Les auteurs tiennent à remercier les membres passés et présents dans la Adolfo García-Sastre et Peter Palese laboratoires pour le développement des techniques de génétique inverse de la grippe et les plasmides. La recherche dans les laboratoires de AG-S est partiellement financé par CRIP, un centre financé par le NIAID d&#39;excellence pour la recherche sur l&#39;influenza et de surveillance (HHSN266200700010C) et par des subventions NIAD R01AI046954, U01AI070469 et P01AI058113. La recherche en LM-S laboratoire est partiellement financé par le NIAID octroi RO1AI077719.

1. Transfection grippe du virus de secours Virus Influenza A appartient à la famille des Orthomyxoviridae des virus à ARN négatif brin enveloppé. La grippe A génome du virus est constitué de huit gènes de l&#39;ARN de polarité négative différents qui codent au moins 11 protéines virales (figure 1) 4. Nous allons nous concentrer, dans ce rapport, sur le sauvetage de l&#39;un de la souche de laboratoire la plus courante, la grippe A/PR/8/34, 5 l&#39;aide de plasmides ambisens (PDZ) contenant les huit segments de la grippe A/PR/8/34 virale ( Figure 2). Pour le sauvetage des virus grippaux recombinants à partir d&#39;ADN plasmidique, nous recommandons trois transfections indépendantes pour chaque virus recombinant. Si plus d&#39;un sauvetage virus recombinant est tenté, à l&#39;échelle les étapes suivantes accordantly le nombre de virus pour être sauvés. La transfection suivants et le protocole de l&#39;infection est établie pour 6-bien-assiettes. Une représentation schématique du protocole est illustré à la figure 3. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mélange: Préparer 250 pi de médias OptiMEM et 6-8 pl d&#39;LPF2000 transfection par. Incuber pendant 5-10 minutes à température ambiante (RT). Pendant ce temps, préparer le mélange de transfection de plasmide. </li><li> Mélange de transfection plasmidique: Préparez le cocktail de transfection plasmidique dans 50 ul de médias OptiMEM. Nous utilisons habituellement 1 ug de chaque ADN plasmidique par la grippe sauvetage. Ajouter 1 pl des plasmides PDZ (à 1 ug / ul) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M et NS dans un tube contenant 50 ul de médias OptiMEM. </li><li> OptiMEM-LPF2000 ADN plasmidique mélange: Ajouter 250 pi de l&#39;étape 1.1 dans le mélange d&#39;ADN plasmidique de la grippe de transfection (étape 1.2). Incuber ce mélange pendant 20-30 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, préparer des suspensions de cellules 293T et MDCK pour la transfection. </li><li> Préparation de la co-culture 293T/MDCK: Avant de commencer, mettre le PBS 1X, DMEM 10% FBS 1% PS médias, et de l&#39;EDTA-trypsine mélange à 37 ° C. La densité des cellules doit être à 80-90% de confluence le jour de la transfection. Habituellement, un plat de 100 mm confluents du 293T et un plat de 100 mm confluentes de cellules MDCK peuvent être utilisés pendant 10-12 sauvetages. Nous allons utiliser 250 pl de cellules par puits. Les deux lignées cellulaires seront remises en suspension dans un total de 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1%. <ul><li> Soigneusement resuspendre chaque lignée cellulaire dans 10 ml de DMEM 10% FBS PS 1% dans un tube à centrifuger de 15 ml. Vous aurez un tube de cellules 293T et un tube de cellules MDCK. </li><li> Resuspendre les cellules 293T dans 3 ml de DMEM 10% FBS PS 1% et quand resuspendues, livrer les 3 ml pour les cellules MDCK pour resuspendre ces cellules. Cela vous donnera le mélange de cellules 293T et MDCK à utiliser pour vos co-culture. </li><li> Ajouter 250 ul de cellules par puits 293T/MDCK (10-12 6 puits puits). </li></ul></li><li> Après 20-30 minutes d&#39;incubation RT (étape 1.3), ajouter 1 ml de DMEM 10% FBS PS 1% à le mélange d&#39;ADN OptiMEM-LPF2000-grippe plasmide. </li><li> Ajouter le ml 1.3 (étape 1.5) dans les puits avec les 250 ul de cellules 293T/MDCK (étape 1.4). </li><li> Secouez la 6-bien-assiette et laisser incuber l&#39;transfection nuit (ON) dans l&#39;incubateur à 37 ° C et CO 2 5%. </li><li> Le lendemain, environ 16-24 heures post-transfection, changer le support de transfection et incuber les cellules transfectées dans BA DMEM 0,3% à 1% PS contenant 1 ug / ml de trypsine TPCK pendant 48 heures. </li><li> Après 48 heures de l&#39;évolution des médias, le transfert du surnageant des cellules transfectées dans un microtube. </li><li> Centrifuger le surnageant de culture de tissu dans une microcentrifugeuse pendant 1-2 minutes, 13000 rpm. </li><li> Infect frais cellules MDCK en plaques 6 puits (plaqué la veille) ou des oeufs de poulet de 10 jours, âgé de embryonnés avec 200 pi de centrifugé surnageants de culture tissulaire de l&#39;étape 1.10. Incuber les cellules et / ou des œufs à 37 ° C pendant 2-3 jours. <ol><li> L&#39;infection des œufs de poule de 10 jours, âgé de embryonnés: Toutes les procédures d&#39;infecter les œufs de poule embryonnés sont effectuées dans des conditions stériles. <ol><li> Bougie des oeufs de 10 jours en utilisant une vieille boîte à lumière-mirage de voir l&#39;interface entre le sac d&#39;air et de la cavité allantoïdienne. Faire une marque au crayon sur la frontière de l&#39;interface. </li><li> Avec une aiguille seringue de 5 ml faire un trou dans la coquille. </li><li> Avec une seringue de 1 ml, d&#39;infecter chaque oeuf avec 200 pi des surnageants de culture tissulaire de l&#39;étape 1.10. </li><li> Couvrir le trou dans la coquille d&#39;oeuf avec de la cire fondue en utilisant un coton-tige. </li><li> Incuber les œufs infectés à 37οC pendant 2-3 jours. </li></ol></li><li> L&#39;infection de nouvelles cellules MDCK: Le jour avant le passage du surnageant de culture tissulaire de la 293T/MDCK co-cultures, préPare plats plaque à 6 puits avec des cellules MDCK pour atteindre 80-90% de confluence lendemain. Habituellement, une plaque de culture confluente 100 mm de tissu peut être divisé en 6-8 puits. Laver les cellules deux fois avec du PBS 1X, trypsiniser et préparer les plaques à 6 puits. Secouez doucement la main les plaques afin d&#39;avoir une distribution uniforme des cellules. Culture des cellules, ON, dans les 37 ° C incubateur, 5% de CO 2. Avant l&#39;infection, vérifier les cellules sous le microscope pour confirmer une monocouche, puis procéder à l&#39;infection: <ul><li> Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS 1X. </li><li> Infecter avec l&#39;ul 200 de centrifugé surnageants de culture tissulaire pendant 1 heure à température ambiante. Ne laissez pas les piles sèches. Rock the 6-bien la plaque toutes les 10 minutes. </li><li> Après 1 heure d&#39;absorption virale, retirez le support de l&#39;infection des cellules MDCK et ajouter 2 ml de DMEM BA de 0,3% à 1% PS contenant 1 ug / ml de trypsine TPCK. </li><li> A 48-72 heures après le passage, en fonction de l&#39;efficacité de transfection et de la charge virale, un effet cytopathogène (ECP) sera observée dans les cellules MDCK infectées. CPE suggère un sauvetage réussi. Toutefois, un test HA (partie 2) doivent encore être effectués pour confirmer la présence du virus dans les surnageants de culture de tissus. </li></ul></li></ol></li><li> Récolte de liquide allantoïdien d&#39;oeufs embryonnés de poulets infectés: Toutes les procédures de récolter le liquide allantoïdien d&#39;œufs infectés sont effectuées dans des conditions stériles. Environ 8 à 12 ml de liquide allantoïdien peut être récoltée à partir de chaque œuf de 10 jours-old-infectés. Avant la récolte du liquide allantoïdien, incuber les oeufs de poulet pendant 2 heures (ou ON) à 4 ° C pour tuer l&#39;embryon de poulet et de coaguler le sang. <ul><li> Laver les coquilles avec de l&#39;éthanol à 70% pour établir des conditions stériles. </li><li> Ouvrez l&#39;œuf, avec soin, au cours de la cavité d&#39;air en tapotant avec une cuillère. Retirer la coquille cassée avec l&#39;aide de forceps. </li><li> Avec une aiguille de 1 ml, enlever la membrane allantoïdienne sans casser le jaune de l&#39;œuf. </li><li> Stabiliser l&#39;embryon de poulet avec une spatule pendant que vous guidez une pipette de 10 ml dans le liquide allantoïdien. Recueillir le liquide allantoïdien autant que possible dans un tube à centrifuger de 15 ml sur la glace dans un seau à glace sans se casser ou de recueillir toute de jaune de l&#39;œuf. Utiliser un tube à centrifuger de 15 ml pour chaque oeuf. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 4 ° C et le transfert du fluide allantoïdien (sans prendre granulés de globules rouges) à un 15 nouveaux tubes de centrifugation ml. </li><li> Stocker les tubes contenant le liquide allantoïdien centrifugé à 4 ° C jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient vérifiés pour la présence de virus récupéré avec une hémagglutination (HA) de dosage. </li></ul></li></ol> 2. Dosage de HA pour confirmer le sauvetage des virus grippaux recombinants Test d&#39;hémagglutination (HA) est couramment utilisé pour détecter la présence du virus dans les cellules MDCK sauvé surnageants de culture des tissus et / ou le liquide allantoïdien d&#39;œufs récoltés. Alternativement, des tests d&#39;immunofluorescence (IFA) peut être également effectuée. Une fois un test identifie la présence du virus a sauvé, le virus doit être purifié sur plaque et de la composition génétique du virus sera confirmée par RT-PCR et séquençage. La présence du virus dans les surnageants de culture de tissus MDCK et / ou dans le liquide allantoïdien d&#39;œufs infectés peut être déterminé en utilisant macroscopiquement HA de poulet (ou autre source) des globules rouges (RBC). La présence du virus induit hémagglutination de RBC tandis que l&#39;absence de virus permet la formation d&#39;une pastille rouge dans le fond du puits (figure 4). Dans le cas du virus de la grippe, on croit qu&#39;environ 10 3 -10 4 unités formant plaque (UFP) sont nécessaires pour donner un signal positif dans le dosage de HA, par conséquent, une PRI peut être effectuée en parallèle avec le dosage de HA pour confirmer un résultat vrai négatif. IFA avec primaire des anticorps anti-grippe est plus sensible que le test HA car moins de 103 à 104 virus peuvent être détectés avec cette technique. Il est possible que les surnageants ou liquide allantoïdien qui sont HA-négatifs sont positifs par IFA. Dans ce cas, le virus doit être amplifié par passage, à nouveau, dans les cellules MDCK ou des œufs. Liquide allantoïdien et / ou de surnageants de culture de tissus provenant du second passage doit désormais être clairement positif dans le test HA. Dosages HA sont réalisées en V-bottom plaques de 96 puits. Négative (par exemple, PBS 1X) et positive (surnageants de culture des tissus et / ou liquide allantoïdien d&#39;une infection par le virus de la grippe) des échantillons de contrôle doivent toujours être inclus dans tout dosage HA pour le valider. <ul><li> Déposer 50 ul de PBS 1X dans chaque puits de la V-96 puits à fond plat. </li><li> Ajouter 50 ul dules surnageants MDCK culture de tissus et / ou liquide allantoïdien d&#39;œufs infectés du pour le bien premier et, faire deux dilutions successives pour les puits suivants. Jeter le surplus de 50 ul du puits dernier. </li><li> Ajouter 50 ul de 0,5% -1,0% de cellules rouges du sang de poulet (préparé dans du PBS 1X) à chaque puits. </li><li> Incuber le V-96 puits à fond plat pendant 30-45 minutes (jusqu&#39;à ce qu&#39;un point rouge est visible au fond d&#39;un échantillon de PBS témoin négatif) sur la glace. Lisez et interpretate les résultats comme indiqué dans la figure 4. </li></ul> 3. Passage de surnageants de culture de tissus Un résultat négatif dans le test HA peut être le résultat de l&#39;efficacité de transfection faible avec de faibles niveaux de virus présent être dans le surnageant de culture tissulaire et / ou liquide allantoïdien. Passage de ces échantillons dans des œufs frais MDCK et / ou embryonnés permettra l&#39;amplification du virus (comme indiqué dans la figure 3) Les infections sont réalisées comme précédemment décrit dans la section 1.11.2. 4. Les résultats représentatifs Le succès de secours virus de la grippe sera confirmée par la présence d&#39;un dosage de HA positifs (figure 4). De plus, l&#39;existence de CPE dans les cellules infectées avec le surnageant de culture de tissus ou avec le liquide allantoïdien d&#39;oeufs proposera un sauvetage viral positif. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Structure de virus de la grippe: le virus de la grippe est entouré par une bicouche lipidique contenant les deux glycoprotéines virales (HA, NA) et, également, la protéine du canal ionique M2. HA est la protéine de fixation virale, responsable de la liaison à l&#39;acide sialique contenant des récepteurs. NA est responsable de la libération viral à partir de cellules hôtes. Sous la bicouche lipidique, est une protéine de la couche composée de la protéine de matrice surface de l&#39;enveloppe interne 1, M1, qui joue un rôle dans l&#39;assemblage et le bourgeonnement du virion et la protéine nucléaire exportation (NEP), requise pour l&#39;exportation nucléaire de ribonucleocapsids virale. Le noyau du virus est constitué d&#39;une ribonucléoprotéine (RNP) complexe, composé de 8 à simple brin d&#39;ARN négatif gènes viraux encapsidé par la nucléoprotéine virale NP. Associé avec le complexe RNP sont les virale ARN-dépendante ARN polymérase sous-unités PA, PB1, PB2 et. Les protéines non structurales NS1 et PB1-F2, codées par des segments d&#39;ARN du NS et PB1, respectivement, ne font pas partie de la structure du virion. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Plasmides grippe sauvetage du virus: Le virus de la grippe huit gènes clonés dans le plasmide ambisens PDZ sont indiqués. plasmidique PDZ 6, dérivé du plasmide d&#39;expression de protéines pCAGGS 7, est un vecteur plasmidique bidirectionnelle avec un ARN polymérase humaine, je promoteur et une séquence de terminaison de souris qui code l&#39;ARN génomique négative sens; en orientation opposée à la polymérase I unir, une polymérase II cassette de transcription (poulet β-actine promoteur et polyA) code pour les protéines virales à partir du même gène viral. ADNc de chaque segment viraux sont générés par RT-PCR avec des amorces avant et arrière contenant le site de Sapi endonucléase de restriction et les régions non codantes de chaque segment (boîtes noires à l&#39;extrémité des gènes viraux). Le produit de PCR est cloné dans le PDZ digéré par Sap-I. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Huit à base de plasmide système de sauvetage de la grippe: les plasmides contenant les gènes PDZ 8 virus de la grippe sont co-transfectées, en suspension, en 293T-MDCK cellules co-cultures (jour 1). Vingt-quatre heures après la transfection, les médias sans FBS, mais contenant TPCK / trypsine est remplacée (jour 2). Quarante-huit heures après avoir changé les médias, surnageant de culture tissulaire est récolté et utilisé pour infecter des cellules MDCK ou 10 jours d&#39;âge des œufs de poule embryonnés (jour 4). 48-72 heures post-amplification, les surnageants de culture de tissus provenant MDCK cellules infectées ou le liquide allantoïdien d&#39;œufs sont récoltés et analysés pour la présence du virus par HA (jour 6). Si aucun virus n&#39;est détecté, les surnageants mêmes et / ou liquide allantoïdien peut être re-passages en cellules MDCK fraîches et / ou des œufs embryonnés. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. L&#39;hémagglutinine dosage (HA): Hémagglutination de RBC par particule virale est visible macroscopiquement et est la base pour détecter les particules virales dans le surnageant de culture de tissus et / ou liquide allantoïdien. Bien que le dosage de HA ne fait aucune discrimination entre les particules virales qui sont infectieux et les particules qui sont dégradées et ne sont plus en mesure d&#39;infecter les cellules, le dosage est un bon indicateur de présence de virus dans des échantillons. A) l&#39;absence (en haut) de la présence (en bas) du virus dans les échantillons biologiques est déterminée par la présence de RBC dans le fond de l&#39;assiette ou de leur absence, respectivement. B) Un résultat représentatif à partir d&#39;un dosage de HA avec aucune des niveaux détectables de virus (en haut) ou la présence (en bas) du virus est montré.

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Mount Sinai School of Medicine a droits de propriété intellectuelle dans le domaine des virus grippaux recombinants, et AG-S est un inventeur de cette propriété intellectuelle.

Sauvetage des virus grippaux recombinants de l&#39;ADN plasmidique est un processus simple et direct une fois le protocole est systématiquement réalisée dans le laboratoire, mais au début, de multiples choses peuvent aller mal. Il est impératif d&#39;avoir une bonne préparation de plasmide pour générer le virus. Un bon entretien des lignées cellulaires (293T et MDCK) est crucial pour un sauvetage réussi virale. Traditionnellement, un marqueur génétique est inséré dans une gène de la grippe plasmide codant...

Les lignées cellulaires 293T (numéro de catalogue CRL-11268) et MDCK (numéro de catalogue CCA-34) des lignées de cellules sont maintenues dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2 dans du DMEM 10% FBS, 1% de PS. Les cellules sont disponibles sous forme de l&#39;American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, en Virginie. 20110-2209 USA). Œufs de poule embryonnés Oeufs embryonnés de poulet de 10 jours anciens peuvent être obtenus auprès de Charles River Laboratories, spécifiques d&#39;alimentation pathogènes aviaire Fee (SPAFAS) Produits et Services aviaire. Communes Franklin, 106 Route 32, au nord de Franklin, CT 06254 USA. Les œufs sont incubés à 37 ° C avant et après l&#39;infection virale. Avant et après l&#39;infection virale, les œufs sont mirés pour déterminer la viabilité des embryons. Il est très important de chercher des oeufs morts, avant et après l&#39;infection virale. Avant l&#39;infection d&#39;un œuf mort peut être facilement repéré par l&#39;absence de vaisseaux sanguins ainsi que l&#39;absence de mobilité embryon. Lorsque mirés, embryons vivants se déplacer. Après l&#39;infection virale d&#39;un oeuf mort (probablement liée à l&#39;infection du virus de la grippe) seront facilement repérés par le mauvais aspect de l&#39;œuf comme on le voit par le volume plus petit et sanglante du liquide allantoïdien. Infected-œufs sont jetés dans un double sac autoclavable et autoclavés suivant les procédures standard. Cellules de sang de poulet rouges (RBC) Poulet RBC peuvent être achetés auprès de fermes Truslow, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620. Conserver à 4 ° C. Pour les dosages HA, laver 5 ml de la RBC de poulet avec 45 ml de PBS 1X dans un tube à centrifuger de 50 ml. Centrifuger pendant 5 minutes à 1000 RPM, RT. Jeter soigneusement le surnageant et d&#39;utiliser une dilution de 1:1000 de l&#39;granulés en PBS 1X RBC (concentration finale de 0,5-1,0% RBC). Surnageants de culture de tissus et liquides allantoïdiens Les deux, les surnageants de culture de tissus et les liquides allantoïdien peut être conservé à 4 ° C pendant une courte période de temps. Après avoir confirmé le sauvetage du virus, les virus à partir de surnageants de cellules ou de fluide allantoïdien sont stockés à -80 ° C. Les plasmides Tous les plasmides sont préparés en utilisant les recommandations d&#39;un fabricant maxi kit plasmidique suivant. Tous les plasmides sont aliquot à des concentrations de 1 ug / ml dans le trou DDH 2 O et stocké à -20 ° C. Pour stockage à court terme, le plasmide peut être garder à 4 ° C. La concentration de l&#39;ADN plasmidique purifié est déterminée par spectrophotométrie à 260 nm, avec une pureté d&#39;être estimée en utilisant le ratio 260:280 nm. Préparations à 1,8 à 2,0 nm 260:280 ratios sont considérés comme affectés à des fins de sauvetage virus. De plus, la concentration et la pureté plasmidique doit être confirmé par chromatographie sur gel d&#39;agarose. Ambisens PDZ plasmides (6) contenant les huit gènes viraux de la grippe A/PR/8/34 (7) sont illustrés dans la Figure 2. Virus Le protocole décrit pour le sauvetage de la grippe A/PR/8/34 peut être effectuée sous du niveau de biosécurité (BSL) 2 conditions. Le matériel contaminé, y compris les surnageants de culture des tissus et des œufs embryonnés, doivent être stérilisés avant leur élimination. Sauvetage des virus de la grippe d&#39;autres peuvent exiger des conditions BSL supérieur et, par conséquent, des conditions particulières / mesures de sécurité devront être respectées. Milieux de culture tissulaire et des solutions DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS), et 5 ml de 100X pénicilline / streptomycine (PS). Conserver à 4 ° C. Ce support sera utilisé pour maintenir les cellules 293T et MDCK ainsi que pour les transfections. BA DMEM 0,3% à 1% PS: 495,7 ml de DMEM, 4,3 ml de 35% d&#39;albumine bovine (BA). Conserver à 4 ° C. Juste avant utilisation, ajouter la trypsine TPCK traitée à une concentration finale de 1 ug / ml. Les médias infectieuses. Phosphate 10X saline tamponnée (PBS): 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 11,5 g de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g de KH 2 PO 4. Ajouter ddH 2 O jusqu&#39;à 1 litre. Ajuster le pH à 7,3. Stériliser par autoclave. Stocker à température ambiante. PBS 1X: Diluer PBS 10X 1:10 avec ddH 2 O. Stériliser par autoclave et stocker à température ambiante.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Les efforts déployés par un certain nombre de groupes de recherche sur la grippe ont été crucial dans le développement et l&#39;amélioration de la grippe A génétique inverse du virus. Initialement créé en 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; À base de plasmide techniques de génétique inverse pour générer des virus recombinants ont révolutionné le domaine de recherche sur la grippe à cause des questions spécifiques ont été répondues par génie génétique, infectieuse, virus grippaux recombinants. De telles études incluent la réplication du virus, la fonction des protéines virales, la contribution des mutations spécifiques dans les protéines virales dans la réplication virale et / ou la pathogénie et, aussi, en utilisant des vecteurs viraux virus grippaux recombinants exprimant des protéines étrangères<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Sauvetage des virus grippaux A partir de l&#39;ADN plasmidique est une technique de base et essentiels expérimentale qui permet aux chercheurs de la grippe pour générer des virus recombinants pour étudier les multiples aspects de la biologie du virus de la grippe, et pour être utilisés comme vecteurs potentiels ou de vaccins.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

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Research

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Immunology and Infection

30.2K vues.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Sauvetage des virus grippaux A partir de l'ADN plasmidique est une technique de base et essentiels expérimentale qui permet aux chercheurs de la grippe pour générer des virus recombinants pour étudier les multiples aspects de la biologie du virus de la grippe, et pour être utilisés comme vecteurs potentiels ou de vaccins.

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Recherche

Immunologie et infection

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Purification par affinité des complexes virus de la grippe ribonucléoprotéiques de la chromatine des cellules infectées

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

L&#39;expression de l&#39;hémagglutinine recombinante fonctionnelle et la neuraminidase du virus de la nouvelle grippe H7N9 à l&#39;aide du système d&#39;expression baculovirus

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Virus de la grippe Propagation dans embryonnés de poulet Oeufs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...