SS est financé par une bourse de recherche clinique Wellcome Trust intermédiaire, CW par une affectation spéciale du Programme Wellcome.

Une. Microslide Préparation <ol><li> Pré-revêtement d&#39;une microplaque à six canaux avec la queue de rat de collagène de type I (RTC, dilué au 1:100 dans du PBS donnant une dilution de travail de 220 pg / ml). Ceci est réalisé en injectant 30 ul d&#39;une solution diluée RTC directement dans les canaux et en incubant pendant 2 heures à 37 ° C, suivie de trois lavages avec du PBS. </li></ol> 2. Les cellules d&#39;ensemencement en microplaques <ol><li> Dissocier un flacon T75 confluente de cellules hépatiques humaines cultivées sinusoïdales endothéliales (SSEC) (isolé à partir de tissu de foie comme décrit précédemment 13) dans de la trypsine-EDTA, les laver dans du PBS, et remettre en suspension à 3 x 10 6 cellules / ml dans du milieu complet (endothéliales humaines support de base supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine 100μg/ml, 10% de sérum AB humain inactivé à la chaleur, 10 ng / ml de facteur de croissance vasculaire endothéliale et de 10 ng / ml d&#39;hépatocytes facteur de croissance). Injecter 30 ul de suspension cellulaire désastreusescte dans chaque canal. </li><li> Laisser cellules d&#39;adhérer pendant 1 h dans un incubateur humidifié à 37 ° C avec une atmosphère de CO 2 de 5% sur une grille coulissante. Après avoir laissé les cellules adhérer à remplir les orifices de chaque côté de chaque canal avec le milieu complet (figure 1). </li></ol> 3. Stimulation des cellules cytokine <ol><li> Laisser les cellules dans l&#39;incubateur pendant 24 heures. Évaluer la croissance des cellules en utilisant un microscope à contraste de phase inversé. 24 heures avant l&#39;essai d&#39;adhérence, de stimuler les monocouches endotheliales avec des cytokines en remplaçant le milieu de croissance avec du milieu complet supplémenté en facteur de nécrose tumorale alpha et de l&#39;interféron gamma, les deux à 10 ng / ml. </li></ol> 4. Isolement des lymphocytes du sang périphérique <ol><li> Isoler des lymphocytes du sang périphérique à partir de sang total en purifiant d&#39;abord la fraction mononucléaire par centrifugation en gradient de densité sur un milieu de centrifugation de séparation de cellules approprié pendant 25 min à 800x g. Incuber les cellules de plastique pendant 1 heure pour permettre l&#39;adhérence des monocytes. </li><li> Après l&#39;adhésion à aspirer plastique lymphocyte enrichi surnageant. Laver les lymphocytes et les remettre en suspension (typiquement de 1 x 10 6 cellules / ml dans un milieu d&#39;écoulement (milieux de base endotheliales contenant 0,1% (v / v) d&#39;albumine de sérum bovin (BSA)). </li></ol> 5. Prétraitement de l&#39;endothélium ou leucocytes avec inhibiteurs <ol><li> Préparer des dilutions recommandées de la fonction de blocage des anticorps ou des inhibiteurs de petites molécules de l&#39;endothélium media/0.1% (v / v) de BSA. Remplacer le milieu complet avec la solution de blocage anticorps / inhibiteur dans le canal de microplaque choisi 30 min avant de s&#39;écouler dosage. </li><li> Lorsque le prétraitement des récepteurs de chimiokines sur les lymphocytes sont prévues, remettre en suspension les leucocytes isolés dans une solution de RPMI contenant 0,1% (v / v) de BSA et incuber avec 200 ng / ml de la toxine coquelucheuse pour bloquer la protéine G activité de récepteur couplé à des récepteurs de chimiokines, en alternative diluer spécifique fonctiondes anticorps de blocage ou des inhibiteurs à petites molécules de récepteurs de chimiokine à la dilution recommandée. Incuber leucocytes à 37 ° C pendant 30 min, puis laver et remettre en suspension dans un milieu d&#39;écoulement. </li></ol> 6. Configuration des flux de système de dosage <ol><li> Préchauffer une chambre transparente à commande thermostatique de 37 ° C. La chambre doit avoir des orifices pour l&#39;insertion d&#39;un tube de silicone et la fourniture électronique d&#39;une électrovanne qui permet à commutation électronique entre les cellules et le milieu pratiquement sans volume mort. L&#39;enceinte est montée sur un microscope inversé pour permettre la microscopie à contraste de phase. Figure 2 montre la chambre de dosage d&#39;écoulement et le microscope et microlame placé sur la platine du microscope. </li><li> Pré-remplir une seringue en verre de 50 ml avec un luer lock avec 10 ml d&#39;eau distillée stérile et attacher une longueur de tube en silicone de 25 cm de l&#39;orifice de la seringue. Insérer dans une pompe à seringue. Altérer le débit de la pompe de seringue de prélèvement selon lales instructions du fabricant de la microplaque pour maintenir une contrainte de cisaillement de 0,05 Pa (0,5 dyne / cm 2, figure 3). </li><li> Prenez deux seringues de 5 ml, jeter les plongeurs et fixer les barils pour les deux ports de flux d&#39;une électrovanne électronique en utilisant un tube de silicone. <ol><li> Attacher de 12 cm de tube de silicone à la soupape de sortie de flux. La valve permet l&#39;alternance entre une connexion d&#39;un tampon de lavage de cellules (endothéliales de media/0.1% (v / v) de BSA) et la suspension de lymphocytes. </li><li> Rincer l&#39;électrovanne électronique par l&#39;insertion du tampon de lavage dans les deux corps de seringue et assurant tampon s&#39;écoule d&#39;un canon à travers la soupape et dans le tube de silicone de sortie de flux. </li><li> Utiliser le commutateur de vanne à alternance à l&#39;autre cylindre et d&#39;assurer le tampon est fluide et que toutes les bulles sont éliminées du système. Retirez le tampon de lavage de l&#39;un des barils et la remplacer par une suspension de lymphocytes figure 4a. </li></ol></li><li> Connectez le tubin de siliconeg à partir de la pompe à seringue à un orifice d&#39;un canal de microplaque choisi par l&#39;intermédiaire d&#39;un adaptateur de microplaque. Ensuite, connecter le tube de silicone à partir de la soupape d&#39;échappement opposée à l&#39;orifice par l&#39;intermédiaire d&#39;un adaptateur de microplaque. Assurez-vous que le tube de silicone et les adaptateurs sont remplis avec du tampon de lavage avant la connexion pour empêcher les bulles d&#39;air entrant dans le système (figure 4b). </li><li> Une fois connecté au système d&#39;écoulement, placer la microplaque sur la platine du microscope et fixer avec des agrafes ou de ruban adhésif pour empêcher le mouvement. Régler le microscope à l&#39;objectif 10X avec le réglage de phase approprié. S&#39;assurer que la monocouche endothéliale est visualisée et la mise au point en utilisant la lentille oculaire. S&#39;assurer que les images peuvent être capturées par l&#39;intermédiaire d&#39;un appareil photo qui est fixé sur le microscope grâce à quoi les images peuvent être transmises à un écran et enregistrées. </li></ol> 7. Débit de dosage Technique et enregistrement de l&#39;adhérence pour l&#39;analyse <ol><li> Perfuser la couche endothéliale avec du tampon de lavage pendant 2 minutes en commençant withdrawal de la pompe de la seringue pour enlever les débris ou anticorps bloquant non lié, puis passer la vanne pour permettre à 5 min bolus de solution de leucocytes à une contrainte de cisaillement de paroi constante de 0,05 Pa. </li><li> Pendant les 2 dernières minutes du bol de leucocytes, enregistrer 10 champs aléatoires le long de la longueur de la microplaque. Cela permet une analyse hors ligne des lymphocytes roulement / modem sur la monocouche endothéliale. Enregistrer chaque domaine pour environ 10 secondes avant de passer à la prochaine et veiller à ce que les enregistrements sont effectués sur le sens de l&#39;écoulement pour éviter l&#39;enregistrement deux fois de suite la même cellule de roulement. </li><li> Suivre le bolus de leucocytes avec un bolus de 5 min de tampon de lavage par retour de la soupape à sa position de départ. Au cours de la 2 min finale de ce bolus effectuer une deuxième phase d&#39;enregistrement en choisissant au moins 10 champs choisis au hasard le long de la longueur de la microplaque. Enregistrer chaque champ pendant environ 5 secondes avant de passer à la prochaine et veiller à ce que la monocouche endothéliale et leucoc adhérentytes sont en orientation claire. Ceci permet une analyse hors ligne du motif d&#39;adhérence. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents

L&#39;étape la plus critique pour effectuer avec succès un essai de flux fait en sorte que d&#39;une monocouche confluente en bonne santé et de cellules endothéliales est prêt avant l&#39;essai d&#39;adhérence de l&#39;écoulement. Cellules endothéliales primaires peut être difficile à la culture et sensible aux modifications dans les méthodes de culture. Il est important que 1) chambres d&#39;écoulement sont suffisamment et uniformément revêtues de cellules endothéliales en monocouche, par SSEC nous utilisons rat de type queue de collagène de type I, mais cela peut varier pour d&#39;autres populations endothéliales, 2) milieu de culture est approprié pour le type de cellule, pour SSEC nous avons décrit notre milieu complet dans la section de protocole. Autres étapes essentielles comprennent réglage de la pompe de la seringue au taux approprié de tenir compte des niveaux physiologiques de la contrainte de cisaillement. Au cours de l&#39;essai d&#39;écoulement, il est nécessaire d&#39;empêcher les bulles d&#39;air dans le circuit d&#39;écoulement qui peut endommager la monocouche endothéliale ou bandes cellules immunitaires de la surface de l&#39;endothélium. Ceci peut être évité par enRANTISSANT que tous les tubes de silicone et adaptateurs sont perfusées avec le tampon de lavage avant la connexion, que toutes les bulles d&#39;air sont éliminées et que les médias sont préchauffé avant utilisation. Lors de la connexion des adaptateurs pour les ports de la microplaque, il est très important qu&#39;il y ait une interface liquide / liquide lors de la connexion, s&#39;il ya un air alors ce sera de former un espace d&#39;air dans le système qui va perturber la monocouche endothéliale lors du retrait de la seringue étape. La solution de leucocytes dans le corps de la seringue doit agitation régulière pour s&#39;assurer que les cellules ne se déposent pas, maintenant ainsi une densité de cellules constant tout au long de l&#39;expérience. Au cours des étapes d&#39;enregistrement, il est important de veiller à l&#39;image de la couche endothéliale est correctement centré et claire pour permettre une analyse hors ligne exacte, et que lors de la deuxième étape de l&#39;essai de débit (poste leucocytes d&#39;un bolus) que suffisamment de temps est laissé pendant le tampon de lavage la phase avant l&#39;enregistrement est repris à veiller à ce quetous les leucocytes non adhérentes sont éliminées. De même, il est essentiel d&#39;utiliser des cellules endothéliales dans une monocouche de densité appropriée pour éviter la perte de cellules qui peuvent interférer avec des motifs d&#39;écoulement dans les capillaires étroits et peut également être difficile de discriminer à partir de leucocytes de moins grandes adhérentes microscopie à contraste de phase. Nous avons décrit la densité de semis optimale pour les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques humains mais cela peut varier entre les différentes populations endothéliales et des espèces. Des progrès significatifs ont été accomplis dans l&#39;étude du recrutement des leucocytes dans des modèles animaux de la microscopie intravitale. L&#39;avantage majeur de la méthode de l&#39;essai d&#39;adhérence de l&#39;écoulement est que le recrutement de leucocytes peut être étudiée dans un système binaire avec des cellules endotheliales humaines primaires. En outre, ces interactions peuvent être étudiées sous les niveaux pertinents physiologiques du stress de cisaillement. Il est important de confirmer les résultats des études chez l&#39;animal avec intravitale systèmes cellulaires humains comme il peut y avoir differences dans les propriétés endothéliales entre les espèces. L&#39;une des limites de l&#39;analyse d&#39;écoulement, c&#39;est que le recrutement de leucocytes est étudiée dans un environnement unicellulaire de la monocouche endothéliale. En outre, une fois les leucocytes ont adhéré et transmigré à travers l&#39;endothélium ils ne peuvent pas être présents dans suffisamment de numéros à être isolées et soumises à des procédés en aval. En dépit de ces limitations, une fois que le test d&#39;adhésion d&#39;écoulement a été maîtrisé il peut être mis au point pour effectuer une analyse plus approfondie de la cascade d&#39;adhérence leucocytaire et adapté pour récapituler un environnement multicellulaire. Enregistrement prolongé de champs simples et l&#39;utilisation de logiciels de suivi peut être utilisé pour analyser le comportement rampant des leucocytes. De plus lors de l&#39;achèvement de l&#39;essai d&#39;écoulement des microplaques peuvent être interrogés à l&#39;aide microscopie à balayage laser confocal et marquage immunofluorescent pour étudier l&#39;adhérence et la transmigration de manière plus détaillée. De plus, nous avons précédemment élaborered un modèle in vitro, où les leucocytes circulant pourraient interagir avec l&#39;endothélium hépatique conditionnée par la présence d&#39;hépatocytes. Ce test peut également être développé pour étudier les sous-populations de leucocytes: notre groupe a effectué des études de sous-ensembles, tels que des cellules régulatrices T, cellules B, et le foie infiltration des leucocytes. Ces études sont la preuve que le test d&#39;adhésion de flux est un outil puissant pour étudier le recrutement de leucocytes spécifique générale et organes dans les systèmes humains.

Il est maintenant bien établi que le recrutement des leucocytes en général suit le paradigme de l&#39;adhérence à plusieurs étages en cascade 1. Cela implique la capture des leucocytes à partir du sang circulant par les cellules endothéliales qui tapissent la paroi du vaisseau. Initialement, les leucocytes sont soumis à une étape de roulage qui est médiée par les récepteurs sélectine ou des membres de la superfamille des immunoglobulines. Cela permet à des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) exprimés à la surface des leucocytes pour être activé par les chimiokines présentées sur le glycocalyx endothéliale. Cela conduit à la modification de la confirmation de l&#39;intégrine à un état «à forte affinité» sur la surface de leucocytes et l&#39;adhérence ferme et l&#39;arrêter à l&#39;endothélium. Adhésion ferme est alors suivie par le changement de forme et exploration de l&#39;leucocytes sur le navire. L&#39;étape finale est la transmigration à travers la monocouche endothéliale, ce qui peut se produire par des voies d&#39;paracellulaire ou transcellulaire. Bien que l&#39;adhérence cascade à plusieurs étapes décrivents le mécanisme général de recrutement de leucocytes dans le corps il ya des différences spécifiques d&#39;organe. Dans le foie, la majorité du recrutement des leucocytes se produit dans les sinusoïdes hépatiques contrairement à d&#39;autres organes où le recrutement se produit généralement dans les veinules post-capillaires 2. Les sinusoïdes hépatiques sont un environnement de faible cisaillement et leucocytes subissent une brève étape d&#39;attache avant de raffermir l&#39;adhésion qui est sélectine indépendant 2. Ces canaux sont bordés par l&#39;endothélium sinusoïdal hépatique qui est discontinu et contient fenestrae, des pores ouverts de 100 à 200 nm de diamètre, et manquent d&#39;une membrane basale 3. Élucider les mécanismes moléculaires qui interviennent dans le recrutement des leucocytes à travers l&#39;endothélium sinusoïdal hépatique humain pourrait identifier organe cibles thérapeutiques spécifiques pour les maladies inflammatoires du foie. tests d&#39;adhésion de débit sont des outils essentiels dans l&#39;étude du recrutement des leucocytes. Ils permettent la reconstruction de leucocytes recruitment en présence d&#39;une contrainte de cisaillement pour analyser l&#39;adhérence sous des forces bien définies. L&#39;utilisation la plus fréquente pour l&#39;analyse est l&#39;étude adhésion des leucocytes à des monocouches endothéliales en culture ou des substrats purifiés. Disponibles dans le commerce chambres d&#39;écoulement sont utilisés pour perfuser les cellules dans des conditions d&#39;écoulement laminaire entre deux surfaces planes, et ensuite de visualiser le processus dynamique d&#39;adhérence sur un microscope 4. Groupes précédents ont démontré que certaines interactions adhésives n&#39;ont lieu que sous flux et ne peuvent pas être étudiés dans des essais statiques 5,6. Nous avons utilisé cette technique pour récapituler les sinusoïdes hépatiques et étudier le recrutement des leucocytes dans des conditions de faible contrainte de cisaillement. SSEC humaine sont mises en culture primaire en microplaques et des leucocytes peut alors être perfusé sur cette monocouche à un débit d&#39;écoulement calculé à reproduire la contrainte de cisaillement au sein de sinusoïdes hépatiques. La contrainte de cisaillement est une contrainte qui est appliquée en parallèle ou tangentielle à une surface comme oppOSED à contrainte normale qui est perpendiculaire. Tout liquide qui se déplace le long d&#39;une frontière va exercer une contrainte de cisaillement sur cette frontière. La contrainte de cisaillement a été montré pour être une composante essentielle de lymphocytes transmigration 7. Dans ces conditions, chaque étape de la cascade d&#39;adhérence peut être visualisée par microscopie à contraste de phase. Cette méthode a permis à des informations importantes sur le recrutement des leucocytes dans le foie, y compris l&#39;étude des molécules d&#39;adhérence classiques 8, le rôle des chimiokines et des récepteurs de chimiokines 9-11, et les molécules d&#39;adhésion atypiques tels que l&#39;adhérence vasculaire protein-1 (VAP-1 ) 8,12 et lymphatique commun et de l&#39;endothélium vasculaire récepteur-1 (CLEVER-1) 13. Bien que cet essai a été mentionné dans plusieurs publications de notre groupe, sa description a été brève et nous avons profité de cette occasion pour fournir une étape détaillé par étape pour faciliter le dépannage et éviter les erreurs techniques lors de la tentativement le dosage. En outre, nous avons récemment changé l&#39;approvisionnement en chambres de Microslide qui permet des modifications précises à la contrainte de cisaillement. Nous croyons que cette élargit l&#39;applicabilité de l&#39;analyse à d&#39;autres cellules endothéliales et immunitaires. Le procédé suivant décrit la préparation et de la technique pour la réalisation d&#39;une analyse de l&#39;adhérence à base de flux avec des cellules endotheliales sinusoïdales hépatiques humains et des lymphocytes de sang périphérique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

Infiltration leucocytaire dans les tissus du foie humain est un processus commun à toutes les maladies inflammatoires du foie adultes. Infiltration chronique peut entraîner le développement de la fibrose et de la progression vers la cirrhose. La compréhension des mécanismes moléculaires qui interviennent dans le recrutement de leucocytes au niveau du foie pourrait identifier des cibles thérapeutiques importantes pour les maladies du foie. L&#39;interaction clé lors du recrutement de leucocytes est celle des cellules inflammatoires avec endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement. Recrutement pour le foie survient dans les canaux à faible cisaillement des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (SSEC). Les conditions dans les sinusoïdes hépatiques peuvent être récapitulées par perfusion leucocytes à travers des canaux bordés de monocouches SSEC humains à des débits spécifiques. Dans ces conditions, les leucocytes sont soumis à une étape d&#39;attache bref suivi d&#39;une activation et une adhésion ferme, suivie d&#39;une étape ultérieure rampants et la transmigration à travers l&#39;endothéliumcouche. En utilisant la microscopie à contraste de phase, chaque étape de ce &#39;adhérence cascade »peut être visualisé et enregistré suivie d&#39;une analyse hors ligne. Des cellules endothéliales ou des leucocytes peuvent être prétraitées avec des inhibiteurs de déterminer le rôle de molécules spécifiques au cours de ce processus.

Ce dosage possède la capacité de visualiser l&#39;adhérence de l&#39;écoulement à plusieurs étages en cascade et d&#39;élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents en comparant les résultats des expériences de contrôle pour ceux avec des inhibiteurs moléculaires. Différents lits vasculaires peuvent être récapitulés en incorporant les cellules endothéliales spécifiques et modifiant les conditions de contrainte de cisaillement. Chaque étape de la cascade d&#39;adhérence peut être analysé en mode hors connexion en suivant le procédé d&#39;enregistrement décrit dans le protocole. La première étape de la cascade d&#39;adhérence est le roulement des leucocytes qui peuvent être exprimés en pourcentage du total des cellules adhérentes. Analyse hors ligne permet le nombre de cellules adhérentes à être énumérée dans chaque domaine enregistré au cours du bolus de leucocytes. La lecture de l&#39;image permet la comparaison des cellules qui sont fermement adhérentes et celles qui sont en cours de un mouvement de roulement à travers l&#39;endothélium. Mouvement de roulement peut être visualisée à l&#39;aide de cette technique, chaque domaine est enregistré pendant au moins 10 secondes. Cellules de roulement sont identifiés par leur vitesse réduite sur la surface endothéliale par rapport aux cellules qui coule. Ce comportement doit être démontrée pendant au moins 5 secondes sans détachement. La cascade d&#39;adhérence dans les sinusoïdes hépatiques a lieu dans un environnement à faible cisaillement et des études in vivo ont confirmé roulement minimal avec seulement une brève étape d&#39;attache. Nous avons confirmé que l&#39;essai d&#39;écoulement reflète l&#39;environnement des sinusoïdes hépatiques en démontrant que moins de 10% de leucocytes adhérents constamment stimulé rouler sur SSEC dans ces essais. L&#39;étape suivante de la cascade d&#39;adhérence est adhésion ferme. Adhérence totale peut être calculée à partir de la deuxième étape de l&#39;enregistrement pendant le bolus de tampon de lavage (étape 7.3). Analyse hors ligne permet le nombre total de cellules adhérentes fermement à être compté dans chaque domaine (figure 5). Cellules fermement adhérentes sont définies comme des cellules qui sont à l&#39;arrêt ou shapechanged avec le comportement de ramper lentement.Le nombre moyen de cellules par champ peut alors être calculée. Cette figure peut alors être utilisée, en conjonction avec la surface totale du champ de vision (déterminé à l&#39;aide d&#39;un réticule ou équivalent), de la concentration des lymphocytes (typiquement 1 x 10 6 cellules / ml) et de la vitesse d&#39;écoulement à exprimer l&#39;étendue de l&#39;adhésion des lymphocytes comme les cellules adhérentes / mm 2/10 6 cellules perfusé. L&#39;étude de la structure de l&#39;adhésion implique l&#39;analyse des deux dernières étapes de la cascade d&#39;adhérence y compris le changement de forme, ramper et migration trans. Les leucocytes adhérents à la surface supérieure de la monocouche SSEC apparaissent phase lumineuse, tandis que ceux qui ont migré à travers la monocouche apparaissent phase d&#39;obscurité (figure 6). Les cellules peuvent ensuite être classés comme présentant une adhérence «statique» (nonmigrated / tour), la morphologie «de forme changé» ou comme «migré» et les différentes catégories sont ensuite exprimés en pourcentage de lala population totale de l&#39;adhésif. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Figure 1. Monocouche de cellules primaires humaines hépatiques sinusoïdales endothéliales dans la chambre d&#39;écoulement. A) microplaques remplis de milieux contenant une monocouche de cellules endothéliales avant le début de l&#39;écoulement adhérence dosage. B) de l&#39;image à contraste de phase de confluence endothéliale monocouche, les cellules endotheliales doivent être ensemencées en microplaque qui ont été pré-revêtu (pour les cellules endotheliales hépatiques humaines cela devrait être avec Type de queue de rat de collagène 1) et il est essentiel que les cellules endothéliales sont en bonne santé dans la culture et confluentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Figure 2. Couler chambre de dosage. Une chambre de dosage à écoulement set-up peut être vu ici, il est constitué d&#39;une chambre transparente qui est montée sur un microscope inversé. Un dispositif de chauffage est placé dans la chambre et doit être contrôlé par thermostat pour maintenir une température de 37 ° C. Il devrait y avoir des ports disponibles pour connecter un tube de silicone à partir d&#39;une microplaque à l&#39;intérieur de la chambre à une pompe à seringue, qui est situé à l&#39;extérieur. La microplaque est placé directement sur ​​la platine du microscope. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Figure 3. Seringue pompe. Une pompe à seringue est connected silicone par l&#39;intermédiaire d&#39;un tube de la chambre d&#39;écoulement. La pompe est réglée à un taux de retrait spécifique en fonction de la contrainte de cisaillement désiré requis pour le dosage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Figure 4. Raccordement de soupape à la chambre à circulation. A) Une électrovanne électronique permet la commutation entre les deux cylindres de seringue contenant soit des cellules ou des milieux avec pratiquement aucun espace mort. B) Une fois que la vanne est vidée et les deux barillets sont mis en place, le tube de silicone à partir de la soupape est reliée à la chambre d&#39;écoulement. Il est essentiel que lors de la connexion de l&#39;adaptateur sur le tube de silicone à l&#39;orifice de la chambre de circulation, il ya une interface liquide / liquide. &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Figure 5. Mesure de l&#39;adhérence leucocytaire totale. Pendant les deux dernières minutes de l&#39;étape de bolus de tampon de lavage (tel que décrit dans le protocole), un minimum de dix champs aléatoires doit être enregistré. Ceux-ci peuvent être analysées hors ligne et le nombre total de cellules fermement adhérentes peuvent être comptés dans chaque champ. Adhérence totale de leucocytes peut être comparé entre les chambres de contrôle et ceux prétraitée avec des anticorps bloquants, nous montrons ici un champ représentatif d&#39;un tiroir de commande et un coulisseau prétraitée avec adhérence intracellulaire molécule-1 (ICAM-1) un anticorps bloquant. Les flèches ont été ajoutés pour mettre en évidence les leucocytes adhérents, dans la représentationTive domaine de la lame de contrôle, il ya un total de 25 leucocytes identifié et dans le bloc coulissant ICAM-1, il ya un total de 13 leucocytes identifié. Barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Figure 6. L&#39;analyse de la tendance de l&#39;adhésion des leucocytes sur des monocouches endotheliales par microscopie à contraste de phase. Analyse hors ligne des champs enregistrés peut également être utilisé pour étudier la direction et la vitesse de l&#39;adhésion des leucocytes. Les étapes spécifiques de la cascade d&#39;adhérence peuvent être visualisées et quantifiées en utilisant l&#39;imagerie par contraste de phase. Phase cellules lumineuses qui sont fermement adhérente mais pas activé peuvent être qualifiées adhésion «rondes», les cellules qui sont activated et la phase lumineuse peuvent être qualifiées de «forme changé» et les cellules qui sont phase sombre sont les cellules qui ont subi migration trans et peuvent être appelés «migré». L&#39;image montre des exemples de chaque motif d&#39;adhérence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

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A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

le recrutement de leucocytes dans le foie se produit dans les canaux spécialisés des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques uniques. Phase microscopie en contraste de recrutement de leucocytes à travers l&#39;endothélium sinusoïdal hépatique humaine dans des conditions de stress de cisaillement physiologique peut faciliter l&#39;élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce processus.

Un flux Essai d&#39;adhésion à étudier Leucocyte recrutement pour hépatiques humaines sinusoïdales endothélium dans des conditions de contrainte de cisaillement

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K vues.  University of Birmingham.  le recrutement de leucocytes dans le foie se produit dans les canaux spécialisés des sinusoïdes hépatiques qui sont bordées par des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques uniques. Phase microscopie en contraste de recrutement de leucocytes à travers l'endothélium sinusoïdal hépatique humaine dans des conditions de stress de cisaillement physiologique peut faciliter l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce processus. 

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Adhésion leucocytaire imagerie de l&#39;endothélium vasculaire au Haute pression intraluminale

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Recherche

Immunologie et infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Présentation de contrainte de cisaillement dans l&#39;étude de l&#39;adhésion bactérienne

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle pour étudier l&#39;hétérogénéité de la différenciation des macrophages humains et de la polarisation

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Test pour mesurer l&#39;adhésion des neutrophiles à Activé cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires dans des conditions statiques

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Human neutrophiles Chambre flux Essai d&#39;adhésion

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statique Essai d&#39;adhésion pour l&#39;étude de l&#39;intégrine activation dans les lymphocytes T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l&#39;analyse des lymphocytes infiltrant

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...