We thank Sergio G&#243;mez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.

Les expérimentations animales ont été menées selon des protocoles approuvés et en suivant les directives de la loi de protection des animaux allemand. Tout le personnel effectuant des expériences animales programmes de formation passés selon la catégorie B ou C de la Fédération des associations européennes des animaux de laboratoire de sciences. 1. Génération du recombinant vivant atténué vaccins contre la grippe par génétique inverse REMARQUE: Le protocole détaillé pour la génération de virus grippaux recombinants par génétique inverse a été décrite par des études antérieures 5 et est hors de la portée de ce rapport. En bref, le sauvetage des vaccins antigrippaux adaptés au froid (CAV) se fait dans une enceinte de biosécurité de classe II sous le niveau de biosécurité 2 (BSL2) confinement, et implique des étapes détaillées ci-dessous. Le protocole de transfection et d&#39;infection qui résulte de Martinez-Sobrido et al. 5. <ol><li> Générer une grippe adapté au froid réassortivaccin en utilisant comme fond adapté au froid de la souche A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), ainsi que l&#39;hémagglutinine (HA) et la neuraminidase une modification (NA) de A / PR / 8/34 (H1N1) souche ( Figure 1A). La modification dans le gène NA est constitué d&#39;un remplacement à base de PCR d&#39;une séquence conservée dans la tige de la protéine (résidus 65 à 72) par une séquence d&#39;ADNc court codant pour la ovalbumine de poulet (OVA) peptide -derived SIINFEKL (figure 1B). Le peptide est un peptide SIINFEKL immunodominant fortement dans le contexte de la H-2b de classe MHC réponse de souris C57BL / 6 12 I restreints. </li><li> Plate 10 6 cellules par puits 293T dans des plaques à 6 puits en utilisant du milieu DMEM 10% de sérum bovin fœtal (FBS) supplémenté avec 1% de pénicilline / streptomycine (P / E). </li><li> Préparer mélange de transfection plasmidique: Ajouter 1 ug de chacun des plasmides codant ADNc pour PB2, PB1, PA, NP, M, NS de la grippe A / Ann Arbor / 6/60 souche et 1 pg des plasmides codant pour le NA -SIINFEKL etHA de la grippe A / PR / 8/34. Ajoutez préchauffé OptiMEM (15 pi pour un volume final de 100 pl / puits). </li><li> Incuber transfection mélange pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 100 ul de mélange de transfection / puits et incuber pendant 16 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Changer de support de cellule par DMEM 0,3% de BSA 1% P / E à 33 ° C et 5% de CO 2 pendant 5 heures. </li><li> Ajouter des cellules MDCK permissives 10 6 de la grippe dans du DMSO contenant 1 ug / ml de trypsine de pancréas de bovin traitée avec de la L-1-tosylamide-2-phényléthyl chlorométhyl cétone (TPCK-trypsine). Maintenir les co-cultures 293T-MDCK pour 2 - 3 jours à 33 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Recueillir surnageants de MDCK-293T cellules co-cultures et clair par centrifugation à 260 g pendant 5 min. </li><li> Inoculer 9 - 10 jours d&#39;âge œufs de poule embryonnés dans des conditions stériles. Pour ce faire, faire un trou sur le dessus de la coquille comme indiqué par Martinez-Sobrido et al. 5. </li><li> Couvrir l&#39;esprit coquilleh cire fondue en utilisant un coton-tige et incuber les œufs de poule inoculés pendant 3 jours à 33 ° C. </li><li> Récolter le liquide allantoïque des œufs embryonnés infectés: Laver les coquilles d&#39;œufs avec 70% d&#39;éthanol. Ouvrez l&#39;œuf avec une fissure très doucement dans la partie supérieure et retirez la membrane allantoïque utilisant des pinces stériles. Utilisez une pipette de 10 ml de recueillir autant de liquide que possible (6 - 10 ml). Centrifuger à 260 g pendant 10 min à 4 ° C et transférer le fluide allantoïque autorisé à de nouveaux tubes. </li></ol> Immunité 2. Suivi vaccin spécifique <ol><li> Le traçage des cellules dendritiques peptidiques portant (PED) <ol><li> Pour la vaccination de la souris, anesthésier les souris avec 5% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène à l&#39;aide d&#39;un vaporisateur de précision. Utiliser une pipette de 200 pi d&#39;administrer 50 ul de PBS contenant 10 3 unités formant des plages (pfu) de vaccin exprimant le peptide SIINFEKL par des gouttelettes directement dans les narines de souris. </li><li> Trois jours après la vaccination, euthanizsouris via e anesthésie à l&#39;isoflurane suivies par dislocation cervicale. </li><li> Soulevez la peau de la souris sur la ligne médiane juste en dessous de la cage thoracique avec des pinces et couper une petite incision à travers la peau avec des ciseaux. Du point de l&#39;incision, faire un 3 - 5 cm de long couper à travers la peau vers la tête et la queue, puis deux incisions 2 cm de la ligne médiane latéralement à partir de chaque extrémité. Peler la peau pour révéler les cavités péritonéale et thoraciques. Découpez soigneusement à travers les membranes entourant le péritoine pour exposer le thorax. </li><li> Pour accéder à la médiastin couper le diaphragme et le fond de la nervure de la cage. Trouver et supprimer les 2 ganglions lymphatiques médiastinaux (MLN), légèrement dorsal et latéralement adjacente à la thymus, en dedans à côté de l&#39;artère brachiocéphalique, près de la face ventrale de la trachée. </li><li> Pour récolter les MLNS utilisent pince courbe. Placez la pince sous les ganglions lymphatiques et les tirer doucement. Placez les ganglions lymphatiques dans une plaque à 6 puits contenant 1 ml de DMEM et supprimer tous les connective ou tissu adipeux entourant le noeud. <ol><li> Taquiner chaque échantillon à fond avec deux aiguilles 26 G attachés aux seringues de 1 ml. Pour taquiner le ganglion lymphatique, maintenez-la enfoncée avec une aiguille tout en brisant ouverte le ganglion lymphatique avec l&#39;autre aiguille. Lorsque cela est fait correctement, les cellules concentrées éclatement du ganglion sont facilement observables dans les médias. Faire passer tous les matériaux de tissu à travers un filtre en nylon de 70 pm pour obtenir des suspensions de cellules uniques. </li></ol></li><li> Suspensions de cellules individuelles de centrifugation pour 10 min à 260 xg dans une centrifugeuse réfrigérée. Reprendre le culot cellulaire dans 2 ml de Red Blood Cell Lysing (RBCL) Tampon pour lyser les globules rouges. Laisser lyse se dérouler pendant 3 minutes à température ambiante. </li><li> Neutraliser tampon RBCL par centrifugation et remise en suspension des cellules dans 2 ml de PBS glacé. </li><li> cellules de la plaque en forme de U dans des plaques à 96 puits à une concentration de 10 7 cellules / ml dans un volume final de 100 ul. </li><li> Pour la cytométrie de flux, analyse cellulaires bloc des récepteurs Fc aide1 pg d&#39;anticorps anti-souris CD16 / CD32 par 10 6 cellules pendant 15 min sur de la glace. </li><li> Plaques Centrifugeuse et jetez surnageants par plaque pichenette. Incuber les puits individuels avec la combinaison d&#39;anticorps de surface de choix. Typiquement, pour la détection de cellules dendritiques dans les ganglions lymphatiques, le cocktail d&#39;anticorps doit comprendre: 0,25 ug d&#39;anticorps anti-CD11c, 0,25 ug de CD11b, 0,5 pg de CMH de classe II, 0,25 ug de CD103 et 0,15 pg de CD8a dans un volume final de 100 ul. </li><li> Pour déclenchement négative, ajouter 0,25 pg d&#39;anti-CD3, CD19, NK1.1 ou une lignée cocktail (figure 2A). Stratégies de déclenchement alternatifs ainsi que les protocoles d&#39;indemnisation appropriée de plusieurs colorants fluorescents peuvent être trouvés sur le site Web de l&#39;Genome Project immunologique. En plus des marqueurs de surface de choix, ajouter 1 pg d&#39;un anticorps dirigé contre H-2K b lié à SIINFEKL pour le cocktail. Cet anticorps disponible dans le commerce permet la visualisation des CD in laquelle le peptide SIINFEKL est lié à la surface du CMH de classe I. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps de surface pendant 30 min sur de la glace. Protéger la plaque de la lumière. Plaques centrifuger à 260 g pendant 5 min et de lavage avec 2 ml de PBS deux fois. Transfert cellules pour la cytométrie en flux tubes pour l&#39;analyse. </li></ol></li><li> L&#39;évaluation d&#39;un vaccin spécifique prolifération des lymphocytes T <ol><li> Obtenir des cellules T du donneur de souris disponible dans le commerce TCR transgénique (souris OT-I) (C57BL / 6-Tg (TCR ATCRB) 1100Mjb / J) dans laquelle toutes les cellules T CD8 générées sont spécifiques pour le peptide SIINFEKL. Euthanasier souris par anesthésie à l&#39;isoflurane, suivie par dislocation cervicale. Récolte la rate en effectuant une incision dans la cavité abdominale. Placez la rate / s dans 2 ml de DMEM / rate et enlever le tissu conjonctif et la graisse. </li><li> Générer des suspensions de cellules simples de la rate en suivant la procédure décrite au paragraphe 2.1.2 et 2.1.3. </li><li> Pour enrichir encore la suspension de cellule unique sur les cellules T, appliquer des protocoles de séparation magnétique de perlesen utilisant soit des procédures de sélection 12 positive ou négative. Pour différencier donneur de cellules réceptrices, en utilisant des souris congéniques de sorte que par exemple les souris receveuses CD45.1 expriment le marqueur de leucocytes de donneur alors que les cellules T expriment 12 CD45.2. </li><li> Pour identifier les cellules T, les incuber dans 1 ml de PBS contenant 5 uM de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) à une densité cellulaire optimale de 5 x 10 6 cellules / ml. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C protégées de la lumière. Après incubation, les cellules de centrifugation à 260 g pendant 5 min, surnageant défausse, et remettre les cellules en 3 ml de sérum de veau fœtal (FBS) pour neutraliser CFSE. </li><li> Centrifuger les cellules à 260 xg pendant 10 min et remettre en suspension dans le volume adéquat de PBS sorte que 100 pi d&#39;une solution contenant 2 x 10 6 cellules. Infuser souris congéniques bénéficiaires avec 2 x 10 6 cellules / souris par injection de sinus rétro-orbital 13. </li><li> Euthanasier les souris receveuses aux jours 3, 4 et 5 post-vaccination utilisant anesthésie à l&#39;isoflurane, suivie par dislocation cervicale. Récolter les ganglions lymphatiques médiastinaux et préparer des suspensions de cellules simples de cytométrie en flux comme indiqué dans 2.1.2-2.1.5. </li><li> Identifier les cellules du donneur par coloration des suspensions de cellules simples dans 100 ul d&#39;un cocktail d&#39;anticorps contenant: 0,25 ug d&#39;anti-CD3 de souris, des anticorps CD4 et CD8; 0,5 ug d&#39;anticorps anti-souris CD45.1 ou de CD45.2 anticorps (en fonction du phénotype de cellules du donneur). Laissez le canal FL-1 de la cytomètre en flux ouvert (FITC) pour déterminer le profil de dilution de CFSE 12 (figure 2B). </li></ol></li></ol> 3. Les souris chimériques de disséquer la réponse vaccinale spécifique d&#39;un gène REMARQUE: La génération des chimères de moelle osseuse compétitifs en utilisant des modèles de souris à base de DTR permet la discrimination des fonctions spécifiques des cellules pendant la réponse immunitaire aux vaccins. Ici, nous montrons une stratégie supplémentaire par quelle combinaison de DTR exprimant donateurs caunes avec des cellules de souris knock-out permis de d&#39;étudier les fonctions spécifiques de gènes au cours de l&#39;immunité dans des compartiments cellulaires spécifiques. Dans l&#39;exemple que nous générons souris avec suppression spécifique des récepteurs Toll-like 3 (TLR3) dans Langerine + CD103 + DC. <ol><li> Préparation de cellules de donneur de moelle osseuse <ol><li> Travailler sous une armoire de biosécurité de niveau II. Éviter la contamination en utilisant des instruments exclusivement autoclave. </li><li> Pour générer des souris chimères de moelle osseuse, utiliser CD45.1 congéniques + C57BL / 6 souris femelles comme destinataires, et utiliser TLR3 - / -, Langerine-DTR / EGFP ou souris exprimant wt CD45.2 + en tant que donateurs. En utilisant des souris donneuses et receveuses congéniques permet la différenciation des cellules du donneur et du receveur par cytométrie de flux, ce qui permet la prise de greffe à évaluer. </li><li> Pour obtenir des cellules de moelle osseuse de donneurs, euthanasier souris donneuses avec isoflurane suivie par dislocation cervicale. Avec des ciseaux pointus effectuer des incisions autour des chevilles de sorte que le mmusculature ouse est exposée. </li><li> Utilisation pince émoussée tirer la peau de la souris et de la fourrure doucement de la cheville vers les hanches afin que les muscles des jambes sont visibles. </li><li> Avec des ciseaux pointus couper les jambes de la souris à la hauteur des hanches et au-dessus de la tête du fémur. </li><li> Placez les jambes sur une boîte de Pétri et sur la glace. Travaillez rapidement et de supprimer tous les muscles pour exposer les os. </li><li> Fémurs et tibias séparés. Placez les os dans une solution d&#39;éthanol à 70% pendant 5 min pour éliminer les bactéries possibles et placez-les immédiatement sur une autre boîte de Pétri contenant 5 ml de DMEM sans sérum. Couper l&#39;os se termine avec des ciseaux pointus et rincer la moelle osseuse dans le DMEM. Pour ce faire, rincer 1 ml de DMEM dans l&#39;os par l&#39;insertion d&#39;une aiguille de 26 G fixée à une seringue de 5 ml. Assurez-vous que les os semblent blanches (vide) après le rinçage. </li><li> Recueillir toutes les cellules de la moelle osseuse de souris donneuses dans 10 ml de DMEM. Générer des suspensions monocellulaires de cellules de moelle osseuse en passant la récolte à travers un tamis cellulaire de 70 pm. </li><li> Cloreille suspensions monocellulaires de cellules de la moelle osseuse par centrifugation à 260 xg pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse réfrigérée. Resuspendre le culot cellulaire dans 10 ml de PBS. Épuiser les globules rouges grâce à la solution RBCL comme décrit dans 2.1.3 et 2.1.4. </li><li> Compter les cellules de moelle osseuse en utilisant soit un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatisé. Évaluer la viabilité cellulaire par la détermination des cellules mortes par coloration au bleu trypan 13. De façon optimale, une donne des animaux individuels d&#39;environ 3 x 10 7 globules blancs / souris avec une viabilité d&#39;au moins 80%. </li><li> Dans le cas de l&#39;ensemble des chimères de moelle osseuse, de préparer TLR-3 - cellules ou des donateurs de poids - /. La concentration cellulaire optimale est de 2 x 10 7 cellules / ml depuis 2 x 10 6 cellules dans 100 ul de PBS seront utilisés pour la transplantation. Si pas utilisé immédiatement, des cellules donneuses conserver à -80 ° C en utilisant des techniques de congélation lente et FBS à 10% de DMSO. Pour le modèle chimérique mixte, mélanger cellules Langerine-DTR-donateurs et TLR3 - / - </sup&gt; Cellules du donneur dans un ratio de 75:25. Préparer un mélange de 75: 25 Langerine-DTR: poids cellules de moelle osseuse pour générer des souris de contrôle. </li></ol></li><li> Irradiation de la souris et de la transplantation <ol><li> Irradier les souris femelles entre 6 - 8 semaines d&#39;âge dans une source d&#39;irradiation au césium-137. Donnez souris deux doses de 550 rad 4 heures d&#39;intervalle. Irradiation de Split minimise la toxicité hépatique aiguë et réduit donc la létalité de la souris en raison du protocole d&#39;irradiation. </li><li> Après irradiation, garder souris sous traitement avec des antibiotiques pour deux semaines. Donner des antibiotiques avec l&#39;eau potable à 2,5 à 5 mg de Baytril / kg. </li><li> 2 - 4 h après la seconde irradiation, les souris transplantés avec des cellules de moelle osseuse du donneur par voie intraveineuse. Effectuer l&#39;injection de cellules du donneur par injection du sinus rétro-orbital sous 13 anesthésie à l&#39;isoflurane et un volume maximum à l&#39;aide de 100 ul de PBS contenant 2 x 10 6 cellules. </li><li> Quatre semaines après la transplantation, évaluer la prise de greffe dans un échantillon de 100ul de sang périphérique par cytométrie de flux en utilisant une machine capable de lire au moins deux couleurs. Pour faire la distinction entre le donneur et les cellules receveuses de radio-résistant, disponible dans le commerce en utilisant CD45.1 marqué par fluorescence et des anticorps anti-souris CD45.2 à l&#39;aide de dilutions entre 1/100 et 1/200. La prise de greffe optimale des cellules du donneur doit être d&#39;au moins 80% du total des cellules hématopoïétiques dans le sang périphérique. </li></ol></li><li> Vaccination ciblée et l&#39;épuisement <ol><li> Vacciner les souris avec le vaccin antigrippal vivant atténué recombinant par voie intranasale. Pour la vaccination de la souris, anesthésier les souris avec 5% d&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène à l&#39;aide d&#39;un vaporisateur de précision. Utiliser une pipette de 200 pi d&#39;administrer 50 ul de PBS contenant 10 3 unités formant des plages (pfu) de vaccin. </li><li> Pour générer le modèle final de la souris, le traitement des souris avec 50 ng de DT dilué dans 50 ul de PBS par voie intranasale. Administrer DT goutte à goutte directement aux narines de souris anesthésiées comme indiqué en 3.3.1. mi TraiterCE avec des doses quotidiennes à partir de traitement au jour -2 avant la vaccination jusqu&#39;au jour 2 post-vaccination (figure 3B). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dans cette étude, nous décrivons comment la génétique et des modèles de souris chimériques inverse peut être utilisé pour élucider les mécanismes physiologiques et moléculaires de l&#39;immunité induite par le vaccin. La génétique de la grippe inverse est établi dans de nombreux laboratoires et a joué un rôle principal dans la compréhension de la grippe pathogenèse, la réplication et la transmission 17. Un point clé dans notre protocole est le sauvetage des vaccins antigrippaux adaptés a...

La génération de la mémoire immunologique en l&#39;absence de la maladie est la base physiologique de vaccination efficace 1. Récemment, les approches fondées sur la biologie des systèmes ont révélé que les vaccins à succès tels que le vaccin contre la fièvre jaune, induisent une forte induction de réponses immunitaires innées et l&#39;activation de plusieurs sous-ensembles de cellules dendritiques (CD), qui à son tour, conduit à multilignée activation de l&#39;antigène Les cellules T spécifiques 2,3. Depuis les PED sont la seule population de cellules immunitaires avec la possibilité d&#39;activer les cellules T naïves spécifiques de l&#39;antigène 4, l&#39;étude de leur fonction lors de la vaccination est essentielle pour comprendre les réponses immunitaires aux vaccins et de concevoir des stratégies futures contre les agents pathogènes difficiles. Un système permettant le traçage des différents sous-ensembles PED au cours des réponses immunitaires aux vaccins serait souhaitable afin d&#39;établir une cinétique précis de la migration vers les tissus lymphoïdes DC, et donc de fournircomprendre les mécanismes physiologiques responsables du déclenchement de l&#39;immunité adaptative spécifique vaccin. La génétique inverse à base approches offrent la possibilité de générer modifié, les vaccins vivants atténués qui peuvent être utilisés expérimentalement avec ce but. Depuis sa mise en œuvre sur la recherche sur la grippe, la génétique inverse à base de plasmides a été largement employé pour générer des souches grippales recombinantes dont LAIVs. Les protocoles standard pour sauver virus grippaux recombinants exigent multi-transfection de lignées très transfectables de cellules avec des plasmides de ambisens (produisant à la fois de l&#39;ARN sens positif et négatif) contenant les huit grippe segments viraux ainsi que l&#39;amplification dans un système permissif comme Madin-Darby de rein de chien ( MDCK) et / ou des oeufs embryonnés de poulet 5. Cependant, l&#39;application de la génétique inverse pour générer des outils moléculaires pour étudier les mécanismes immunitaires de la vaccination demeure inexploré. La générationde nouveaux modèles de souris permettant raréfaction spécifique de sous-ensembles de cellules immunitaires, y compris les pays en développement, a ouvert de nouvelles possibilités de comprendre les mécanismes immunitaires de base qui sous-tendent la protection vaccinale-induite. La comparaison entre les fonctions de sous-ensembles DC chez les souris et les humains a révélé que, dans une grande mesure, la souris et CD humaines sont fonctionnellement homologue 6,7, ces résultats suggèrent fortement que le développement de modèles de souris permettant raréfaction spécifique des PED à l&#39;état stationnaire et dans des conditions inflammatoires, peuvent servir à comprendre la physiologie des réponses DC chez les humains. Ces dernières années, un certain nombre de modèles de souris a été générée portant des transgènes exprimant le récepteur de la toxine diphtérique simien (DT) (DTR) sous le contrôle de la région promotrice d&#39;un gène d&#39;intérêt 8,9. Depuis tissus de souris ne expriment naturellement DTR, ces modèles permettent appauvrissement conditionnelle de sous-ensembles de cellules portant le gène ciblé d&#39;intérêt lors de l&#39;inoculation de la souris avec DT. Ainsi, notre ability à épuiser les DC spécifiques et d&#39;autres leucocytes in vivo au cours de processus physiologiques, a été grandement améliorée par la mise au point sur ​​la base de ro-DTR. Cependant, bien que ces modèles de souris transgéniques ont été largement utilisés pour comprendre l&#39;ontogenèse du système immunitaire, leur application au développement d&#39;un vaccin a été testé à peine. Ici, en combinant grippe génétique inverse et de chimères de moelle osseuse compétitifs basés DTR, nous proposons une méthode pour étudier la cinétique de l&#39;immunité du vaccin ainsi que la fonction individuelle de gènes au cours des réponses immunitaires aux vaccins in vivo. L&#39;application de cette technologie pour l&#39;évaluation préclinique de nouveaux vaccins contre les maladies infectieuses difficiles pourrait aider à rationaliser la conception de vaccins et de tester des vaccins candidats in vivo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle Medium (DMEM 1X)</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti MEM</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>p11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonated eggs</td>
			<td>Valo biomedia Gmbh</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Nylon Filters</td>
			<td>Greiner-Biorad</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-5321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0453-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0081-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7-Anti-mouse CD3&#949; (145-2611)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0041-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE Proliferation dye</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 2.5%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Molecular probes&#160;</td>
			<td>O23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria Toxin (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-TPCK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACsCanto II Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo cell analysis software 9.5</td>
			<td>Flowjo inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automatic Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intranasal administration of recombinant influenza vaccines in chimeric mouse models to study mucosal immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

La génération de vaccins contre la grippe vivant atténué recombinant peut être obtenu par transfection de plasmides codant pour les huit segments du virus de la grippe sous le contrôle de promoteurs bidirectionnels 5. Un vaccin contre la grippe adapté au froid contient généralement six segments d&#39;une souche adaptée au froid, ainsi que le HA et NA de la souche de grippe de choix (par exemple, H1N1) (Figure 1A). Le principe de l&#39;adaptation au froid est basée sur la r...

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Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K vues.  Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology. There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

Protocole pour vaccins recombinants contre le SRAS RBD-base: préparation de protéines, vaccination des animaux et de détection de neutralisation

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. The NALT are two parallel bell-shaped structures located in the nasal passages above the hard palate, and are usually considered to be secondary components of the mucosal-associated lymphoid system4-6. Located within the NALT are discrete compartments of B and T lymphocytes interspersed with antigen-presenting dendritic cells4,7,8. These cells are surrounded by an epithelial cell layer intercalated with M-cells that are responsible for antigen retrieval from the mucosal surfaces of the air passages9,10. Naive lymphocytes circulating through the NALT are poised to respond to first encounters with respiratory pathogens7. While NALT disappear in humans by the age of two years, the Waldeyer's Ring and similarly structured lymphatic organs continue to persist throughout life6. In contrast to humans, mice retain NALT throughout life, thus providing a convenient animal model for the study of immune responses originating within the nasal sinuses11.
Cultures of single-cell suspensions of NALT are not practical due to low yields of mononuclear cells. However, NALT biology can be examined by ex vivo culturing of the intact organ, and this method has the additional advantage of maintaining the natural tissue structure. For in vivo studies, genetic knockout models presenting defects limited to NALT are not currently available due to a poor understanding of the developmental pathway. For example, while lymphotoxin-&alpha; knockout mice have atrophied NALT, the Peyer's patches, peripheral lymph nodes, follicular dendritic cells and other lymphoid tissues are also altered in these genetically manipulated mice12,13. As an alternative to gene knockout mice, surgical ablation permanently eliminates NALT from the nasal passage without affecting other tissues. The resulting mouse model has been used to establish relationships between NALT and immune responses to vaccines1,3. Serial collection of serum, saliva, nasal washes and vaginal secretions is necessary for establishing the basis of host responses to vaccination, while immune responses originating directly from NALT can be confirmed by tissue culture. The following procedures outline the surgeries, tissue culture and sample collection necessary to examine local and systemic humoral immune responses to intranasal (IN) vaccination.

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methods to examine contributions of the nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) to nasal and systemic immune responses of mice to intranasal vaccines are described. We demonstrate a surgical procedure to establish a NALT-dependent mouse model and ex vivo cultures of extracted NALT.

Examen du rôle du tissu lymphoréticulaire nasopharynx associée (NALT) dans les réponses de la souris pour les vaccins

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Administration intra-trachéale de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; Dans les modèles de souris pour étudier Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Efficacité de protection et de la réponse immunitaire pulmonaire après l&#39;administration sous-cutanée et intranasale BCG chez la souris

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Utilisation de modèles Zebrafish de grippe humaine A Infections au virus pour le dépistage médicaments antiviraux et Caractériser hôte réponses immunitaires cellulaires

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...