 ° C en permanence. Remarque: Les changements de température brusques se traduira par revêtement inégal et la formation de cristaux. </li><li> Conserver la solution de gel de matrice extracellulaire dilué sur la glace pendant 15 min. </li><li> Pré-refroidir une micropipette de 20 ul pendant 10 min. </li><li> Mettez les diapositives de la chambre 8 puits dans une boîte de Pétri de 100 mm et de transférer le plat sur ​​une surface froide (par exemple une poche de congélation) pendant 10 min.</li><li> Utilisez la micropipette pré-refroidi à mettre une goutte de 10 ul gel de la matrice extracellulaire dans chaque puits. Gardez la boîte de Pétri sur la surface froide pendant au moins une autre 7 min (figure 1A). </li><li> Supprimer complètement le reste de gel de la matrice extracellulaire (figure 1B), et sécher les puits à 37 ° C pendant la nuit. </li></ol></li></ol> 2. Dissection de chef Muscles (masséters, digastriques et muscle élévateur du voile du palais) <ol><li> Avant de dissection, de préparer 50 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) additionné de 2% de pénicilline-streptomycine (P / S). Garder sur la glace. </li><li> Après l&#39;euthanasie d&#39;un jeune rat adulte (9 semaines) avec CO 2 / O 2, décapiter la tête et enlever la peau de la tête. Transférer la tête pour PBS glacé additionné de 2% P / S dans un tube de 50 ml. </li><li> Muscle masséter (dérivé du 1er arc branchial) <ol><li> Placez la tête avec un côté sur un tampon de silicone et fixer avec hypodermique needles (figure 2A). </li><li> Identifier la glande parotide et du nerf facial (figure 2A). Exposer l&#39;aponévrose recouvrant la glande. Couper le fascia et enlever la glande à l&#39;aide des ciseaux de dissection. Identifier le conduit auditif externe. Tracez le nerf facial du foramen stylomastoïdien et retirer délicatement les branches temporelles, zygomatiques, et buccale avec une lame scalpel n ° 15. </li><li> Libérez la tête superficielle du muscle masséter en enlevant le fascia. Identifier les têtes à la fois superficielles et profondes du muscle masséter. Trace la tête superficielle jusqu&#39;à son aponévrose épaisse tendineux inséré dans le processus zygomatique du maxillaire. </li><li> Séparer le tendon de son origine au processus zygomatique avec une pince droites. Couper avec une lame de bistouri n ° 15 ou des ciseaux de dissection et soigneusement vie, il (figure 2B). </li><li> Disséquer la tête superficielle du masséter jusqu&#39;à son insertion à l&#39;angle et la moitié inférieure de la til surface latérale du ramus de la mandibule avec une lame de scalpel n ° 15 (figure 2C). Maintenant, supprimer complètement le muscle. </li></ol></li><li> Ventre postérieur du muscle digastrique (dérivé de l&#39;arc 2 ème branchiale) <ol><li> Placez la tête dans une position couchée sur le pad de silicone et le fixer avec des aiguilles hypodermiques (figure 3A). </li><li> Retirez la graisse sous-cutanée recouvrant à la fois par voie sublinguale et de glandes sous-maxillaires. Ensuite, retirez la façade et les glandes avec des ciseaux de dissection superficielle. Exposer le muscle digastrique (antérieure et postérieure du ventre). </li><li> Maintenez le tendon antérieur du ventre postérieur avec une pince droites, couper, et disséquer avec soin jusqu&#39;à son origine dans la bulle tympanique (figure 3B). Faites la même chose sur le côté controlatéral. </li></ol></li><li> Muscle élévateur du voile du palais musculaire (dérivé de l&#39;arc branchial 4e) <ol><li> Après dissection du ventre postérieur du digastrique, Localiser le muscle stylohyoïdien, tirez latéralement, et retirez soigneusement (figure 4A). </li><li> Localisez le tendon du voile du palais du releveur qui insère à la bulle tympanique (figure 4A). Disséquer soigneusement et couper des deux côtés. </li><li> Cherchez la trachée et l&#39;œsophage qui passe derrière elle. Soulevez l&#39;œsophage, et exposer le pharynx, du larynx et le palais mou. </li><li> Localisez la zone du voile du palais où le palatini releveur du voile est inséré et le couper en vrac (figure 4B). Remarque: Directement après dissection, retirez soigneusement tendon et le tissu conjonctif de chaque muscle sous le microscope stéréo. Immerger rapidement tous les échantillons dans de l&#39;éthanol 70%, et les transférer sur PBS glacé complété 2% P / S dans un tube de 15 ml. </li></ol></li></ol> 3. Isolement des cellules satellites <ol><li> Effectuez les étapes suivantes de préparation pour SC isolement de 3 groupes de muscles: <ol><li>Préparer 7,5 ml de pronase à 0,1% dans du DMEM. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um. Préchauffer la solution à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pendant 10 minutes avant l&#39;isolement. </li><li> Préparer 35 ml de DMEM supplémenté avec 10% de sérum de cheval (HS) et de 1% P / S. En outre préchauffer à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Préparer 15 ml de milieu de culture constitué de DMEM complété avec 20% de sérum bovin fœtal (FBS), 10% de HS, 1% P / S et 1% d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet (CEE). Pré-chaude à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Pré-manteau six pipettes en plastique (10 ml) avec HS et sec pendant au moins 10 min avant utilisation. </li></ol></li><li> Dans la hotte de culture, transférer chaque muscle dans un puits d&#39;une plaque à 6 puits. En utilisant les ciseaux de dissection, couper le muscle en petits morceaux d&#39;environ 2 mm. Veillez à ne pas hacher le tissu trop. </li><li> Ajouter avec précaution 2,5 ml d&#39;une solution de pronase à 0,1% à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 60 min. Secouer doucement la plaque après 20, 40, et 60 min. Remarque: Le duratio exacten de l&#39;incubation dépend de facteurs tels que l&#39;âge et la souche des animaux. </li><li> Surveiller sous le microscope. Vérifiez les fragments de muscle et d&#39;arrêter la digestion enzymatique lorsque les faisceaux de fibres obtiennent une apparence desserré (figure 5). </li><li> Ajouter 2,5 ml de DMEM supplémenté avec 10% de HS et 1% P / S. Transférer dans un tube de 15 ml et on centrifuge les tubes à 400 xg pendant 5 min. Jeter le surnageant par décantation. </li><li> Ajouter 5 ml de DMEM supplémenté avec 10% de HS et 1% P / S. Pipeter la solution de haut en bas avec une pipette de 10 ml en matière plastique (trituration) pendant au moins 20 heures pour homogénéiser le tissu. </li><li> Centrifuger les tubes à 200 xg pendant 4 min. Récupérer le surnageant et le transférer dans un tube de 15 ml. </li><li> Ajouter 5 ml de DMEM supplémenté avec 10% de HS et 1% P / S. Pipette à nouveau avec une pipette en matière plastique de 10 ml jusqu&#39;à ce que les fragments de tissus traverse facilement la pipette. </li><li> Centrifuger les tubes à 200 x g pendant 4 minutes et recueillir le surnageant dans un tube de 15 ml. </li><li> Put un tamis cellulaire (40 um) sur un tube de 50 ml et transférer le surnageant contenant les cellules dissociées sur le filtre. Laver avec 1 ml de DMEM pour la récupération maximale des cellules. </li><li> Centrifuger les tubes à 1000 g pendant 10 min et jeter le surnageant avec une pipette. </li><li> Reprendre le culot dans 300 pi de milieu de culture et de compter les cellules dans un hémocytomètre. </li></ol> 4. différenciation des cellules satellites sur Spots Gel matrice extracellulaire <ol><li> Diluer la suspension cellulaire pour obtenir 1,5 x 10 3 cellules dans 10 ul de milieu de culture. </li><li> Fixez les couvercles des chambres diapositives avec du ruban adhésif et marquer les points avec un marqueur noir sur la face inférieure de la vitre de l&#39;objet. </li><li> Avec une micropipette, mettre une goutte de 10 pi de suspension cellulaire sur le point de gel de la matrice extracellulaire. Vérifiez sous le microscope de savoir si la baisse de la suspension cellulaire a été placé correctement sur place. Incuber pendant six heures à 37 ° C. </li><li> Prudently ajouter 400 pi de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 10% HS, 1% P / S et 1% CEE) et incuber pendant trois jours à 37 ° C. Remarque: À ce stade, SC fraîchement isolés sont soumis à un traumatisme massif (digestion enzymatique et la trituration dure) et ils ont besoin de récupérer. Ne pas déranger les cellules au cours des trois premiers jours 37. Ensuite, le milieu de culture peut être modifié en fonction du type d&#39;expérience. Les taches de gel de la matrice extracellulaire peuvent être ensemencées avec une densité de cellules élevée (1.5 à 2.5 x 10 3/20 ul) pour l&#39;analyse de la différenciation. Le milieu de culture (DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 10% de HS, 1% P / S et 1% d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet) peut être remplacé tous les trois jours. </li><li> Sinon, si l&#39;expansion et le passage est souhaité suivre les étapes suivantes: <ol><li> Décongeler un gel de matrice extracellulaire aliquote (500 ul) à 4 ° C pendant au moins 1,5 h. Diluer à 1:10 dans DMEM et suivez les recommandations au point 1.1.1. </li><li> Pré-refroidir d&#39;une pipette de 10 ml pendant 10 min à 4 et# 176; C. </li><li> Transfert trois flacons T75 sur une surface froide (par exemple une poche de congélation) pendant 10 min. </li><li> Utilisez la pipette pré-réfrigérés à mettre 1 ml de gel de la matrice extracellulaire dans chaque flacon. Vérifier que la surface est complètement recouverte. Gardez les flacons sur la surface froide pendant au moins une autre 7 min (figure 1A). </li><li> Complètement enlever le gel de la matrice extracellulaire restant avec un pipette de 10 ml, et sécher les puits à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Après le dépouillement, remettre en suspension les Centres fraîchement isolées dans 10 ml de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 10% de HS, 1% P / S et 1% d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet) et des semences dans des fioles pré-revêtu T75. </li><li> Après trois jours, de changer le milieu (et tous les trois jours) jusqu&#39;à 80% de confluence est atteinte. Pour les passages, laver les flacons T75 à trois reprises avec du PBS. Ensuite, ajoutez 1 ml 0,25% solution de trypsine et incuber pendant trois minutes à 37 ° C. Remettre en suspension dans 9 ml de milieu de culture (DMEM supplémenté avec 20% de FBS, 10% de HS, 1% P / Set 1% d&#39;extrait d&#39;embryon de poulet) et centrifuger à 200 g pendant 5 min. Jeter le surnageant. Après le dépouillement, remettre en suspension 1 x 10 6 cellules dans 1000 ul de milieu de culture et de geler les cellules. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicting interests to disclose.

Centres de différents muscles de la tête branchiomeric ont été isolés à partir d&#39;un 9-semaine-vieux rat Wistar et cultivées directement sur la matrice extracellulaire des taches de gel sans expansion préalable et passages. Après isolement, les cellules ont été comptées et ensemencées à la même densité de cellules. Pour l&#39;isolement parallèle de trois muscles différents, cette méthode prend environ 4 heures. Pour éviter la contamination de la culture, une étape cruciale est le lavage rapide de l&#39;alcool à 70% après la dissection des muscles. Pendant SC isolement il est important de couper le tissu musculaire en petits morceaux (environ 2 mm), mais éviter trop de hachage que cela se traduira par un petit rendement cellulaire à cause de dommages cellulaires. En outre, la durée de la digestion enzymatique doit être contrôlée avec soin sous un microscope afin d&#39;éviter d&#39;autres dommages. Le but de la digestion est de dissocier les myofibres. Etant donné que plus de 90% des cellules expriment Pax7 isolées, aucune purification supplémentaire est requise (figures 6-8).Cela évite des étapes de purification supplémentaires dans d&#39;autres méthodes telles que le pré-placage sur plats non couchés 14,37,38, fractionnement sur ​​Percoll 39,40, une cellule ou fluorescent- ou tri magnétique 41,43. Par trituration il est essentiel d&#39;induire un cisaillement entre les fragments de tissus et l&#39;ouverture de l&#39;embout de pipette car cela permet la libération mécanique du SC. Si la trituration avec une pipette de 10 ml (intérieur du bout de diamètre: 1 mm) est difficile, 5 ml (intérieur pointe de diamètre: 2 mm) pipette peuvent être utilisés en premier. Alternativement, verre pipettes Pasteur peuvent être coupées au niveau du diamètre désiré et être utilisés. Cette méthode est simple, efficace et permet l&#39;isolement simultané de SC à partir de différents échantillons de muscles. Les plaques de culture pour les Centres peuvent également être enrobés avec de la gélatine ou du collagène, mais nos études précédentes montrent que le gel de la matrice extracellulaire est de loin préférable pour le maintien du potentiel myogénique de 38 collagène. Les taches de gel de matrice extracellulaires detaille millimétrique (10 pl / Ø 2 mm ou 20 pl / Ø 4 mm) permet l&#39;étude de la prolifération et la différenciation des CS avec un nombre limité de cellules. Pour le test de différenciation environ 8 à 20 fois moins de cellules sont nécessaires par rapport à une plaque de 24 puits (Ø 15,6 mm), et environ 80 à 200 fois moins par rapport à 35 mm boîtes de Petri (Ø 35 mm) 14,38. Étant donné que le gel de la matrice extracellulaire est coûteux, ce procédé est aussi plus rentable. En outre, les diapositives de la chambre peuvent être remplacés par couvercle en plastique glisse de réduire davantage les coûts. Pour la préparation du gel de la matrice extracellulaire voit séchage pendant une nuit des lames creuses est essentielle. Comme les taches extracellulaires de gel de la matrice sont transparents, il est nécessaire de marquer les taches sur le côté bas en utilisant un rétro-éclairage. Les diapositives de chambres sont fixées dans une boîte de Pétri pour la manipulation facile. L&#39;expansion de la culture cellulaire ne sont pas nécessaires, ce qui offre la possibilité d&#39;étudier la Centres de smaller muscles ou de petits échantillons de muscle. Alternativement, par exemple pour la PCR ou le muscle construit si plusieurs cellules sont nécessaires, les Centres fraîchement isolés peuvent d&#39;abord être développées dans des ballons T75 comme indiqué ci-dessus. SC isolé en utilisant ce protocole ne sont pas adaptés pour une purification supplémentaire avec la cytométrie de flux immédiatement après l&#39;isolement. La digestion à la pronase provoque une digestion poussée de la surface des antigènes 14. sérum de cheval et le sérum de veau fœtal qui sont utilisés pour la culture cellulaire doivent d&#39;abord être correctement caractérisés avant l&#39;isolement, comme des numéros de lots touchés différemment prolifération et la différenciation des myoblastes. Au cours des dernières années, il ya un intérêt croissant dans les muscles dérivés des arcs branchiaux et le mésoderme de la tête (par exemple les muscles extra-oculaires) 24. Il a été clairement démontré que la tête et des membres muscles possèdent des propriétés très différentes. Masséter de vieux animaux semble à nouveautain de leur capacité de régénération en comparaison avec les muscles des membres 25,26. Centres des muscles extra-oculaires possèdent une capacité de prolifération et la différenciation robuste comparable à SC de muscles de la tête, et de montrer un potentiel de prise de greffe musculaire plus importante que membre SC 24. La composition de la distribution des types de fibres et de la myosine varie selon les groupes de muscles et également entre les espèces. Muscles provenant du premier arc branchial chez les humains contiennent des fibres à la fois lents et rapides (sous-types IIA et IIX), les myosines néonatales et myosines typiques pour développer le muscle cardiaque. Chez les rongeurs ces muscles contiennent environ 95% IIA fibres rapides de la myosine et IIb) 44-46. Les études sur les muscles aviaire montrent que les conseils sectoriels de types de fibres musculaires différents varient en capacité de différenciation. Centres de fibres rapides ne se différencient en fibres musculaires rapides, tandis que SC de fibres lentes peuvent se différencier en deux types de fibres 47. En outre, le pourcentage de SC dans le muscle rapidedes fibres est plus faible que dans les fibres musculaires lentes 48,49. Cela indique que la distribution des types de fibre doit être prise en compte pour les études sur les muscles dans la région craniofaciale. Similaires aux muscles de fente palatine, la LVP chez les rongeurs contient presque exclusivement fibres rapides 50. Pour cette raison, Centres de la LVP sont adaptés pour les études pré-cliniques dans le domaine de la fente palatine. Ce protocole offre de nouvelles possibilités pour étudier SC issus de muscles de la tête branchiomeric ou d&#39;autres petits muscles ou des échantillons de muscles plus petits. Cela facilitera le développement de nouvelles thérapies pour améliorer la régénération des muscles de la région maxillo-faciale dans des conditions comme la fente palatine, mais aussi dans d&#39;autres conditions qui affectent les petits muscles.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Environ 1: 500 à 1: 1 000 nouveau-nés présentent une fente impliquant la lèvre et / ou palatine (CLP); donc ceci est la malformation congénitale la plus fréquente chez l&#39;homme 1. Les muscles du palais mou sont essentiels pour le fonctionnement du palais mou pendant le discours, la déglutition et de succion. Si une fissure du palais mou est présent, ces muscles sont anormalement insérés dans l&#39;extrémité postérieure de l&#39;os palatin. Le palais mou monte et descend pendant le discours, empêchant l&#39;air de sortir par le nez. Les enfants ayant une fente dans le palais ne disposent pas de cette fonction de contrôle résultant d&#39;un phénomène connu comme la dysfonction vélopharyngée 2,3. Bien que les protocoles de traitement sont variables, la réparation chirurgicale du palais mou se déroule dans la petite enfance (6-36 mois) 4. Les muscles anormalement insérées du palais mou peuvent être corrigées chirurgicalement 5-7, cependant, la dysfonction vélopharyngée persiste dans 7% à 30%des patients 2,3,8-10. La capacité des muscles squelettiques à régénérer par l&#39;action des cellules satellites (SCS) est bien établi 11,12. Sur blessure musculaire, SC sont activés et migrent vers le site de la lésion. Ils ont ensuite prolifèrent, se différencient, et fusionnent pour former de nouvelles fibres musculaires ou réparation endommagé les 13. Centres de repos expriment le facteur de transcription Pax7 14,15, tandis que leur descendance, les myoblastes en prolifération, d&#39;exprimer en outre le facteur de détermination myogénique 1 (MyoD) 16. Myoblastes Différencier commencent à exprimer myogénine (MyoG) 17. La différenciation terminale des myoblastes est marquée par la formation de fibres musculaires, et l&#39;expression de protéines spécifiques du muscle tels que la myosine chaîne lourde (MyHC) 16,18. Récemment, plusieurs stratégies ont été utilisées dans la médecine régénérative pour améliorer la régénération musculaire des muscles des membres 19-23. Des études spécifiques surles muscles de la tête branchiomeric sont également importants, car il a été récemment démontré qu&#39;ils diffèrent des autres muscles dans plusieurs aspects 24. Par contraste avec les muscles des membres, il a été suggéré que les muscles de la tête branchiomeric contiennent moins de Centres 25, régénèrent plus lent, et le tissu conjonctif plus fibreuse est formée après la lésion 26 En outre, la prolifération des Centres de muscles de la tête branchiomeric exprimer également d&#39;autres facteurs de transcription. Par exemple, Tcf21, un facteur de transcription pour la formation des muscles cranio-faciale est fortement exprimé dans la régénération des muscles de la tête mais à peine dans la régénération de muscles des membres 25. Les muscles du palais mou des patients CLP sont généralement plus petites et moins bien organisée rapport aux muscles palatins normales 27,28. Les fibres lentes et rapides sont tous deux présents dans les muscles du voile du palais, mais les fibres lentes sont plus abondantes. En revanche, les muscles fendus contiennent une proportion élevée de fibres rapides et également une alimentation capillaire réduitpar rapport aux muscles du voile du palais normales 29-31. Les fibres rapides sont plus vulnérables aux blessures contraction induite 31-33. L&#39;alimentation capillaire pauvres d&#39;accompagnement peut également favoriser la fibrose 34,35. Tous ces aspects peuvent contribuer à la mauvaise régénération des muscles du voile du palais après la fermeture chirurgicale fente 36. Dans cette perspective, un protocole pour l&#39;isolement et la caractérisation de branchiomeric tête musculaire SC est crucial. Cela donne la possibilité d&#39;étudier la biologie des muscles SC tête branchiomeric. En outre, de nouvelles thérapies basées sur l&#39;ingénierie tissulaire peuvent être développés pour favoriser la régénération musculaire après la chirurgie dans le CLP et d&#39;autres conditions compromettant la région craniofaciale. En général, les Centres peuvent être obtenus après dissociation du tissu musculaire 14. Mincing, digestion enzymatique, et la trituration sont généralement tenus de libérer SC de leur niche. SC peut être purifié par pré-placage non revêtues sur des boîtes 14,37,38, fractionation sur Percoll 39,40, une cellule ou fluorescent- ou tri magnétique 41-43. Ici, nous présentons un nouveau protocole économique et rapide pour l&#39;isolement des cellules satellites des muscles de la tête branchiomeric de jeunes rats adultes. Ce protocole est basé sur un manuscrit précédent 14 et spécifiquement adaptée pour de petits échantillons de tissu. L&#39;isolement des Centres de muscles représentatifs provenant de la 1 ère, 2 ème et 4 ème arcs branchiaux sont décrits. Après isolement, un faible nombre de cellules satellites sont mises en culture sur des taches de gel extracellulaires de matrice de taille millimétrique pour étudier leur différenciation. Cette approche évite la nécessité pour l&#39;expansion et passages de SC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle 25G 0,5x25m</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BC154R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps straight</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BD330R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol 70%</td>
			<td>Denteck</td>
			<td>2,010,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox Slide, 8 Chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#181;L FT20</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Phenol-Red Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>53702</td>
			<td>10KU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3600511</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2850145</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

En utilisant ce protocole, le muscle masséter (d&#39;un côté) donne 0,8-1 x 10 6 cellules, le muscle digastrique (ventre postérieur) donne 1,5-2 x 10 5 cellules, et releveur veli rendements palatini musculaires 1-1,5 x 10 5 cellules. les rendements cellulaires dépendent du type de muscle, la souche, et l&#39;âge de l&#39;animal. A titre de comparaison entre les trois groupes de muscles, Centres fraîchement isolées ont été ensemencées à la même densité de cellules (1,5 x 10 3/10 pi). Directement après isolement, plus de 90% des cellules expriment Pax7 fraîchement isolées (figure 6). Le jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre Pax7, MyoD, MyoG MyHC et immunocoloration. Cinq champs arbitraires ont été comptés par la culture en utilisant un objectif 20X. Au jour 4 Pax 7 et Myo D est exprimée dans tous les groupes musculaires (figures 6 et 7 et 8), cependant la descendance de SatCs du masséter et les muscles commencent digastriques expreschanter myogénine plus tôt que le muscle élévateur du voile du palais musculaire (Figure 9). Au jour 10, l&#39;expression de MyoG est fortement réduite dans tous les groupes (Figure 9). Quelques jours après le semis sur les extracellulaires taches de gel de la matrice, les cellules proliférantes commencent à fusionner et former des myotubes multi-nucléées, qui expriment la chaîne lourde de la myosine. Les petites myotubes sont clairement visibles à 7 jours (Figure 10). Au jour 10, des contractions des myotubes peut être observée (vidéo 1). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> Figure 1:. Taches de gel de matrice extracellulaire dans un coulisseau de chambre (A) pour une manipulation facile, placer le coulisseau de chambre 8 puits dans une boîte de Petri de 100 mm. Pipet 10 pi gel de la matrice extracellulaire dans chaque chambre et le mettre sur une surface froide (7 min). (B) Chambre diapositive après l&#39;excédent de la matrice extracellulaire gel est enlevé. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> Figure 2:. Dissection du muscle masséter (A) Chef de l&#39;animal dans une vue latérale. Ear (E), de la glande parotide (P) et le nerf facial (VII). (B) tendineuse aponévrose (Te) de la tête superficielle du muscle masséter (Ms) et muscle temporal (T). Séparer le tendon de son insertion avec une pince. (C) disséquer soigneusement le muscle jusqu&#39;à son insertion au ramus de la mandibule. E: oreille, P: glande parotide, VII: nerf facial, T: muscle temporal, Mme: tête superficielle du muscle masséter, Te: tendon, Mp: profonde tête du muscle masséter. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> Figure 3: Dissection du ventre postérieur du digastrique (.A) Chef de l&#39;animal en position couchée. Localisez la glande sous-maxillaire (Sg), masséter (M), nerf facial (VII) et le muscle sterno (SCM). Retirez la glande sous-maxillaire. (B) Localisez la partie antérieure du muscle digastrique (AD) et le ventre postérieur (PD). Avec une pince droite, prendre le tendon antérieur du ventre postérieur, couper et disséquer avec soin jusqu&#39;à son origine dans la bulle tympanique (ty). E: oreille, Sg: glande sous-maxillaire, VII: nerf facial, M: masséter, SMC: muscle sterno, AD: antérieure ventre digastrique, PD: postérieure ventre digastrique, Ty: bulle tympanique. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> Figure 4:. Dissection du muscle releveur de Veli palatini (A) Vue générale après dissection du muscle digastrique (ventre postérieur). Muscle stylohyoïdien (St) et tendon du muscle releveurvoile du palais peut être localisée. Notez la trachée (T) et de l&#39;œsophage (Es) passant derrière elle. (B) Après avoir soulevé la trachée et l&#39;oesophage du pharynx (P) est exposé. L&#39;insertion de la palatini releveur du voile dans le voile du palais est maintenant visible. La flèche indique le palais mou disséqué avec les Palatini muscles élévateurs de Veli sur les deux côtés. E: oreille, St: muscle stylohyoïdien, VII: nerf facial, M: masséter, AD: antérieure ventre digastrique, PD: postérieure ventre digastrique, T: trachée, Es: oesophage, P: pharynx, * muscle élévateur du voile du palais musculaire . <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> Figure 5: Aspect du tissu musculaire (A) et avant (B) après digestion enzymatique avec de la pronase. Notez que les faisceaux musculaires semblent être desserrée après la digestion enzymatique. Figure 6: Pax 7 immunocoloration Centres fraîchement isolées, appliqués à un gel de matrice extracellulaire, à la fin de l&#39;isolement (environ 6 heures après digestion de tissu initial).. Cinq domaines arbitraires ont été comptées en utilisant un objectif 10X avec une moyenne de 210 cellules par champ. Environ 90% des cellules sont Pax 7 positive. DAPI: bleu, Pax7: rouge. La barre d&#39;échelle, 100 um. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> Figure 7:. Pax 7, MyoD immunocoloration jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre Pax7, MyoD et immunocoloration. (A - C) et (D - F) photomicrographies représentatives de la journée 4 et 7 cultures du muscle masséter. (G et H </strong&gt;) Le nombre de Pax7 et MyoD + + noyaux par champ microscopique a été comptée et exprimée en pourcentage du nombre total de noyaux (DAPI). DAPI: bleu, Pax7: rouge, et MyoD: vert. bar des balances 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> Figure 8:. Répartition des Pax7 ± / MyoD ± dans des cultures de cellules mononucléées dans les cultures du masséter, digastrique et releveur veli muscle palatine (A - C) Jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre Pax7, et MyoD immunocoloration. Le nombre total de cellules est basé sur le nombre total de noyaux (DAPI). (D) de quantification de données de Pax7 ± / ± MyoD cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> Figure 9:. Immunocoloration Myogenin jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre Myogenin. (A - D) photomicrographies représentatives de la journée 4 et 7 cultures du releveur du voile palatin musculaire. (E) Le nombre de noyaux MyoG + par champ microscopique a été comptée et exprimée en pourcentage du nombre total de noyaux (DAPI). Quantification (F) de données de cellules MyoG +. DAPI: bleu, Myogenin: vert. bar des balances 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figur</a>e. <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> Figure 10:. Myosine chaîne lourde immunocoloration Jour 4, 7 et 10 cultures ont été colorées avec des anticorps contre la myosine chaîne lourde (MyHC). Photomicrographies représentatives de la journée 4, 7 et 10 cultures du digastrique (DIG) musculaire. Au jour 7, petites myotubes sont présents tout au jour 10 myotubes longues et bien organisés sont évidents. bar des balances 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Vidéo 1:.. Myotubes secousses exemples de deux champs représentatifs avec myotubes secousses sont présentés pour la journée 10 cultures de muscle digastrique <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Ce protocole décrit l&#39;isolement de cellules satellites de muscles de la tête branchiomeric d&#39;un rat âgé de 9 semaines. Les muscles proviennent de différents arcs branchiaux. Par la suite, les cellules satellites sont cultivées sur une couche de tache de taille millimétrique pour étudier leur différenciation. Cette approche permet d&#39;éviter l&#39;expansion des passages et des cellules satellites.

L&#39;isolement et la caractérisation des cellules satellites de Muscles Rat chef Branchiomeric

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

isolation-characterization-satellite-cells-from-rat-head

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.8K vues.  Radboud University Medical Center.  Ce protocole décrit l'isolement de cellules satellites de muscles de la tête branchiomeric d'un rat âgé de 9 semaines. Les muscles proviennent de différents arcs branchiaux. Par la suite, les cellules satellites sont cultivées sur une couche de tache de taille millimétrique pour étudier leur différenciation. Cette approche permet d'éviter l'expansion des passages et des cellules satellites. 

Vidéo: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Recherche

Biologie du développement

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Isolement de neurones cellules souches / progénitrices de la région périventriculaire du Rat des adultes et de la moelle épinière humaine

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolation des Pericytes de Type I et de Type II des Muscles Squelets de la Souris

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in the elderly and end-stage renal disease (ESRD) patients, who commonly suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. At present, there are no medication therapies that can stop its progression. The mechanisms that underlie this pathological process remain unclear. The aortic valve leaflet is composed of a thin layer of valve endothelial cells (VECs) on the outer surfaces of the aortic cusps, with valve interstitial cells (VICs) sandwiched between the VECs. The use of a rat model enables the in vitro study of ectopic calcification based on the in vivo physiopathological serum phosphate (Pi) and calcium (Ca) levels of patients who suffer from hyperphosphatemia and hypercalcemia. The described protocol details the isolation of a pure rat VIC population as shown by the expression of VIC markers: alpha-smooth muscle actin (&#945;-SMA) vimentin and tissue growth factor beta (TGF&#946;) 1 and 2, and the absence of cluster of differentiation (CD) 31, a VEC marker. By expanding these VICs, biochemical, genetic, and imaging studies can be performed to study and unravel the key mediators underpinning CAVD.

This protocol describes the isolation, culture, and calcification of rat-derived valve interstitial cells, a highly physiological in vitro model of calcific aortic valve disease (CAVD). Exploitation of this rat model facilitates CAVD research in exploring the cell and molecular mechanisms that underlie this complex pathological process.

Isolement et caractérisation des primaires de Rat vanne cellules interstitielles : un nouveau modèle pour étudier la Calcification de la Valve aortique

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The isolation of these cells offers the possibility of studying their involvement in cardiac diseases, and, in addition, provides a useful primary cell model to investigate biological mechanisms.
Here, the method for the isolation of C-MSC from arrhythmogenic cardiomyopathy patients&#39; bioptic samples is described. The endomyocardial biopsy sampling is guided in the right ventricular areas adjacent to the scar visualized by electro-anatomical mapping. The digestion of the biopsies in collagenase and their plating on a plastic dish in culture medium to allow C-MSC growth is described. The isolated cells can be expanded in culture for several passages. To confirm their mesenchymal phenotype, the description of immuno-phenotypical characterization is provided. C-MSC are able to differentiate into several cell types like adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts: in the context of ACM, characterized by adipocyte deposits in patients&#39; hearts, the protocols for the adipogenic differentiation of C-MSC and the characterization of lipid droplet accumulation are described.

In this article, a method to isolate cardiac mesenchymal stromal cells from endomyocardial bioptic samples of arrhythmogenic cardiomyopathy patients is provided. Their characterization and the protocol to boost their adipogenic differentiation are described.

Isolement et caractérisation de cardiaques cellules stromales mésenchymateuses d’endomyocardique Bioptic échantillons de Patients de la cardiomyopathie arythmogène

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Isolement et caractérisation des humains provenant du cordon ombilical cellules souches mésenchymateuses de prématurés et les nouveau-nés à terme

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...