NGL a été soutenu par l&#39;Initiative de l&#39;Université Wayne State périnatale en maternelle, périnatale et santé de l&#39;enfant. Nous tenons à remercier Maureen McGerty et Amy E. Furcron (Wayne State University) pour leur lecture critique du manuscrit.

Avant de travailler avec les échantillons mentionnés dans le présent protocole, l&#39;approbation éthique animale doit être donné par le Comité d&#39;éthique de la recherche locale et les Institutional Review Boards. Lorsque vous travaillez avec du sang animal, cellules, ou des agents dangereux tel que mentionné dans ce protocole, les actions appropriées en matière de biosécurité et de sécurité de laboratoire doivent être respectées. 1. Manipulation Mouse et collecte de tissus <ol><li> Préparer un poste de travail stérile et obtenir des outils stériles pour la collecte de tissus. Ces outils incluront des grands et petits ciseaux chirurgicaux, pinces et pinces à pointe fine. Inclure de petites boîtes de Petri marquées avec les noms des tissus appropriés, remplis de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) solution (3-5 ml) équilibrée à la température ambiante (20-22 ° C). Inclure aussi une grande boîte de Pétri, sans étiquette, rempli de solution 1x PBS (10 - 15 ml). </li><li> Euthanasier une souris enceinte (de 10,5 à 19,0 jours après le coït (DPC) ou avant la livraison) en utilisant du dioxyde de carbone (CO 2). Pour veiller à ce que la souris est euthanasié, utiliser la technique de la dislocation cervicale. Remarque: Avant 10,5 dpc, il est difficile de séparer manuellement les tissus déciduales à partir des tissus utérins. Si l&#39;isolement des leucocytes déciduales est pas nécessaire, leucocytes à partir des tissus de l&#39;utérus de souris non enceintes ou à partir de souris &lt;10,5 dpc peuvent également être effectuées en suivant le protocole. </li><li> En utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux stériles, supprimer complètement la partie inférieure de l&#39;abdomen de la peau et du tissu musculaire. Avec des pinces, écarter tous les autres organes que l&#39;utérus et les ovaires sont visibles. Avec l&#39;utérus encore attaché, utilisez la pince pour le déplacer à l&#39;extérieur de la cavité péritonéale (figure 1A). </li><li> Repérez les ovaires distales à l&#39;oviducte et utéro jonction de chaque corne utérine. En utilisant les petits ciseaux chirurgicaux, faire une incision à la jonction utéro et séparer les cornes utérines de la mésentère contenant les vaisseaux utérins; puis,accise au niveau du col de détacher les cornes utérines de la cavité péritonéale (figure 1B). </li><li> Avec de petits ciseaux chirurgicaux, faire une incision entre le col et le segment inférieur des cornes utérines. Congé attaché une partie du col de l&#39;utérus au cours de ce processus (figure 1C) pour éviter d&#39;ouvrir la corne utérine. </li><li> Immerger les cornes utérines (y compris le col de l&#39;utérus) dans une grande boîte de Pétri remplie de solution PBS 1x (10-15 ml) pour hydrater les sites d&#39;implantation. </li><li> Alors qu&#39;il était encore plongé dans une solution PBS 1x, couper tout le gras des cornes utérines avec les petits ciseaux chirurgicaux. Gardez les tissus immergés dans une solution de PBS 1x long de la dissection. </li><li> En tenant les cornes utérines en place avec la pince, retirer l&#39;un des sites d&#39;implantation de l&#39;utérus avec une coupe transversale à travers la région inter-implantation, en utilisant les petits ciseaux chirurgicaux (figure 1D). Le site d&#39;implantation contient le foetus, entouré par lamembrane chorioallantoïque, et l&#39;utérus, décidual, et des tissus placentaires. </li><li> Utilisation de la pince, maintenez le site en place et de faire une petite incision dans la paroi utérine à côté de la barrière placentaire et les tissus déciduales (figure 1E). Garniture autour du périmètre du placenta / caduque jusqu&#39;à ce que ceux-ci sont séparés de tous les deux la paroi utérine et de la membrane chorio-allantoïde qui comprend le fœtus (figure 1F). </li><li> Retirez le placenta et les tissus déciduales attachés et le placer dans une solution de PBS 1x (3 - 5 ml; voir l&#39;étape 1.12). </li><li> Placez le fœtus entouré par la membrane chorio-allantoïde fixé aux tissus de l&#39;utérus dans une boîte de Pétri remplie de solution 1 x PBS (3-5 ml). L&#39;hydratation de ces tissus facilite la séparation de la membrane chorio-allantoïde de la paroi de l&#39;utérus (voir l&#39;étape 1.14). </li><li> En utilisant une paire de pinces à pointe fine, retirez délicatement le tissu décidual (couche gris-blanc) à partir de la surface placentaire. Effectuez cetteétape avec soin pour maintenir l&#39;intégrité de la barrière placentaire et les tissus déciduales (figure 1G). </li><li> Placez le placenta et les tissus déciduales dans deux boîtes de Petri marquées séparément remplis de solution de PBS 1x (3 - 5 ml chacune). </li><li> Retirez délicatement la paroi utérine de la membrane chorioallantoïque avec des pincettes à pointe fine. Ce sont les tissus utérins. </li><li> Placer les tissus utérins dans une boîte de Pétri remplie de solution 1 x PBS (3-5 ml). </li><li> Répéter les étapes à travers 1,8 1,15 jusqu&#39;à ce que tous les sites d&#39;implantation ont été traitées. </li><li> Recueillir plusieurs utérine, décidual, et des tissus placentaires pour améliorer le rendement des cellules pendant la digestion enzymatique. La quantité de tissus dépend de la taille de la portée; Cependant, l&#39;isolement des leucocytes nécessite&gt; 2 morceaux de tissu. Remarque: Pour des informations plus détaillées sur la dissection des sites d&#39;implantation sur les différents jours de gestation, voir les images trouvées dans le chapitre deux du Guide de Investigatisur la grossesse de la souris 42. </li></ol> 2. utérin, déciduale, et de dissociation des tissus placentaires <ol><li> Étiqueter plusieurs 2 ml stériles tubes coniques avec le nom de tissu approprié, et placer un flacon avec 1 000 pi de solution enzymatique sur la glace. </li><li> De la boîte de Pétri remplie de solution PBS 1x, transférer deux pièces (100 - 150 mg) de l&#39;utérus, déciduale, tissus placentaires ou à un tube conique de 2 ml étiqueté. </li><li> Ajouter 500 pi de solution enzymatique froid dans chacune 2 ml tube conique. </li><li> Avec des ciseaux stériles fines, commencent à dissocier le tissu plongé dans la solution enzymatique jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit finement hachée. Au fil du temps, la suspension sera de développer un aspect laiteux. Cette étape ne doit pas dépasser de plus de 2 min pour éviter une sur-manipulation de l&#39;échantillon. </li><li> Une fois que le tissu a été dissocié, ajouter un supplément de 500 ul de solution enzymatique à froid le tube conique de 2 ml. </li><li> Placer le tube conique de 2 ml sur la glace. </li><li> Répétez les étapes 2.2 à 2.6 avec chaque tissu personne jusqu&#39;à ce que tous les tissus ont été traités. </li><li> Transférez tous les 2 ml tubes coniques avec tissu homogénéisé (tissu haché + solution enzymatique) des échantillons de la glace dans un incubateur à 37 ° C et effectuer une agitation orbitale douce (80 rpm). Incuber pendant 30 - 35 min. Assurez-vous que la température de l&#39;incubateur est stabilisé avant de commencer le temps d&#39;incubation. </li><li> Après incubation, enlever les 2 ml tubes coniques avec des tissus dissociées de l&#39;incubateur et les placer sur la glace pour empêcher toute nouvelle digestion. </li><li> Étiquette stériles de 50 ml tubes coniques en fonction du type de tissu. Enlever les couvercles et les remplacer par un tamis cellulaire stérile (100 um de taille de pores). </li><li> Pour les tissus dissocié du 2 ml tubes coniques à travers le tamis cellulaire en utilisant ~ 20 ml de solution PBS 1x. Les fragments de tissu restent dans le filtre de la cellule et la suspension de cellules passeront à travers elle. </li><li> Laver le dissociated tissus dans le tamis cellulaire 2 - 3 reprises avec 20 ml d&#39;une solution 1 x PBS à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. </li><li> Rincer les vides 2 ml tubes coniques avec une solution PBS 1x (1 ml) et verser le contenu à travers les filtres de cellules. </li><li> Retirez les crépines de cellules de 50 ml tubes coniques et remplacer les couvercles. Centrifuger les tubes à 1250 g pendant 10 min à 4 ºC. </li><li> Avec précaution, aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Le culot cellulaire contenant les leucocytes et les cellules stromales isolées. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu de culture RPMI sans sérum bovin fœtal (FBS). Mélanger délicatement. Ne pas utiliser vortex. </li><li> Ajouter 500 pl de FBS ordonnées dans un tube en plastique de polystyrène de 5 ml et recouvrir lentement la suspension cellulaire. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 1100 x g sans le frein à la température ambiante pour obtenir un culot de cellules viables tout débris cellulaire est retenue à l&#39;interface PBS / FBS. </li><li> Aspirer le surnageant sans toucher le culot cellulaire. Le cell pastille contient principalement des cellules viables. </li><li> Optionnellement: Pour concentrer les cellules mononucléaires, utiliser une solution de polysaccharide saturée à 20%, comme décrit ci-dessous. <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 000 ul de milieu de culture RPMI sans SVF. </li><li> Ajouter 1 ml de solution à 20% de polysaccharide saturée à un tube de 5 ml en matière plastique et polystyrène superposer lentement la suspension cellulaire au-dessus de cette solution, conformément aux instructions du fabricant. Bien que la stratification de l&#39;échantillon, éviter de mélanger la solution de polysaccharide saturée à 20% avec la suspension de cellules. </li><li> Centrifugeuse avec un rotor swing-out à 500 g pendant 30 min à température ambiante sans frein. Il est très important pour désactiver le frein pour éviter de mélanger les cellules et de perdre le gradient. Les cellules mononucléaires se trouvent dans l&#39;interface entre la solution de polysaccharide saturée à 20% et la solution PBS 1x. </li><li> Aspirer et jeter le surnageant. Le culot cellulaire contenant des cellules mononucléaires principalement. NonTE: Pour effectuer la viabilité coloration et une coloration intracellulaire, voir l&#39;étape 3. Pour effectuer immunophénotypage, voir l&#39;étape 4. Pour effectuer la viabilité coloration et une coloration extracellulaire seulement, voir l&#39;étape 5. Pour effectuer une culture de cellules de leucocytes isolés, voir l&#39;étape 6. Pour effectuer tri magnétique de cellules, voir l&#39;étape 7. </li></ol></li></ol> 3. Viabilité coloration pour les cellules fixable <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 100 ul de solution PBS 1x. Mélanger délicatement à l&#39;aide d&#39;une micro-pipette. </li><li> Transférer 100 pl de la suspension cellulaire dans un tube de 5 ml en matière plastique de polystyrène. Ajouter 400 ul de solution PBS 1x au tube de polystyrène de 5 ml. Ce tube est un contrôle pour le tissu auto-fluorescence. Stocker à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;étape 3.5. </li><li> Transférer les 1000 ul restants de la suspension de cellules dans un nouveau tube de plastique polystyrène de 5 ml. Ajouter 1 pi de colorant de la viabilité et homogénéiser doucement. Incuber pendant 30 min à l&#39;obscurité à 4 ºC. </li><li> Après incubation, ajouter &amp; # 1000181; l de solution PBS 1x. Mélanger délicatement à la main. </li><li> Centrifugeuse deux 5 ml Les tubes en plastique polystyrène (étapes 3.2 et 3.3) à 1250 g pendant 10 min à 4 ºC. Aspirer et jeter le surnageant. Remarque: le culot de cellules (étape 3.3) est utilisé dans l&#39;étape 4. Le culot de cellules (étape 3.2) servira de contrôle de tissu auto-fluorescence. </li></ol> 4. Immunophénotypage <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 50 ul d&#39;anti-souris CD16 / CD32 (dilué 1: 100 dans du tampon FACS [0,1% de BSA, de l&#39;azide de sodium à 0,05%, solution 1 x PBS, pH 7,4]). Mélanger délicatement la suspension cellulaire. Ne pas utiliser le vortex. </li><li> Incuber la suspension de cellules dans le tube de polystyrène de 5 ml dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 50 ul de chaque anticorps monoclonal anti-leucocyte réagir avec les marqueurs de la surface cellulaire ou extracellulaire anticorps de contrôle correspondant à l&#39;isotype (dilutions d&#39;anticorps doivent être validées). Par exemple, pour analyser les sous-populations de leucocytes, en utilisant anti-moutiliser des anticorps réagissant avec les marqueurs de surface des leucocytes CD45 suivants: cellule, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, et CD8 (Tableau 1). </li><li> Une fois que des anticorps dirigés contre des marqueurs extracellulaires ont été ajoutés au tube plastique polystyrène de 5 ml, mélanger délicatement. Incuber dans l&#39;obscurité pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Au cours de cette incubation, préparer et préchauffer la solution de tampon de fixation (dilué avec de l&#39;eau désionisée, 1: 5) à 37 ° C, si nécessaire. Gardez le tampon à 37 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce que son utilisation est nécessaire. </li><li> Après 30 minutes d&#39;incubation, ajouter 500 pi de tampon FACS dans le tube plastique polystyrène de 5 ml et mélanger délicatement. Cette étape est nécessaire pour laver les cellules et enlever tout excès d&#39;anticorps non lié. </li><li> Centrifuger les échantillons à 1250 g à 4 ° C pendant 10 min. Aspirer et jeter le surnageant. Remarque: Si une coloration intracellulaire est pas nécessaire, voir l&#39;étape 5. Si une coloration intracellulaire est nécessaire, effectuer perméabilisation et intracellulairecoloration parti- ici, et puis procéder à la fixation (étape 4.8). </li><li> Ajouter 500 ul de la solution tampon préchauffé de fixation pour le culot de cellules et incuber dans l&#39;obscurité pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Distribuer 500 pl de tampon FACS dans le tube en matière plastique de polystyrène de 5 ml. Mélanger délicatement. </li><li> Centrifuger les échantillons à 1250 g à 4 ° C pendant 10 min. Aspirer et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 500 pl de tampon FACS à chaque échantillon. Ces échantillons peuvent maintenant être analysées par cytométrie de flux. Acquérir les échantillons immédiatement pour de meilleurs résultats. </li></ol> 5. Viabilité coloration pour les cellules unfixable <ol><li> Après immunophénotypage extracellulaire, remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon FACS. </li><li> Ajouter 1 pi de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI, 200 ug / ml) juste avant l&#39;acquisition de l&#39;échantillon. </li><li> Visualisez les échantillons dans 1 - 2 min après l&#39;ajout DAPI l&#39;aide d&#39;un cytomètre de flux. </li></ol><ol><li> Préparer un poste de travail sous une hotte stérile. Pré-réchauffer le milieu de culture RPMI à 37 ° C en utilisant un bain d&#39;eau. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 000 ul de tampon pour FACS pour le comptage des cellules. </li><li> Comptez le nombre de cellules viables à l&#39;aide d&#39;un compteur automatique de cellules ou hémocytomètre et solution de bleu trypan 0,4%, suivant les instructions du fabricant. Enregistrez le nombre total de cellules vivantes. </li><li> Centrifuger les cellules à 1250 x g à 4 ° C pendant 10 min pour éliminer le tampon FACS. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de milieu de pré-culture RPMI chauffé en pipettant doucement 2 à 3 fois. </li><li> Plaque le nombre désiré de cellules dans une plaque de 24 puits stérile et incuber à 37 ° C. Le temps d&#39;incubation est déterminée par la question de recherche. </li></ol> 7. magnétique Tri cellulaire <ol><li> Mettre en place un poste de travail propre avec les matières suivantes: colonnes MS, séparateur magnétique de cellules, 15ml tubes coniques, 30 um filtres de pré-séparation, et un multi-support. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon MACS (0,5% de BSA, 2 mM d&#39;EDTA, solution 1 x PBS, pH 7,2). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un compteur de cellules automatique ou hémocytomètre et solution de bleu de trypan 0,4%, compter et enregistrer le nombre total de cellules vivantes. </li><li> Centrifuger les cellules à 1250 x g à 4 ° C pendant 10 min. Aspirer et jeter le surnageant. Ajouter un autre 500 pi de tampon MACS. </li><li> Passez à effectuer la séparation magnétique suivant les recommandations du fabricant. </li><li> Déterminer la pureté par cytométrie en flux ou microscopie. </li></ol>

Les auteurs décrivent aucun conflit d&#39;intérêt.

La collecte de données cohérentes qui enregistre les caractéristiques de l&#39;abondance et phénotypiques de leucocytes infiltrants à l&#39;interface materno-fœtale est essentielle pour comprendre la pathogenèse des complications liées à la grossesse. Plusieurs techniques ont été décrites qui facilitent l&#39;isolement de l&#39;infiltration des leucocytes à partir des tissus murins à l&#39;interface materno-fœtale pendant la grossesse 31,38,39,43-46. Cependant, chacune de ces techniques est dif...

La tolérance immunitaire à la grossesse est une période pendant laquelle se produisent les changements distincts dans le système immunitaire de la mère. Ces changements permettent à la mère de tolérer le fœtus, une greffe allogénique semi-1. Le fœtus exprime paternelle complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) 2, et les cellules foetales ont été trouvés dans la circulation maternelle 3; Cependant, le fœtus ne soit pas rejeté 4,5. Cette énigme est pas entièrement comprise. L&#39;hypothèse la plus récente indique que la tolérance materno-fœtale est créé pendant le coït et la fécondation 6,7 et maintenu pour soutenir une grossesse à terme 8-10. Une ventilation de cette tolérance foeto-maternelle est considéré comme un mécanisme de la maladie au cours des premiers et derniers stades de la grossesse 10-16. La tolérance foeto-maternelle implique la participation de diverses sous-populations de leucocytes, y compris les cellules T (cellules T régulatrices, les cellules Th1, Th2, et les cellules Th17), Macrophages, les neutrophiles, les mastocytes, les cellules NK et les cellules NKT, les cellules dendritiques et les cellules B, que le changement de la densité et de la localisation pendant la grossesse 15,17-19. La tolérance materno-fœtale est enrichi à l&#39;interface materno-fœtale 20 - le site anatomique où le système immunitaire de la mère interagit avec les antigènes foetaux 20,21. L&#39;interface materno-fœtale est créé lors de la placentation lorsque les cellules du trophoblaste extravilleux fœtales envahissent la muqueuse utérine 22-24. Sur le côté fœtal de cette interface, les membranes entourant le fœtus créer une surface épithéliale spécialisé du placenta, et les cellules syncytiotrophoblaste contrôler l&#39;échange des nutriments par leur contact direct avec le sang maternel 22. Du côté de la mère de l&#39;interface, la caduque recrute une piscine hétérogène de leucocytes chez les souris qui représentent 30% à 50% de toutes les cellules déciduales. En plus de leur participation à Materntolérance immunitaire al, ces cellules sont les principaux contributeurs à différents processus pendant la grossesse, par exemple., la protection de l&#39;appareil reproducteur des infections, la fécondation, l&#39;implantation d&#39;embryons 7,25, l&#39;angiogenèse décidual 26, le remodelage vasculaire 24,27, l&#39;invasion du trophoblaste 28, placentaire 24,25 développement, et, finalement, le travail et la livraison 15,17. Par conséquent, l&#39;étude des leucocytes impliqués dans la tolérance foeto-maternelle est essentielle pour élucider la pathogenèse des complications liées à la grossesse. Bien que l&#39;utilisation de l&#39;immunohistochimie et l&#39;immunofluorescence a généré des données pour la visualisation directe et la localisation de l&#39;utérus, déciduale, ou leucocytes 29,30 placentaires, l&#39;analyse par cytométrie en flux a révélé en outre des sous-ensembles spécifiques de leucocytes dans chacun de ces tissus 31,32. En outre, la cytométrie en flux a été utilisée pour déterminer la densité et la proportion de materInterface nal-fœtale leucocytes 33 et d&#39;expression des niveaux de protéines extracellulaires et intracellulaires 8-10,34. Analyse des flux cytométrique des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale nécessite une suspension à cellule unique. Afin d&#39;isoler les leucocytes infiltrants du déciduale, de l&#39;utérus et les tissus placentaires, deux méthodes de dissociation de tissus ont été utilisées: mécanique et enzymatique. Les deux procédés permettent la séparation des leucocytes infiltrés de la matrice extracellulaire (ECM) de ces tissus. Dissociation enzymatique du tissu est supérieure à la dissociation mécanique de tissu, car elle permet un rendement plus élevé de leucocytes avec des dommages moins cisaillement de force associé 35. Par conséquent, la dissociation de tissu mécanique nécessite la mise en commun des tissus 36, ce qui peut augmenter la variabilité et l&#39;hétérogénéité des échantillons. Cependant, la dissociation mécanique peut être le choix lorsque l&#39;antigène d&#39;intérêt peut être modifiée par dissociation enzymatique ou lorsque la fonctionnalité de la cellules d&#39;intérêt doivent être préservées (par ex., la cytotoxicité des cellules NK) 35. L&#39;utilisation de la protéolyse avec des enzymes spécifiques à dégrader l&#39;ECM élimine les faibles rendements observés avec dissociation mécanique. Plusieurs études ont rapporté l&#39;utilisation de la trypsine 32, 37 collagénase, DNase 31, Dispase 38, et des cocktails commerciales de divers enzymes 32,39. Cependant, la nature et la concentration des différentes enzymes et la durée de digestion doivent être soigneusement définies et validées en vue d&#39;assurer le maintien de l&#39;intégrité des epitopes antigéniques de la surface des cellules requises pour l&#39;immunophénotypage. Les différentes structures de surface sont différentiellement sensibles à la destruction par différentes enzymes, avec des enzymes telles que la trypsine, qui est connu pour le décapage des épitopes de surface des leucocytes reconnus par de nombreux anticorps monoclonaux. Introduit le présent mémoire est un procédé utilisant un proteolytic et cocktail enzymatique collagénolytique, appelé Accutase. Cette solution enzymatique est assez doux tout en performant à dissocier tissus murins à l&#39;interface materno-fœtale, et ne nécessite pas l&#39;ajout d&#39;autres réactifs ou du sérum de dissociation de mettre fin à la réaction de dissociation. En outre, il est prêt à être utilisé tel que fourni et, bien que le temps de dissociation doit être validé, il est plus robuste que les enzymes mentionnées ci-dessus 40,41. L&#39;utilisation d&#39;une combinaison des deux types de désagrégation du tissu améliore la qualité et la quantité de cellules obtenues; Ainsi, plusieurs études ont mis en œuvre l&#39;utilisation combinée de dissociation mécanique et enzymatique avec des résultats satisfaisants 31,32,37. Le protocole décrit ici a été établie et validée dans notre laboratoire; il utilise une combinaison d&#39;une dissociation mécanique douce suivie d&#39;une décomposition enzymatique solide. Ce protocole permet l&#39;étude d&#39;isolement et continue desles leucocytes infiltrants dans les tissus murins à l&#39;interface materno-fœtale (utérus, caduque, et le placenta). Le protocole suivant maintient également l&#39;intégrité des marqueurs de surface cellulaire et des rendements de cellules viables suffisant pour les applications en aval tel que démontré par une analyse par cytométrie de flux. Enfin, ce protocole maintient la cohérence de préparation de cellules pour l&#39;analyse et la comparaison des différents tissus murins composant l&#39;interface materno-fœtale.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Magentic Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre separation filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe lock conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Anti-mouse extracellular antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
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			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
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			<td></td>
			<td></td>
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		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
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			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
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			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
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			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

La tolérance immunitaire pendant la grossesse nécessite que le système immunitaire de la mère subit des changements distinctifs afin d&#39;accepter et de nourrir le foetus de développement. Cette tolérance est initiée pendant le coït, établi au cours de la fécondation et l&#39;implantation, et maintenu pendant toute la grossesse. Médiateurs actifs cellulaires et moléculaires de la tolérance foeto-maternelle sont enrichis sur le site de contact entre les tissus foetaux et maternels, connus sous le nom de l&#39;interface materno-fœtale, qui comprend le placenta et l&#39;utérus et des tissus déciduales. Cette interface est composée de cellules stromales et leucocytes infiltrants, et leurs caractéristiques d&#39;abondance et phénotypiques changer au cours de la grossesse. Infiltration des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale comprennent les neutrophiles, les macrophages, les cellules dendritiques, les mastocytes, les cellules T, les cellules B, les cellules NK, les cellules NKT et qui créent ensemble le micro-environnement local qui soutient la grossesse. Un déséquilibre entre ces cellules ou tout inappropaltération riée dans leurs phénotypes est considéré comme un mécanisme de la maladie pendant la grossesse. Par conséquent, l&#39;étude des leucocytes qui infiltrent l&#39;interface materno-fœtale est essentiel en vue d&#39;élucider les mécanismes immunitaires qui conduisent à des complications liées à la grossesse. On décrit ici un protocole qui utilise une combinaison de dissociation mécanique douce suivie d&#39;une décomposition enzymatique protéolytique robuste avec un cocktail enzymatique collagénolytique et pour isoler les leucocytes infiltrant des tissus murins à l&#39;interface materno-fœtale. Ce protocole permet l&#39;isolement d&#39;un nombre élevé de leucocytes viables (&gt; 70%) avec des propriétés antigéniques et fonctionnelles suffisamment conservées. Les leucocytes isolés peuvent ensuite être analysés par plusieurs techniques, y compris l&#39;immunophénotypage, tri cellulaire, l&#39;imagerie, immunoblotting, l&#39;expression d&#39;ARNm, une culture de cellules, in vitro et des essais fonctionnels tels que des réactions de leucocytes mixtes, prolifération, ou des essais de cytotoxicité.

La dissection des tissus murins provenant de l&#39;interface materno-fœtale est représenté sur la figure 1; Cette procédure comprend l&#39;ouverture de la cavité peritoneale (figure 1A, B), les cornes utérines (Figure 1C), y compris les sites d&#39;implantation (Figure 1D), et la collecte des tissus utérins (figure 1E), le placenta (Figure 1F), et des tissus déciduales (figure 1G) à 16,5 dpc. <...

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Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

isolation-leukocytes-from-murine-tissues-at-maternal-fetal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K vues.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolement du cerveau infiltrant Leucocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Recherche

Immunologie et infection

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolement des ARN Pseudomonas aeruginosa La colonisation du tractus gastro-intestinal murin

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioénergétique et les oxydatif: Protocoles pour l&#39;isolement et l&#39;évaluation des leucocytes humains et plaquettes

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

L&#39;isolement et la transplantation de différents âgées murins thymiques greffes.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolement des leucocytes à partir de l&#39;interface humaine materno-fœtale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...