Les auteurs tiennent à exprimer un grand merci à MM. Josep Planas et Juan Castillo pour leur expertise professionnelle dans le développement et l&#39;application de ce protocole de culture de petits poissons et d&#39;amphibiens. Merci également aux innombrables personnes qui ont inlassablement assisté à la dissection et la dissociation du tissu musculaire de nombreux poissons (à la fois en espèces et nombre), y compris Matthew charge, Delci Christensen, Zachary Fowler, Brooke Franzen, Nathan Froehlich, Kira Marshall, Ben Meyer, Ethan Remily, et Sinibaldo Romero. Ce travail a été soutenu par l&#39;Université de l&#39;Alabama à Birmingham Département de fonds de démarrage biologie, Centre pour la recherche de la protéase NIH Grant # 2P20 RR015566, NIH Grant NIAMS # R03AR055350, et NDSU Advance AVANT NSF Grant # DRH-0811239 de PRB. Appui a été fourni par l&#39;UAB nutrition obésité Research Center attribution # P30DK056336, NIH NIDDK. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairementreprésenter les points de vue officiels de la NIH.

Déclaration éthique: Tout l&#39;expérimentation sur les animaux vertébrés décrites ici a été approuvée à l&#39;avance par le Comité institutionnel de protection et d&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université de l&#39;Alabama à Birmingham et est conforme aux lignes directrices établies par le Bureau de la protection des animaux de laboratoire, National Institutes of Health des États-Unis ministère de la Santé et des Services sociaux. 1. Préparation de la Culture <ol><li> Préparer le support de base comme suit: 9 mM NaHCO 3 (1,51 g par 2 L), HEPES 20 mM (9,53 g par 2 L) dans du DMEM (13,48 g / L; 26,96 g pour 2 litres). <ol><li> Déterminer le pH et ajuster à 7,40 avec HCl ou NaOH. </li><li> Déterminer l&#39;osmolalité et s&#39;adapter à ~ 300 mOsm avec NaCl (si nécessaire). </li><li> Stériliser par filtration à l&#39;aide (2) systèmes de stérilisation 1 L de vide et conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière jusqu&#39;à 2-3 mois. REMARQUE: Voir les tableaux 1 et 2 pour le réactif complet, les outils, la consomables, et matériel informatique. </li></ol></li><li> Préparer-L-lysine-traitée poly plaques en dissolvant 5 mg de γ-irradiation de poly-L-lysine (&gt; 300 000 mw) dans 50 ml d&#39;eau ultrapure stérile. Mélanger doucement par inversion pendant 10 min à température ambiante, assurer la dissolution complète de polymères de lysine. </li><li> Introduire à la pipette la quantité nécessaire de la poly-L-lysine solution dans chaque puits, en fonction du type de plaque (tableau 3). Laisser les plaques se tenir dans hotte à flux laminaire pendant 5 minutes. </li><li> Ensuite, retirez la poly-L-lysine solution et laver deux fois avec de l&#39;eau stérile. Laisser sécher à l&#39;air plaques en hotte à flux laminaire pendant 20 minutes. </li><li> Obtenir 1 mg de laminine (origine de Engelbreth-Holm-Swarm) et les dissoudre dans 50 ml de milieu de base à une concentration finale de 20 pg / ml. Appliquer la solution de laminine à des plaques de culture de cellules de poly-L-lysine-traitée à 2 ug / cm 2. (Voir le tableau 3 pour différentes tailles de plaques) </li><li> Mélanger doucement la solution pour assurer full bien la couverture. Sceller les plaques avec du ruban de laboratoire et le placer dans l&#39;incubateur pendant 24 heures. L&#39;incubateur doit être réglé à la température appropriée pour les espèces utilisées (voir tableau 7), et pas de gaz supplémentaires doivent être ajoutés à l&#39;incubateur. REMARQUE: laminine doit être autorisé à adhérer à plaques pendant 24 heures avant l&#39;ensemencement des cellules. Ne pas le faire risque d&#39;amoindrir à aucune adhérence cellulaire. </li><li> Préparez le support tel que décrit dans le tableau 4. Milieu complet est meilleur préparé la journée d&#39;utilisation. </li><li> En préparation pour l&#39;isolement du tissu, et assembler les éléments suivants autoclave: 300 à 500 ml gobelet (s); plats de Pétri en verre; gère scalpel; forceps (fin et grossier); ciseaux de dissection; et plusieurs feuilles de papier autoclave hydrofuge. NOTE: Pour chaque personne qui assiste le processus de dissection, (2) poignées de scalpel, (1) pince (de type selon les préférences personnelles), (1) des ciseaux de dissection, et (5-10) feuilles de papier autoclave hydrofuge sontsuffisante. </li><li> En plus des articles ci-dessus autoclave, assembler 70% d&#39;éthanol, un équilibre de poids, des tubes coniques de 50 ml de stériles (nombre dépend de la taille de la culture), et de la glace. </li></ol> 2. Dissection des tissus <ol><li> Avant de commencer, assurez-vous que d&#39;un stock suffisant de poissons est disponible. NOTE: L&#39;âge du poisson à être utilisé est d&#39;une importance critique. Alors que le poisson de deux espèces différentes peuvent être de poids similaires, un jeune poisson d&#39;une espèce possédera plus que PPM un poisson plus d&#39;une autre espèce. En règle générale, les jeunes poissons, en particulier lorsque vous travaillez avec les salmonidés, sont les meilleurs. Pour danionins, poissons aussi vieux qu&#39;un an peut être utilisé de façon optimale, tandis que les salmonidés de l&#39;âge de 4-6 mois ou moins (jusqu&#39;à 15 g) sont optimales. </li><li> Pour chaque 5 g de tissu d&#39;être disséqué, aliquote de 25 ml de milieu d&#39;isolement dans un tube conique de 50 ml stérile. </li><li> Peser, la masse d&#39;enregistrement, et le numéro du tube (s). Placer les tubes sur la glace. </li><li> Euthanasier 2-3 poissonsà la fois par immersion dans de&gt; 300 mg / L de bicarbonate de sodium tamponnée au méthanesulfonate de tricaïne. Permettre le mouvement des opercules de cesser de&gt; 5 minutes puis plonger les poissons dans 70% d&#39;éthanol (contenues dans les béchers stériles) pendant 30 secondes. </li><li> Retirer le poisson de 70% d&#39;éthanol et placer sur papier autoclave hydrofuge. Directement derrière l&#39;opercule, utiliser un scalpel pour faire une superficielle, incision peu profonde. Enlevez les écailles et la peau en le saisissant par la peau à l&#39;incision précitée et tirez vers la queue de poisson. </li><li> Après le retrait de la peau, l&#39;excision de la epaxial, rapide glycolytique musculaire &quot;blanc&quot; du poisson des deux côtés (en évitant le muscle lent oxydatif &quot;rouge&quot; situé près de la ligne latérale) et le lieu dans un milieu d&#39;isolement. Jeter le reste du poisson tel que requis par l&#39;institution. Cellules S&#39;il est tout à fait possible de PPM de culture provenant de muscle rouge, presque chaque publication à l&#39;aide téléostéens PPM a utilisés isolés du m epaxial: NOTEyotome. </li><li> Répéter les étapes 02.04 à 02.06 jusqu&#39;à ce qu&#39;une quantité suffisante de muscle est obtenu. Au cours de la dissection, en sorte que le tissu musculaire groupé reste sur de la glace pour maintenir la viabilité des cellules. </li></ol> 3. Dissociation mécanique <ol><li> Verser un tube de 25 ml / 5 g de tissu de muscle dans une boîte de Pétri en verre. L&#39;utilisation de deux poignées avec scalpel attaché # 10 lames de bistouri, mince tissu pour obtenir une consistance de pâte ou purée. Une motion &quot;va-et-vient&quot; de tirer les lames de bistouri passé de l&#39;autre qui fonctionne le mieux. NOTE: Bien que homogénéisateurs de tissus peut sembler approprié, le nombre de cellules viables sera considérablement réduite, si elle n&#39;est pas abolie. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un 25 ml pipette sérologique et pipette sérologique, enlever le tissu en suspension et remplacer dans le tube d&#39;origine conique. </li><li> Répétez les étapes 3.1 à 3.2 jusqu&#39;à ce que tous les tissus dans tous les tubes a été dissocié mécaniquement. </li><li> tissu Centrifuger pendant 5 minutes à 300 x g et à 10 ° C. </li><li> Follen raison centrifugation, éliminer les 25 ml de surnageant de médias avec une pipette 25 ml sérologique, aspirateur à vide, ou par décantation attention. </li><li> Ajouter 25 ml de milieu de lavage à chaque tube de tissu, remettre en suspension et recentrifuger comme ci-dessus. </li><li> Laver deux fois avec du milieu de lavage, en éliminant le surnageant à chaque fois. </li></ol> 4. Dissociation enzymatique <ol><li> Lors de l&#39;étape 3.4, de préparer une solution de collagénase en combinant 0,22 g de la collagénase de type IV et de 44 ml de milieu de base (ou une quantité suffisante à 0,11 g/0.22 ml). </li><li> Mélanger dans un bécher pendant 10-15 minutes à 4 ° C. Stériliser par filtration avec une seringue de 50 ml et un filtre à seringue de 0,45 um. NOTE: Plus d&#39;un filtre à seringue peut être nécessaire, en fonction de la préparation de collagénase. Collagénase obtenue auprès de fournisseurs autres que Worthington Biochemical soulève plus de difficultés lors de la filtration. Collagénase est utilisée pour dissocier les liaisons peptidiques du collagène qui constituent l&#39;endomysium. Cedigestion supprimer cette barrière protectrice des fibres musculaires. </li><li> Pour chaque gramme de tissu musculaire, le tissu remettre en suspension dans une solution de collagénase à 0,2%. Pour 5 g de tissu de muscle, ajouter 10 ml de solution de collagénase et de 15 ml de milieu de base. </li><li> Ajouter 10 ul de PSF par ml de milieu de solution de collagénase / base (par exemple, 250 ul à 25 ml). Assurez-vous que le tissu est bien suspendu, comme cela va affecter l&#39;efficacité de la digestion enzymatique. </li><li> Incuber le tissu musculaire dans la collagénase pendant 60 minutes à 18 ° C avec agitation légère. Selon le degré de dissociation et des espèces mécanique, digestion à la collagénase peut être porté à 90 minutes, bien que cela peut affecter la viabilité des cellules. </li><li> Après tubes digestion à la collagénase, centrifugeuse coniques à 300 g pendant 5 minutes à 12 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans un tissu de 25 ml de milieu de lavage. </li><li> Recentrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à 126; C. Répéter l&#39;opération avec fluide de lavage une seconde fois. </li><li> Après lavage deux fois le tissu, remettre en suspension les tissus musculaires dans 25 ml de milieu de lavage et trituration avec une pipette sérologique de 10 ml jusqu&#39;à ce que le tissu / homogénat milieu passe dans et hors de la pipette avec une relative facilité. 5-10 triturations est généralement suffisant. <ol><li> Répéter l&#39;opération avec une pipette sérologique de 5 ml et ensuite une canule métallique de calibre 16 fixée à une seringue. </li></ol></li><li> Tubes centrifugeuse coniques à 300 g pendant 5 minutes à 12 ° C. Décanter le surnageant. </li><li> Au cours de la centrifugation 5 minutes au-dessus, de préparer la solution de trypsine de digestion en combinant 0,25 g de trypsine avec 5 ml de milieu de base. </li><li> On agite à 4 ° C pendant 10 à 15 minutes et filtrer stériliser avec une seringue de 20 ml et filtre de 0,45 um de seringue. </li><li> Récupérer des tubes coniques et ajouter 100 ul de solution de trypsine et 4,9 ml de milieu de dissociation pour chaque 1 g de tissu musculaire à chaque tube. Pour EXAmple, ajouter 500 ul de solution de trypsine et de 24,5 ml de milieu de dissociation de 5 g de tissu de muscle. REMARQUE: La trypsine est une serine protease qui séparera les cellules précurseurs myogéniques de la lame basale. </li><li> tissu Remettre en suspension dans la trypsine / dissociation milieu bien. Incuber pendant 20 minutes à 18 ° C. </li><li> Après la première incubation de la trypsine, des tubes coniques à centrifuger à 300 g pendant 1 min à 12 ° C. </li><li> Neutraliser la trypsine en combinant les surnageants avec le milieu d&#39;isolement, à une concentration de 1 volume de surnageant à 4 volumes de milieu d&#39;isolement. Conserver à 4 ° C pendant la seconde digestion par la trypsine. </li><li> Pour le culot restant de tissu, répétez les étapes 4.12 à 4.15, combinant le surnageant après l&#39;étape 4.15 avec le milieu surnageant / d&#39;isolement de la première digestion de la trypsine. </li><li> Alternative: Les collagénase et la trypsine digestions peuvent être combinés pour maximiser les rendements cellulaires. &lt;ol&gt; <li> Pour ce faire, triturer la collagénase digère l&#39;aide d&#39;une canule métallique (6 en longueur et en calibre 16 qui fonctionne le mieux) fixée à une seringue de 20 ml jusqu&#39;à ce que l&#39;homogénat passe facilement à travers la canule. </li><li> Pour l&#39;homogénat, ajouter 500 ul de solution de trypsine (préparé à l&#39;étape 4.10) et incuber à 18 ° C pendant 20 minutes. </li><li> Après les tubes d&#39;incubation, centrifuger coniques à 300 g pendant 1 minute à 12 ° C. </li><li> Neutraliser la trypsine en combinant les surnageants avec le milieu d&#39;isolement, à une concentration de 1 volume de surnageant à 4 volumes de milieu d&#39;isolement. </li><li> Conserver à 4 ° C pendant la seconde digestion par la trypsine. </li><li> Passez à l&#39;étape 4.18, avec le protocole standard. </li></ol></li><li> Distribuer le surnageant / isolement final mélange moyen dans 50 ml tubes et centrifuger coniques à 300 g pendant 10 minutes à 12 ° C. </li><li> Retirer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber la cellulepastilles. Introduire à la pipette 2 ml de milieu complet dans chaque tube, de dissolution de chaque culot cellulaire. </li><li> Combiner les cellules en suspension dans un milieu complet dans un Tube de 50 ml conique. </li><li> Rincer chaque tube avec 1 ml de milieu complet, en combinant avec le pool de cellules remises en suspension précédemment. </li><li> Triturer avec une canule métallique et la seringue 5-10 fois. </li><li> Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis de 100 um de la cellule, en rinçant avec du milieu complet. </li><li> On filtre la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 pm. </li><li> Ajouter suffisamment de milieu complet à 50 ml et centrifuger à 300 xg pendant 10 minutes à 15 ° C. </li></ol> 5. Comptage, de dilution, et l&#39;ensemencement des cellules <ol><li> Suite à la centrifugation finale à l&#39;étape 4.25, enlever le surnageant par décantation attention ou avec une pipette sérologique. Remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de milieu complet. </li><li> Avec des cellules complètement remises en suspension, retirez 20 pi; De la suspension cellulaire et le placer dans un tube de centrifugation de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 5 ul de colorant bleu Trypan et attendez 5 minutes. L&#39;utilisation d&#39;un hémocytomètre, déterminer le nombre de cellules viables. </li><li> Lors de la détermination, diluer les cellules à la concentration nécessaire. Teleost PPM sont les mieux ensemencées à 150.000-200.000 cellules par cm 2. Pour une stratégie en six et placage, la dilution de cellules à 1,5 x 10 6 à 2,0 x 10 6 par ml soutient la prolifération et la différenciation suffisante. </li><li> Récupérer les poly-L-lysine-traitée, des plaques revêtues de laminine et des cellules de semence. (Voir le tableau 5 pour les dilutions spécifiques à la plaque et les volumes de placage.) NOTE: Le tableau 6 illustre le nombre moyen de cellules isolées par gramme de tissu musculaire isolé à partir de diverses espèces de poissons téléostéens. Ciel (O. mykiss) présentent moins de PPM par gramme de tissu musculaire de faire le poisson-zèbre (D. rerio) et de ce fait exiger plus de poissons à isoler pour l&#39;ensemencement bon. </li><li> Sceller les plaques avec du ruban de laboratoire et le placer dans l&#39;incubateur de refroidissement à la température appropriée. PPM de toutes les espèces inscrites ici (sauf pour les souris) peuvent être incubées dans des conditions atmosphériques normales, sans dioxyde de carbone (CO 2) de la supplémentation. (Voir le tableau 7.) </li><li> Alternative: Certains laboratoires ont adopté un protocole qui appelle pour permettre PPM à adhérer à des substrats de culture pendant 40 minutes. <ol><li> Ensuite, rincer les plaques avec les médias de lavage pour enlever les cellules lâchement et non-adhérentes. Avertissement: Cette étape est très importante pour éviter l&#39;adhésion &quot;non spécifique&quot; d&#39;autres cellules (fibroblastes par exemple) pour les substrats de culture. </li><li> Ajouter le média complètes et les cellules de lieu dans l&#39;incubateur et de soins pour que détaillé ci-dessous. </li></ol></li></ol>

Il n&#39;y a rien à divulguer.

Le programme myogénique, quelle qu&#39;en soit les espèces examinées, peut être le plus facilement étudiée à travers un système in vitro. En effet, lors de l&#39;isolement, des cellules précurseurs myogéniques (PPM) chez les poissons ou les cellules myosatellite (MSC) chez les mammifères pénètrent facilement ce processus hautement régulé impliquant la prolifération, le retrait du cycle cellulaire et la différenciation terminale des myoblastes et la fusion de ces myoblastes en myotubes naissante...

Une bonne compréhension de la myogenèse mammifère a été obtenue par la récapitulation de ce processus dans les deux souris primaire (Mus musculus) cultures de myoblastes et la lignée cellulaire dérivée de la souris bien décrit, C2C12 5. Début dans les années 1950 6, ces cultures ont conduit à beaucoup de progrès dans la compréhension du programme murinemyogenic et, par extension, la myogenèse chez les autres vertébrés. En outre, les techniques myofiber d&#39;explants cellulaires unique ont augmenté sur la compréhension des interactions entre les cellules satellites et les fibres musculaires entourant 7-9. Cultures de cellules sont particulièrement attrayants pour les enquêtes de la myogenèse en raison de la courte période de précurseur de cellule différenciée 10, relative facilité de transfection pour ARNi 11-14, 15,16 transgénique et surexpression études 14,17,18, l&#39;expansion in vitro suivie d&#39;une greffe in vivo 18-20, et même échantillonarison de cellules précurseurs myogéniques et leurs agents de régulation entre des taxons 21,22. Bien que les différences dues à l&#39;environnement artificiel du système de culture ont été décrits 5,23, ces systèmes in vitro se sont révélés être indispensable à notre dissection du programme complexe qui régit la formation des multinucléées, myofibersfrom mononucléées différenciation terminale des cellules progénitrices prolifératives appelées myosatellite cellules (CSM) chez les mammifères. En dehors de la classe des mammifères, cependant, la conservation et / ou la divergence des mécanismes contrôlant la myogenèse sont mal comprises, en grande partie en raison de la difficulté de culture de cellules précurseurs myogéniques (PPM) et les myoblastes de divers taxons. En effet, les cultures de myoblastes primaires n&#39;ont été décrit dans trois oiseaux 24-26, un reptile 27, quelques amphibiens 28-30, et quelques poissons 1,3,4,31-33. Continue lignées cellulaires myogéniques de vertebrates autres que les rongeurs 34-36 sont encore plus rares, avec la seule ligne non mammifère myogénique cellule étant dérivé de la caille japonaise (Cortunix japonica), QM7 37. Malgré de nombreuses tentatives de immortalisation, une lignée de cellules myogéniques téléostéens reste insaisissable et un protocole pour la transfection efficace de ces cellules n&#39;a été publié cette année 15. Ainsi, des protocoles clairs et bien optimisés pour la culture PPM primaires et les myoblastes d&#39;une variété de vertébrés sont très nécessaires non seulement pour étendre notre connaissance de l&#39;évolution du programme myogénique, mais d&#39;utiliser la puissance de la physiologie comparée de faire des percées dans le traitement des maladies musculo-squelettiques et des troubles humains. Alors que la littérature contient de nombreux rapports de MPC / myoblastes isolement 38-49, il est fréquent que les auteurs décrivent les protocoles de ces isolements en bref, souvent incomplètes, les formats. En outre, les protocoles les plus instructifs pensINDIQ U EES ont été développés pour les souris 50-53, et certains d&#39;entre eux compter sur la sélection d&#39;anticorps 54,55 ou 56,57 transgènes de fluorescence, ce qui rend ces protocoles inutilisable ou espèces non-rongeurs intimes impraticables utilisés par les biologistes musculaires. Avec peu connu sur piscine, amphibiens et reptiles myogenèse, un protocole détaillé et complet, décrit avec l&#39;aide de l&#39;audiovisuel et à l&#39;efficacité démontrée dans les espèces apparentées de loin, serait plus utile sur le terrain. D&#39;abord décrite par Powell et ses collègues en 1989 58, le protocole suivant a été initialement développé pour isoler les PPM et les myoblastes de salmonidés (à savoir, la truite arc, Oncorhynchus mykiss, et le saumon de l&#39;Atlantique, Salmo salar) et des cyprinidés plus grands (c.-à-poisson rouge, Carassiusauratusauratus) . En 2000, Fauconneau et Paboeuf optimisés une culture primaire de myoblastes pour la truite arc 59, et ma minoroptimizationsde ce protocole utilisable dans plusieurs petits ménés du clade Danioninae (de poisson zèbre, Danio rerio, et danio géant, Devario aequipinnatus) 32 en raison des nombreux outils génétiques disponibles pour travailler le poisson zèbre et donc ses proches parents. poissons téléostéens sont des organismes intéressants pour l&#39;étude en raison de leur stratégie de croissance divergent (au moins dans la plupart des espèces). Grands salmonidés, comme la plupart des poissons, poussent pour une durée indéterminée, avec un potentiel de croissance sans entrave par une asymptote à l&#39;échéance, même dans les vieux 60-62 ans. Contrairement poisson zèbre, les grandes danionins comme le danio géant 63 et moustachus potentiels typiques de poissons téléostéens de croissance d&#39;affichage de danio, rendant leur juxtaposition directe une plate-forme idéale pour comprendre si le choix du destin cellulaire MPC joue un rôle dans l&#39;hyperplasie du muscle squelettique par rapport à l&#39;hypertrophie. De même, nous avons montré que ce protocole peut être utilisé avec la souris et l&#39;axolotl, avec un rendement de cellule relativement élevé et Viabindices ilité. Salamandres urodèles, comme l&#39;axolotl mexicain (Ambystomamexicanum), possèdent la capacité remarquable à régénérer les tissus, y compris les membres et la queue 64-66 entières. Cette caractéristique rend ces modèles amphibies intéressants de l&#39;atrophie du muscle squelettique et du vieillissement. Selon le protocole décrit ci-dessous, une approche similaire peut être effectuée comme cela a été fait dans de nombreuses espèces de poissons, fournissant un contexte comparatif encore plus large pour de telles études. Comme de nombreux biologistes vraiment apprécier comparatifs, les avancées les plus significatives en biologie fondamentale et translationnelle biomédecine peuvent être faites lorsque les données sont analysées dans le spectre le plus large (ici, l&#39;ensemble de la lignée des vertébrés).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1. Detailed Reagent Information</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Reagent</td>
			<td style="width:217px;">Company (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number (Preferred v. Alternate)</td>
			<td style="width:161px;">Quantity per Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">&#947;-irradiated poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)</td>
			<td>P5899 (ICN19454405)</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">DMEM (high glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (cellgro)</td>
			<td>MT-50-003-PB (D7777)</td>
			<td>2 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Laminin</td>
			<td>BD Biosciences (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>CB-40232 (L2020)</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP328-500 (S5761)</td>
			<td>1.51 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">HEPES (C8H18N2O4S)</td>
			<td>Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BP310-1 (H6147)</td>
			<td>9.53 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SV3007901 (A5955)</td>
			<td>17-20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>BW17-519Z (G1397)</td>
			<td>2-3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Donor Equine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007403 (H1270)</td>
			<td>75 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Fetal Bovine Sera</td>
			<td>Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>SH3007103 (F2442)</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Collagenase (Type IV)</td>
			<td>Worthington (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>LS004189 (C9891)</td>
			<td>0.44 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin (from Pancreas)</td>
			<td>MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)</td>
			<td>ICN15357125 (T5266)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2. Consumables, Tools and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="42" style="height:43px;width:239px;">Consumable</td>
			<td style="width:204px;">Tools</td>
			<td style="width:199px;">Equipment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;">Cell Culture Plates</td>
			<td>Forceps (Coarse)</td>
			<td>Serological Pipettor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Sterile 50 mL Conical Tubes</td>
			<td style="width:204px;">Forceps (Fine)</td>
			<td>pH Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Laboratory Tape</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Handles</td>
			<td>Chilling Incubator (Echotherm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">0.2 &#956;m Vacuum Sterilization Systems</td>
			<td style="width:204px;">Scalpel Blades (#10, #11)</td>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Water-repellant Autoclave Paper</td>
			<td style="width:204px;">Surgical Scissors</td>
			<td>Vacuum Manifold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;">Serological Pipettes</td>
			<td>Glass Petri Dishes</td>
			<td>Microosmolality Meter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="28" style="height:28px;width:239px;"></td>
			<td>12-16 G Cannulas with Luer Locks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:167px;">Plate Size</td>
			<td style="width:192px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:132px;">Poly-L-lysine*</td>
			<td style="width:145px;">Laminin**</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.6 mL</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>0.16</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="21" style="height:21px;width:167px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.06</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">*0.1 mg/mL concentration</td>
			<td colspan="2">** 0.020 mg/mL concentration</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:155px;">Isolation</td>
			<td style="width:127px;">Wash</td>
			<td style="width:127px;">Dissociation</td>
			<td>Complete</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">Base Medium</td>
			<td>419.25 mL</td>
			<td>395.40 mL</td>
			<td>297.00 mL</td>
			<td>178.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PSF*</td>
			<td>5.00 mL</td>
			<td>4.00 mL</td>
			<td>3.00 mL</td>
			<td>2.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Gentamicin Sulfate**</td>
			<td>0.75 mL</td>
			<td>0.60 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Donor Equine Serum</td>
			<td>75.00 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Fetal Bovine Serum***</td>
			<td style="width:155px;">-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20.00 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4" height="19" style="height:19px;width:660px;">* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="24" style="height:24px;width:75px;">Plate Size</td>
			<td style="width:103px;">cm^2 per Well</td>
			<td style="width:145px;">Dilution</td>
			<td style="width:111px;">Plating Volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;">6 well</td>
			<td>9.5</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">24 well</td>
			<td>1.9</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>250 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">48 well</td>
			<td>0.95</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>150 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td height="20" style="height:20px;width:75px;">96 well</td>
			<td>0.32</td>
			<td>1.5-2.0x10^6 cells/mL</td>
			<td>50-100 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 6. Average number of cells per g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Average # cells/g tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio rerio</td>
			<td colspan="2">6,400,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Danio dangila</td>
			<td colspan="2">1,783,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Devario aequipinnatus</td>
			<td colspan="2">1,797,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Oncorhynchus mykiss</td>
			<td colspan="2">66,800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 7. Recommended Incubation Temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;width:201px;">Species</td>
			<td colspan="2" style="width:273px;">Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;">Danio/ Devario spp.</td>
			<td colspan="2">26 - 28 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Oncorhynchus/Salmo spp.</td>
			<td colspan="2">10* - 18 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2" height="20" style="height:20px;width:201px;">Ambystoma mexicanum</td>
			<td colspan="2">18&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">* Lower temperatures support lower proliferation rates.</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary myogenic precursor cell/myoblast cultures from basal vertebrate lineages

En raison de la difficulté et le temps inhérente d&#39;étudier le programme myogénique in vivo, les systèmes de culture primaire dérivées des cellules souches adultes résidents du muscle squelettique, les cellules précurseurs myogéniques (PPM), se sont révélés indispensables à notre compréhension du développement du muscle squelettique de mammifère et croissance. En particulier chez les taxons de base de vertébrés, cependant, les données sont limitées décrivant les mécanismes moléculaires qui contrôlent l&#39;auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation des PPM. D&#39;intérêt particulier sont les mécanismes potentiels qui sous-tendent la capacité des vertébrés basales de subir postlarvaire hyperplasie des fibres musculaires squelettiques considérable (c. téléostéens de poisson) et la régénération complète suite à la perte appendice (c. urodèles des amphibiens). En outre, l&#39;utilisation de myoblastes en culture pourrait aider à la compréhension de la régénération et la réexposition du programme myogénique et les différences entre eux. Àcette fin, nous décrivons en détail un protocole robuste et efficace (et leurs variations) pour isoler et maintenir PPM et leur progéniture, les myoblastes et les myotubes immatures, en culture cellulaire comme une plate-forme pour la compréhension de l&#39;évolution du programme myogénique, en commençant par le plus vertébrés basales. Capitalisant sur ​​le modèle du statu organisme du poisson zèbre (Danio rerio), nous présentons l&#39;application de ce protocole aux petits poissons de la cyprinidés clade Danioninae. Parallèlement, ce protocole peut être utilisé pour réaliser une approche comparative plus large en isolant PPM de l&#39;axolotl mexicain (Ambystomamexicanum) et même les rongeurs de laboratoire. Ce protocole est maintenant largement utilisée dans l&#39;étude de la myogenèse dans plusieurs espèces de poissons, y compris la truite arc, le saumon et la dorade 1-4.

Vingt-quatre heures après l&#39;ensemencement, les cellules précurseurs myogéniques (PPM) doivent être visibles fixé au substrat de laminine (voir les figures 1a et 1d). Après ensemencement, les cellules (PPM) adoptent une forme de broche-like, indicative de ce type de cellule (figure 1) et sont MyoD1 + (figure 2). En espèces Danio, PPM semblent être plus compact avec des processus bipolaires petites que ne le font les PPM de Oncorh...

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Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

La culture in vitro systèmes ont prouvé indispensable à notre compréhension de la myogenèse des vertébrés. Cependant, il reste beaucoup à apprendre sur le développement du muscle squelettique non-mammifère et la croissance, en particulier dans les taxons de base. Un protocole efficace et robuste pour isoler les cellules souches adultes de ce tissu, les cellules précurseurs myogéniques (PPM), et de maintenir leur auto-renouvellement, la prolifération et la différenciation dans un contexte de culture primaire permet d&#39;identifier des mécanismes de régulation conservés et divergentes tout au long de les lignées de vertébrés.

Préparation du primaire Myogenic précurseurs cellulaires / cultures de myoblastes de basales vertébrés lignées

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.2K vues.  University of Alabama at Birmingham.  La culture in vitro systèmes ont prouvé indispensable à notre compréhension de la myogenèse des vertébrés. Cependant, il reste beaucoup à apprendre sur le développement du muscle squelettique non-mammifère et la croissance, en particulier dans les taxons de base. Un protocole efficace et robuste pour isoler les cellules souches adultes de ce tissu, les cellules précurseurs myogéniques (PPM), et de maintenir leur auto-renouvellement, la prolifération...

Vidéo: Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Cultures neuronales primaires du cerveau des drosophiles stade tardif pupes

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

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Biologie

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Préparation des cultures de neurones d&#39;embryons de drosophile Midgastrula scène

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Préparation de cultures souris Dissocié neurones corticaux

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to the restrictions imposed by a child's small size and their inevitable growth. Consequently, there is a genuine need for innovative therapies designed specifically for pediatric patients with cardiac rhythm disorders. We propose that a conductive biological alternative consisting of a collagen-based matrix containing autologously-derived cells could better adapt to growth, reduce the need for recurrent surgeries, and greatly improve the quality of life for these patients. In the present study, we describe a procedure for incorporating primary skeletal myoblast cell cultures within a hydrogel matrix to fashion a surgically-implantable tissue construct that will serve as an electrical conduit between the upper and lower chambers of the heart. Ultimately, we anticipate using this type of engineered tissue to restore atrioventricular electrical conduction in children with complete heart block. In view of that, we isolate myoblasts from the skeletal muscles of neonatal Lewis rats and plate them onto laminin-coated tissue culture dishes using a modified version of established protocols[2, 3]. After one to two days, cultured cells are collected and mixed with antibiotics, type 1 collagen, Matrigel&trade;, and NaHCO3. The result is a viscous, uniform solution that can be cast into a mold of nearly any shape and size[1, 4, 5]. For our tissue constructs, we employ type 1 collagen isolated from fetal lamb skin using standard procedures[6]. Once the tissue has solidified at 37&deg;C, culture media is carefully added to the plate until the construct is submerged. The engineered tissue is then allowed to further condense through dehydration for 2 more days, at which point it is ready for in vitro assessment or surgical-implantation.

Here, we demonstrate fabrication of collagen-based, tissue constructs containing skeletal myoblasts. These 3-D engineered constructs may be used to replace or repair tissues in vivo. For our purposes, we have designed these as an atrioventricular electrical conduit for the repair of complete heart block[1].

Fabrication de constructions myogéniques de l&#39;ingénierie tissulaire

Despite the fact that electronic pacemakers are life-saving medical devices, their long-term performance in pediatric patients can be problematic owing to ...

Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized. Primary cells are preferred in studies of cell cycle control, apoptosis, and DNA repair, as cancer cells carry mutations in genes involved in these processes. Primary cells cannot be cultured indefinitely due to the onset of replicative senescence or aneuploidization. Hence, new cultures need to be established regularly. The procedure for isolation of rodent embryonic fibroblasts is well established, but isolating adult fibroblast cultures often presents a challenge. Adult rodent fibroblasts isolated from mouse models of human disease may be a preferred control when comparing them to fibroblasts from human patients. Furthermore, adult fibroblasts are the only available material when working with wild rodents where pregnant females cannot be easily obtained. Here we provide a protocol for isolation and culture of adult fibroblasts from rodent skin and lungs. We used this procedure successfully to isolate fibroblasts from over twenty rodent species from laboratory mice and rats to wild rodents such as beaver, porcupine, and squirrel.

This article describes a protocol for isolation and maintenance of primary fibroblast cultures from skin and lung tissue of wild rodents.

Établir des cultures primaires de fibroblastes adultes à partir de rongeurs

The importance of using primary cells, rather than cancer cell lines, for biological studies is becoming widely recognized.  Primary cells are preferred ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

Cultures de cellules primaires à partir Drosophile Embryons Gastrula

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. The large airways therefore require an efficient repair mechanism to protect our bodies. This repair process occurs from stem cells in the airways and isolating these stem cells from the airways is important for understanding the mechanisms of repair and regeneration. It is also important for understanding abnormal repair that can lead to airway diseases 2. The goal of this method is to isolate a novel stem cell population from the mouse tracheal submucosal gland ducts and to place these cells in in vitro and in vivo model systems to identify the mechanisms of repair and regeneration of the submucosal glands 3. This production shows methods that can be used to isolate and assay the duct and basal stem cells from the large airways 3.This will allow us to study diseases of the airway, such as cystic fibrosis, asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Currently, there are no methods for isolation of submucosal gland duct cells and there are no in vivo models to study the regeneration of submucosal glands.

Here we demonstrate our protocol for isolation of basal and submucosal gland duct cells from mouse tracheas. We also demonstrate the method of injecting stem cells into the dorsal mouse fat pad to create an in vivo model of submucosal gland regeneration.

Isolement de cellules basales et les cellules sous-muqueux du canal de la glande de la souris Trachée

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Préparation des cellules de souris embryonnaires fibroblastiques conviennent pour la culture embryonnaires humaines et cellules souches pluripotentes induites

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...