Un appui a été fourni par Becton Dickinson Technologies. Les opinions exprimées dans cette présentation sont celles des auteurs et ne prétendent pas refléter la politique officielle du gouvernement des États-Unis. Des recherches ont été menées en conformité avec la Loi sur la protection des animaux et d&#39;autres lois et règlements fédéraux relatifs aux animaux et aux expériences impliquant des animaux et adhère à des principes énoncés dans le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire, Conseil national de recherches, 1996. L&#39;établissement où cette recherche a été menée est entièrement accrédité par l&#39;Association pour l&#39;évaluation et l&#39;accréditation des animaux de laboratoire Care International.

1. Collection NALT et la culture <ol><li> Euthanasier des souris en utilisant approuvé des directives IACUC. Évitez d&#39;utiliser des anesthésiques inhalés qui peuvent affecter NALT. Transfert des souris à un espace de travail ou aseptique enceinte de sécurité biologique. Retirer la mâchoire inférieure de la souris et nettoyer la zone palais supérieur avec des lingettes d&#39;alcool et de l&#39;iode. </li><li> Utilisez un n ° 11 lame chirurgicale dans la poignée bistouri à couper soigneusement et de l&#39;accise de la bouche supérieure en suivant le contour intérieur des incisives de souris et les dents molaires. </li><li> Peler délicatement le dos du palais avec une pince, en prenant soin de ne pas déchirer le palais. </li><li> Cette étape est nécessaire pour réduire la contamination des cultures et est conçu pour le traitement des palais multiples. Placer les palais dans des puits individuels dans la première colonne d&#39;une stérile de 48 puits de plaque pré-rempli avec 250 ul de milieu de culture complet (37 ° C) constitué de RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 100 ug / mL de streptomycine, 100 UI / ml de pénicilline, 50 pg / ml de gentamicineet 1 ug / ml fungizone / amphotéricine. Les médias devraient être du carbonate de tampon si palais sont cultivées dans un 5% de CO 2/95% humidité de l&#39;air incubateur (37 ° C), ou encore l&#39;utilisation de 10 mM HEPES pH 7,4, pour les non-CO 2 de la culture. </li><li> Pour laver les palais, utiliser une pince pour déplacer palais dans chaque puits successifs dans une rangée, soigneusement frappant la plaque entre les lavages, jusqu&#39;à ce que le palais a subi un total de huit lavages. </li><li> Transfert des palais dans un nouveau stérile à 48 puits plaque contenant 250 pi de frais, milieu de culture complet (37 ° C) dans les puits. </li><li> Placez les plaques contenant les palais dans un incubateur à 37 ° C pour la culture pendant toute la durée de l&#39;étude. </li><li> Prélever des échantillons pour analyse par transfert aseptique 100 ul de milieu de puits de culture dans des tubes Eppendorf toutes les 24 heures, la remplacer par 100 ul de 37 ° milieu de culture frais C. </li><li> Centrifuger les échantillons de milieux de culture à 380 xg pendant 10 minutes, 4 ° C, pour les débris de granules. </li><li> Transférer le surnageant de l&#39;échantillon centrifugé à frais tubes Eppendorf et conserver à -20 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;analyse. </li><li> Antigène spécifique IgG, IgM, et IgA, ou cytokines sécrétées sont mesurées dans les tissus de culture surnageants par la norme enzyme-linked immunosorbent (ELISA). </li></ol> 2. Ablation chirurgicale de NALT <ol><li> Femme souris BALB / c, 7 à 9 semaines d&#39;âge, sont des sujets convenables, mais d&#39;autres souches sont également acceptables. Fournir un gel comme la nourriture humide trois jours avant la chirurgie pour s&#39;acclimater à la souris substitut alimentaire et de l&#39;eau qui sera administrée en post-opération. </li><li> Administrer une goutte de médicament Metacam soulagement de la douleur (1,5 mg / ml ou 0,05 mg / goutte) dans la cavité buccale avant la chirurgie. </li><li> Anesthésier souris en utilisant approuvé des directives IACUC, par exemple, avec un kétamine, l&#39;acépromazine, et le mélange de xylazine (KAX) et appliquer la pommade sur les yeux Vet Puralube pour prévenir l&#39;assèchement. Évitez d&#39;utiliser des anesthésiques inhalés qui peuvent affecter NALT. Unenesthesia peut être confirmé par l&#39;absence de réponse réflexe à un pincement douce des orteils. </li><li> Administrer une mL de solution saline (0,9% de chlorure de sodium USP) entre les omoplates voie sous-cutanée à l&#39;aide d&#39;une aiguille de calibre 22 à 28 et la seringue pour empêcher la déshydratation potentiel de la souris après la chirurgie. En outre administrer 0,1 ml de Respiram voie sous-cutanée entre les omoplates en utilisant une aiguille de calibre 22-28 et une seringue pour promouvoir la respiration saine pendant et après la chirurgie. </li><li> Fournir un soutien thermique à la souris pendant toutes les manipulations ultérieures. </li><li> Placez la souris anesthésiée en position couchée, et d&#39;utiliser deux boucles distinctes de suture chirurgicale autour des incisives supérieures et inférieures pour détacher délicatement la bouche ouverte, exposant le palais supérieur. </li><li> Utiliser un n ° 11 lame chirurgicale pour pratiquer une incision à environ 3 mm de longueur en bas de la ligne médiane de la bouche supérieure dans le site de la NALT. </li><li> Insérez un microcurette 0,5 mm dans l&#39;incision et grattez délicatement sous les bords deperturber le NALT. </li><li> Cauterize l&#39;incision pour arrêter le saignement avec une boucle de droite bien sur une unité thermique cautérisation. </li><li> Continuer à soutenir la souris thermique tout en récupère à la pleine conscience et d&#39;activité. </li><li> Fournir la souris avec du sérum physiologique sous-cutanée jusqu&#39;à trois fois par jour, 1 ml par injection entre les omoplates, pour prévenir la déshydratation comme médicament contre la douleur nécessaire et orale une fois par jour pendant 3 jours après la chirurgie. Déterminer la déshydratation en effectuant un test tente de peau pour vérifier élasticité de la peau. Saisir la peau et du pelage entre les lames épaules de sorte qu&#39;il est tented vers le haut. Si la peau revient rapidement à la normale, la position précédente, la souris n&#39;est pas déshydraté. Si la peau reste élevée et se déplace lentement, la souris est dans un état de déshydratation et nécessite une solution saline. Fournir de la nourriture humide pendant au moins trois jours après la chirurgie afin de permettre suffisamment de temps pour la récupération. </li><li> Avant toute procédure expérimentale, d&#39;observer des souris pendant 8-10 jours en suivant le gain de poids. Reprise de poids Pauvreindique généralement la cicatrisation des palais incomplète, et ces souris devraient être retirés de nouvelles études. </li></ol> 3. Préparation NALT pour l&#39;histologie et l&#39;évaluation du succès de la chirurgie NALT <ol><li> Le succès de la chirurgie NALT doit être vérifiée par l&#39;histologie comme décrit ci-dessous. Après avoir terminé toutes les études expérimentales, de préparer des souris pour les collections du crâne par euthanasie à l&#39;aide a approuvé des directives IACUC. Évitez d&#39;utiliser des anesthésiques inhalés qui peuvent affecter NALT. </li><li> Saisir la nuque de la souris euthanasié. Retirez la mandibule inférieure du reste du crâne en les coupant à travers les processus condyliennes avec des ciseaux, des deux côtés. </li><li> À partir de la nuque du cou, enlever la peau et la fourrure du crâne par éplucher et couper lentement vers la face ventrale du crâne. </li><li> Retirez délicatement la peau autour de la région nasale et coupez la peau hors de la pointe du museau à la retirer complètement. </li><li> Détachez le crâne de l&#39;esprit vertèbressnip ha de la paire de ciseaux. </li><li> Insérer des ciseaux dans le foramen magnum et couper à mi-chemin du crâne le long de la ligne médiane pour permettre la perméation de formol dans les tissus mous lors de la fixation. </li><li> Fixer le crâne dans 10% du formol tamponné neutre (FBN) pendant 24 heures à température ambiante. </li><li> Pour détartrer, placer l&#39;échantillon et la cassette séparée, enveloppé dans de la gaze pour éviter de toucher Rexyn l&#39;os, en bouteille avec le mélange acide formique. Incuber pendant 12 heures à température ambiante, puis rincer en permanence sous l&#39;eau du robinet pendant environ 20 minutes. </li><li> Couper l&#39;échantillon à la cloison et dernières orbites de l&#39;oeil avec une lame de rasoir. </li><li> L&#39;échantillon et la cassette peuvent être stockées à court terme dans FBN 10%. </li><li> Placez l&#39;échantillon sur un processeur de tissus pour le traitement de nuit. Ceci est fait pour enlever l&#39;eau de l&#39;échantillon en cours de préparation pour inclusion dans la paraffine. </li><li> Éliminer les tissus traités, incorporer dans un bloc de paraffine avec le museau vers le bas, et le laisser refroidir. </li><li> Coupez rough 15 um sections du bloc avec un microtome automatisé, s&#39;approchant de la localisation approximative de la NALT, puis continuer à réduire en 5 sections um pour le montage sur lames de verre dans un bain d&#39;eau 44.3 ° C. </li><li> Hématoxyline et éosine (H &amp; E) coloration histologique devrait être utilisée pour évaluer l&#39;ablation NALT. </li></ol> 4. Collecte d&#39;échantillons biologiques provenant de souris 4,1 sérum <ol><li> Soigneusement élever la température du corps avec une lampe de chaleur va augmenter le flux sanguin. Prélever le sang en entaillant la veine latérale de la queue avec une lame chirurgicale. Laisser le sang couler librement dans un tube de séparation Microtainer sérum. </li><li> Appliquez une légère pression vers le pseudo avec un matériau absorbant, comme de la gaze ou une serviette, pour arrêter l&#39;écoulement du sang. </li><li> Laisser le sang coaguler dans les Microtainers pendant 30 minutes, puis centrifuger entre 6-15 x 1,000 g pendant au moins 90 secondes. </li><li> Cession séparées du sérum provenant Microtainer dans un tube propre Eppendorf pourstockage à -80 ° C. </li></ol> 4,2 salive <ol><li> Maintenez la souris anesthésiée verticalement pendant le pipetage 20-30 phosphate ul stérile tamponnée (PBS) entre la joue et la gencive. Recueillir la salive diluée en dirigeant la pointe de pipette entre la joue et la gencive. </li><li> Transférer la salive diluée dans un nouveau tube contenant 10 uL d&#39;inhibiteur de la protéase 2x et conserver à -20 ° C. </li></ol> 4.3 sécrétions nasales <ol><li> Euthanasier la souris avant de recueillir les sécrétions nasales, l&#39;aide a approuvé des directives IACUC. Évitez d&#39;utiliser des anesthésiques inhalés qui peuvent affecter NALT. </li><li> En tenant la souris verticalement, soigneusement pipette 30 ul de PBS stérile dans une narine et de recueillir de rinçage de l&#39;autre narine. </li><li> Transfert de rinçage pour un nouveau tube contenant 10 uL d&#39;inhibiteur de la protéase 2x et conserver à -20 ° C. </li></ol> 4.4 Les sécrétions vaginales <ol><li> Insérer la pointe d&#39;une micropipette dans l&#39;ouverture de ee la vulve d&#39;une souris euthanasiés, rincer le vagin avec 50 ul de PBS stérile et recueillir tous les fluides par micropipette. </li><li> Transfert de rinçage pour un nouveau tube contenant 10 uL d&#39;inhibiteur de la protéase 2x et conserver à -20 ° C. </li></ol> 5. Spécifiques de l&#39;antigène d&#39;anticorps ou de cytokines dans les échantillons recueillis peuvent être mesurée par la méthode ELISA ou une autre méthode quantitative. 6. Les résultats représentatifs La figure 1 présente un schéma général d&#39;étapes avec traitement du tissu NALT contenant pour l&#39;analyse ex vivo. La figure 2 (A, B), la taille de la bouche est représenté, ainsi que l&#39;emplacement de l&#39;incision pendant l&#39;opération d&#39;ablation (A), comme indiqué par la ligne pointillée. L&#39;emplacement de NALT sont indiquées par des flèches dans la région prémolaire sur une excisée à l&#39;hématoxyline-teinté palais dans la figure 2 (C), montrant les tissus parallèles. Figure 3présente étapes consistant à perturber l&#39;opération NALT, affichant l&#39;exposition de la bouche supérieure pour l&#39;accès à NALT (A, B), d&#39;ablation (C), et la cautérisation finale de l&#39;incision (D). Un type H et E section transversale de la zone entourant le sinus nasal NALT avant l&#39;opération est représenté sur la figure 3E, alors qu&#39;une image de la perturbation par le NALT microcurette directement après l&#39;opération apparaît dans 3F Figure. Laissant suffisamment de temps pour la récupération de la chirurgie, les incisions doivent être fermés et la cavité nasale sans NALT (Figure 3G). Typiques des résultats expérimentaux obtenus en utilisant ces techniques sont présentés dans la figure 4, comparant surnageants de culture de tissus et d&#39;échantillons biologiques à partir d&#39;une étude d&#39;un vaccin sous-unité staphylococcique (STEBVax). Les souris ont été administrés par voie intranasale STEBVax (IN) ou intrapéritonéale (IP) des routes. Le vaccin a été formulé avec un adjuvant qui active le récepteur Toll-like 4 voie 3,1<html> 4, et les contrôles ont été donnés uniquement une solution saline ou d&#39;un vaccin sans adjuvant. NALT de culture obtenu à partir de groupes expérimentaux sécrétée spécifiques de l&#39;antigène immunoglobulines dans le milieu qui était mesurable par la méthode ELISA. Dans cet exemple (figure 4A), les résultats indiquent que les plus grandes quantités d&#39;IgA ont été libérés par NALT obtenu à partir de souris vaccinées avec un vaccin DANS sous-unité combinée avec de l&#39;adjuvant. Les échantillons biologiques (tel que le sérum, la salive, les sécrétions nasales, les sécrétions vaginales) acquis auprès de commande ou NALT sans souris peuvent être utilisées pour dresser le profil du in vivo la réponse immunitaire à des antigènes nasales pour la comparaison avec les résultats de culture de tissus. Dans la figure 4B, IgA et IgG réponses à dans les vaccinations étaient significativement diminué, sans NALT fonctionnelle. Les niveaux de l&#39;antigène spécifique IgA étaient généralement supérieure à IgG dans les sécrétions des muqueuses (salive, les lavages nasaux) des souris vaccinées. upload/3960/3960fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Schéma de la collecte et la culture NALT ex vivo. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" /> Figure 2. Visualisation du palais de la souris indiquant la position d&#39;incision et la chirurgie NALT. Taille et l&#39;emplacement du palais supérieure avec incision chirurgicale notée par la ligne pointillée (A); palais supérieur excisée (B) ou teints en hématoxyline (C) pour voir le NALT parallèle dans le domaine de la prémolaire du palais (tachés de pourpre foncé sur le côté antérieur du voile du palais ). NALT indiqué par les flèches. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" /> Figure 3. Perturbations NALT chirurgicale. Les principales étapes de la chirurgie des perturbations NALT: vue en décubitus dorsal du palais de la souris supérieure avant la chirurgie (A); incision médiane faite en bouche supérieure pour accéder à la NALT (B); sonde insérée à travers microcurette incision médiane de perturber la structure NALT dansintégrité (C); la cautérisation de l&#39;incision à la conclusion de la chirurgie (D). Les images microscopiques des cavités nasales, tachés H &amp; E, avant la chirurgie (E); immédiatement après la chirurgie (F), et un succès guéri, NALT sans souris (G). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" /> Figure 4. La vaccination des anticorps spécifiques de NALT culture, de la salive, les sécrétions nasales et recueillies auprès de souris vaccinées. Souris témoins NALT-libres ou normal ont été vaccinés IN ou IP avec STEBVax, et des échantillons biologiques ont été recueillis. Les niveaux d&#39;anticorps de trois échantillons ont été mesurés par ELISA. (A) NALT ont été retirés de souris témoins (pas chirurgicalement manipulé) et cultivées pour examiner les réponses d&#39;anticorps. La réponse au vaccin spécifique IgA dans la culture pour chez les souris vaccinées était statistiquement différente de contrôles (t de Student-test, p ≤ 0,01, comparativement à aucun adjuvant ou pas de vaccin). (B) la perturbation NALT sensiblement réduit les réponses en anticorps spécifiquesà la vaccination. Il y avait des différences significatives entre les niveaux d&#39;anticorps spécifiques de NALT et NALT + groupes (pas de Chirurgie ou de contrôle) pour toutes les comparaisons à l&#39;exception des résultats IgG salivaires (t de Student-test, p ≤ 0,05).

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Nous avons présenté des méthodes collectives pour développer un modèle animal, l&#39;obtention d&#39;échantillons biologiques et des tests pour l&#39;examen des NALT associés réponses immunitaires 1-4. Il ya d&#39;autres facteurs à considérer lors de l&#39;exécution de ces méthodes. Les techniques standard stériles pour la chirurgie et de la culture de tissus doivent être suivies. Une combinaison d&#39;agents antibactériens et antifongiques utilisés lors de l&#39;isolement et la culture, ainsi que le maintien des instruments stérilisés, espace de travail, et le palais désinfectés permettra de réduire le risque de contamination. La salive, les lavages nasaux et des échantillons similaires sécrétion muqueuse doit être inspecté pour une contamination potentielle par le sang, que les anticorps sériques sont généralement trouvés dans des concentrations plus élevées. En outre, les sécrétions muqueuses ne devrait être légèrement diluée pour l&#39;analyse en raison des concentrations plus faibles d&#39;anticorps sont présents dans ces échantillons par rapport au sérum. Souris doivent être gardés au chaud directement après la chirurgie pour préévacuer le potentiel anesthésie induite par l&#39;hypothermie. Autres souris de repos sur leurs côtés lors de récupération post-chirurgicale afin de minimiser une respiration irrégulière. La procédure chirurgicale est plus efficace avec trois personnes qui travaillent ensemble pour accomplir ces tâches: l&#39;un effectuant la chirurgie, l&#39;un pour aider à la tenue de la bouche ouverte, et l&#39;autre pour fournir des soins post-chirurgicaux que les souris de récupérer de l&#39;anesthésie. Il est nécessaire d&#39;utiliser une coloration H &amp; E de crâniens des sections transversales à la fin de toutes les procédures expérimentales ou des études pour vérifier le succès de la chirurgie pour chaque souris. Résultats de la chirurgie sont possibles: l&#39;ablation totale et bilatérale NALT, l&#39;ablation incomplète, ou NALT intacte. Parce que tous les chirurgies se traduira par la perte complète de la NALT, les animaux avec NALT résiduelle ou intacte peut être utilisé comme contrôles internes. Un autre résultat potentiel est que la bouche échoue pour guérir complètement, en laissant une ouverture reliant l&#39;nasale et les cavités buccale. Incompletla guérison du palais se traduira par un faible poids et retard staturo-pondéral, et ces personnes doivent être retirés à partir d&#39;études. L&#39;examen des réponses du premier vaccin avec le modèle de la souris servent à établir un rôle à jouer dans la NALT résultats de l&#39;étude prévue (réponse en anticorps, à la survie, etc.) L&#39;ablation chirurgicale du NALT facilite la détermination des contributions nasales à l&#39;immunité locale et systémique. L&#39;approche chirurgicale décrite ici est la méthode la plus directe pour l&#39;obtention d&#39;un modèle de souris dépourvues de NALT. Sélectionnez knock-out des modèles de souris ont été signalés à NALT absence, mais ces animaux sont aussi déficientes en cytokines ou chimiokines essentiels pour le développement d&#39;autres tissus lymphoïdes secondaires, et peut héberger des défauts supplémentaires 12,13. En outre, les méthodes décrites ici ont été élaborés pour examiner plusieurs aspects de la réponse immunitaire au sein originaires des fosses nasales. Nos résultats expérimentaux sont basées sur des études utilisant le Palat toute la partie supérieuree de la souris pour la culture de tissus, mais il est possible que les articles peuvent être utilisés. Enfin, le modèle NALT culture est utile pour réaliser des expériences complètement dans la culture de tissus.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Le numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> En acier inoxydable stériles lames chirurgicales, n ° 11 </td><td> Miltex </td><td> 4-311 </td><td></td></tr><tr><td> Manche du couteau, n ° 3 </td><td> Miltex </td><td> 4-7 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 48 puits de culture cellulaire </td><td> Costar </td><td> 3548 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin, inactivé par la chaleur </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 16000-044 </td><td> Final Conc: 10% en volume dans les milieux de culture </td></tr><tr><td> Sulfate de streptomycine </td><td> Sigma </td><td> S9137 </td><td> Final Conc: 100 pg / mL </td></tr><tr><td> Pénicilline </td><td> Sigma </td><td> P7794 </td><td> Conc final: 100 UI / ml </td></tr><tr><td> La gentamicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1397-10ML </td><td> Final Conc: 50 pg / ml </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td> Final Conc: 1 ug / ml </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H0887 </td><td> Conc final: 10 mM </td></tr><tr><td> Tubes à centrifuger Eppendorf </td><td> Eppendorf </td><td> 022364111 </td><td></td></tr><tr><td> Nutra-gel alimentaire cerise souris aromatisé Wet </td><td> Bio-Serve </td><td> S4798-PLATEAU </td><td></td></tr><tr><td> Metacam </td><td> Boehringer Ingelheim </td><td> 601531000 </td><td> Une goutte de 1,5 mg / ml suspension orale </td></tr><tr><td> La kétamine </td><td> Pfizer </td><td> 00856440301 </td><td> Co finalnc: 6,06 mg / ml </td></tr><tr><td> Acépromazine </td><td> Vedco </td><td> VEDC207 </td><td> Conc final: 0,061 mg / ml </td></tr><tr><td> La xylazine </td><td> Lloyd </td><td> 4811 </td><td> Final Conc: 0,667 mg / ml </td></tr><tr><td> Pommade Vétérinaire Puralube </td><td> De la santé animale Pharmaderm </td><td> 1621 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% USP pour injection de chlorure de sodium </td><td> Baxter </td><td> 2B1302 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 mm Microcurette </td><td> Roboz </td><td> RS-6350 </td><td></td></tr><tr><td> Unité cautérisation thermique </td><td> Geiger </td><td> 150-S/150A-S </td><td></td></tr><tr><td> Embout de remplacement TCU, Droit boucle fine </td><td> Geiger </td><td> 214 </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux chirurgicaux </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10% formol neutre tamponné </td><td> Sigma </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acide formique </td><td> Pêcheur </td><td> A119P-4 </td><td> Mélanger 426 ml d&#39;acide formique dans l&#39;eau du robinet 1047 ml, puis ajouter 45 ml Rexyn 101 (H) </td></tr><tr><td> Rexyn 101 (H) </td><td> Pêcheur </td><td> R231-500 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek VIP E150/E300 </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microtome rotatif </td><td> Leica </td><td> RM2255 </td><td></td></tr><tr><td> Hématoxyline de Mayer </td><td> Sigma </td><td> MHS16-500ML </td><td></td></tr><tr><td> Gill N ° 1 hématoxyline </td><td> Sigma </td><td> GHS116 </td><td></td></tr><tr><td> Éosine B </td><td> Sigma </td><td> 2853 </td><td></td></tr><tr><td> Microtainer Sérum Separator </td><td> BD Médical </td><td> 365956 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaH 2 PO 4, NaCl 140 mM, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Cocktail d&#39;inhibiteur de protéase, de l&#39;EDTA-libre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78415 </td><td></td></tr></tbody></table>

examining the role of nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissue (nalt) in mouse responses to vaccines

Les tissus du nasopharynx-lymphoréticulaire associé (NALT) trouvées chez l&#39;homme, les rongeurs et autres mammifères, de contribuer à l&#39;immunité dans les sinus nasaux 1-3. Le NALT sont deux parallèles en forme de cloche structures situées dans les voies nasales au-dessus du palais dur, et sont généralement considérés comme des composants secondaires du système lymphoïde associé muqueuse 4-6. Situé dans le NALT sont des compartiments distincts de lymphocytes B et T entrecoupés de cellules présentatrices d&#39;antigène dendritiques 4,7,8. Ces cellules sont entourées par une couche de cellules épithéliales intercalées avec M-cellules qui sont responsables de la récupération d&#39;antigène de la surface des muqueuses des voies aériennes 9,10. Lymphocytes naïfs circulant à travers le NALT sont prêts à répondre à des premières rencontres avec des agents pathogènes respiratoires 7. Alors que NALT disparaissent chez l&#39;homme à l&#39;âge de deux ans, les organes de l&#39;anneau de Waldeyer lymphatiques et même structuré persistent eroughout la vie 6. En revanche pour les humains, les souris de conserver NALT long de la vie, fournissant ainsi un modèle animal idéal pour l&#39;étude des réponses immunitaires ayant leur origine dans les sinus nasaux 11. Les cultures de suspensions unicellulaires de NALT ne sont pas pratiques en raison de la faiblesse des rendements de cellules mononucléées. Toutefois, la biologie NALT peut être examiné par la culture ex vivo de l&#39;organe intact, et cette méthode présente l&#39;avantage supplémentaire de maintenir la structure du tissu naturel. Pour les études in vivo, les modèles knockout génétiques présentant des défauts limités à NALT ne sont pas actuellement disponibles en raison d&#39;une mauvaise compréhension de la voie de développement. Par exemple, alors que la lymphotoxine-alpha souris knock-out sont atrophiés NALT, les plaques de Peyer, les ganglions lymphatiques périphériques, les cellules dendritiques folliculaires et d&#39;autres tissus lymphoïdes sont également modifiées dans ces souris génétiquement manipulées 12,13. Comme une alternative à la souris knock-out de gènes, p ablation chirurgicaleélimine ermanente NALT du passage nasal sans affecter d&#39;autres tissus. Le modèle de souris qui en résulte a été utilisé pour établir des relations entre les réponses NALT et immunitaire aux vaccins 1,3. La collecte de série de sérum, la salive, les lavages nasaux et les sécrétions vaginales est nécessaire pour établir la base de réponses de l&#39;hôte à la vaccination, tandis que les réponses immunitaires provenant directement NALT peut être confirmé par culture de tissus. Les procédures suivantes décrivent les interventions chirurgicales, la culture de tissus et d&#39;échantillons nécessaires pour examiner locales et systémiques des réponses immunitaires humorales à intranasale (IN) la vaccination.

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Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Méthodes pour examiner les contributions des tissus du nasopharynx-lymphoréticulaire associé (NALT) à nasaux et des réponses immunitaires aux vaccins de souris par voie intranasale sont décrits. Nous démontrons une intervention chirurgicale pour mettre en place un modèle de souris NALT-dépendante et<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultures de NALT extrait.

Examen du rôle du tissu lymphoréticulaire nasopharynx associée (NALT) dans les réponses de la souris pour les vaccins

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

25.4K vues.  U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. Méthodes pour examiner les contributions des tissus du nasopharynx-lymphoréticulaire associé (NALT) à nasaux et des réponses immunitaires aux vaccins de souris par voie intranasale sont décrits. Nous démontrons une intervention chirurgicale pour mettre en place un modèle de souris NALT-dépendante et Ex vivo Cultures de NALT extrait.

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mesure de la charge bactérienne et les réponses immunitaires chez des souris infectées avec des Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Recherche

Immunologie et infection

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Administration intranasale de vaccins contre la grippe recombinant chimérique dans les modèles de souris pour étudier l&#39;immunité muqueuse

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle de mesure de réponses immunitaires contre le paludisme dans le contexte du VIH co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

Visualisation des Twitching motilité et caractérisation du rôle de la<em&gt; Pilg</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modèle de souris transmissible transitoirement IL-8 pour le<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi à long terme des réponses inflammatoires

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

La surexpression et la purification de l&#39;être humain<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransférase dans<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Vaccination de poisson-zèbre adulte pour la projection préclinique des vaccins basés sur l’ADN

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Évaluation des réponses de l’hôte-pathogène et l’efficacité du vaccin chez la souris

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...