Ce travail a été soutenu par l&#39;Eunice Kennedy Shriver Institut national de la santé infantile et le développement humain, NIH / DHHS. Ce travail a également été soutenue, en partie, par l&#39;Initiative de l&#39;Université Wayne State périnatale en maternelle, périnatale et santé de l&#39;enfant. Nous tenons à remercier Maureen McGerty (Wayne State University) pour ses lectures critiques du manuscrit.

Ce protocole est approprié pour l&#39;isolement des leucocytes des caduque basale et parietalis caduque en préparation pour l&#39;immunophénotypage par cytométrie de flux. En outre, les cellules isolées peuvent être utilisées pour le tri cellulaire, culture cellulaire, l&#39;isolement de l&#39;ARN, et la cytologie. Avant de travailler avec les échantillons mentionnés dans le présent protocole, l&#39;approbation éthique humaine doit être obtenue auprès du Comité d&#39;éthique de la recherche locale et Institutional Review Board. La collecte et l&#39;utilisation d&#39;échantillons humains à des fins de recherche ont été approuvés par les Institutional Review Board de l&#39;Institut national de la santé infantile et du développement humain (NICHD) Eunice Kennedy Shriver, National Institutes of Health (NIH), ministère de la Santé et des Services sociaux (DHHS , Bethesda, MD, USA) et Wayne State University (Detroit, MI, USA). Un consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de toutes les femmes enceintes avant le prélèvement d&#39;échantillons de tissus. REMARQUE: Tout en travaillant avec le sang des animaux, les cellules, ou de dangeragents UO comme mentionné dans ce protocole, il est essentiel que la biosécurité appropriée et des mesures de sécurité de laboratoire soient suivies. 1. Dissection des déciduales tissus humains NOTE: La plaque de base est la base au-dessous et ci-joint au placenta et représente la surface maternelle. Les membranes chorioamniotic comprennent l&#39;amnios et le chorion. La plaque basale comprend les caduque basale et le chorion comprend parietalis caduque (Figure 1). <ol><li> Decidua basalis <ol><li> Disséquer un morceau de la plaque de base d&#39;un cotylédon du placenta (figures 1A et 1B). </li><li> Placez-le sur une planche à découper stérile avec les villosités placentaires vers le haut. Le côté montrant la villosités placentaires est généralement rouge sang avec le tissu poilu en apparence. La plaque basale est lisse et pâle de couleur rouge. </li><li> Utilisez tranchants, ciseaux pointes fines et une pince pour retirer la villtissus et les vaisseaux sanguins UO. Gardez le tissu trempé dans 1x PBS (Ca2 + - et Mg 2+ - gratuitement) pendant le processus (figure 1C). Recueillir 2 à 3 de ces pièces et rincez-les soigneusement avec 1x PBS pour éliminer le sang (figure 1D). </li></ol></li><li> Decidua parietalis <ol><li> Disséquer un morceau de membranes chorioamniotic (environ 10 cm x 10 cm, figure 1E). Placez-le sur la planche avec le chorion vers le haut. Le côté chorionique contient des caillots de sang et est généralement la lumière de couleur jaunâtre. </li><li> Utilisez pointes fines pinces pour retirer autant de caillots de sang que possible (figure 1E). Rincer la membrane stérile 1x PBS pour nettoyer l&#39;excès de sang à partir de la membrane jusqu&#39;à ce que le PBS 1x soit claire. </li><li> Utilisez un grattoir à cellules stérile à usage unique pour gratter doucement la couche déciduale de la membrane. Appliquer stérile 1x PBS sur la memBrane tout en complétant ce processus (figure 1F). Recueillir les tissus déciduales et les placer dans un tube en plastique de 50 ml avec PBS 1x stérile (figure 1G). </li></ol></li></ol> 2. La ventilation mécanique et de digestion enzymatique <ol><li> Laver le tissu disséqué à partir de la caduque basilaire de l&#39;étape (1.1.3) ou la caduque pariétale (de l&#39;étape 1.2.3) avec PBS 1x stérile dans un tube en plastique de 50 ml. Recueillir des pastilles de tissu par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant situé au-dessus du culot de tissu soigneusement sans perturber le culot. NOTE: A ce stade, les pastilles sont très lâche, car ils contiennent des globules rouges. Si le volume de la pastille est d&#39;environ ou inférieur à 3 ml, remettre en suspension le culot dans 6 ml de solution de détachement cellulaire pré-chauffé à 37 ° C. Si la pastille est supérieure à 3 ml de volume, ajouter plus de solution de détachement cellulaire (ajouter environ 2 fois èmee volume des échantillons de tissus). </li><li> Transférer les tissus homogénéisés (caduque basale + détachement cellulaire solution ou caduque parietalis + solution de détachement cellulaire) à un tube de C. </li><li> Placer le tube de C dans le dissociateur automatique et exécuter le programme correspondant. NOTE: Le programme pour les caduque basale fonctionne pendant 17 secondes avec 668 tours au total par cycle. Le programme pour les parietalis caduque fonctionne pendant 37 secondes avec 235 tours au total par cycle. Ces programmes ont été personnalisés pour isoler des leucocytes caduque basilaire ou parietalis caduque avec un bon rendement et la viabilité cellulaire. </li><li> Après la désagrégation mécanique des tissus, digérer les tissus avec une solution de détachement cellulaire disponible dans le commerce tel que Accutase; (Un cocktail contenant des enzymes protéolytiques et collagénolytiques) pendant 45 min à 37 ° C avec agitation douce. </li></ol> 3. Isolement de leucocytes <ol><li> Après l&#39;incubation, ajouter 10 ml de 1 x PBS à la digemélange stion et passer à travers un tamis cellulaire 100 um dans un tube en plastique de 50 ml. Selon la viscosité du mélange de digestion, on peut avoir besoin d&#39;utiliser plusieurs filtres de cellules pour une mélange. </li><li> Remplir le tube avec 1x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le PBS 1x-dessus des culots cellulaires soigneusement et remettre en suspension les culots avec 5 ml de tampon FACS glacé. NOTE: Pour étudier les polynucléaires et mononucléaires leucocytes ensemble, passez à l&#39;étape 6.1; d&#39;étudier les leucocytes mononucléaires, passez à l&#39;étape 3.3. </li><li> Ajouter 5 ml de 20% de milieu de gradient de densité (1,077 + 0,001 g / ml) dans un tube en plastique de 15 ml et recouvrir lentement la suspension cellulaire au-dessus du milieu de gradient de densité. Bien que la stratification de l&#39;échantillon, il est important de ne pas mélanger le milieu à gradient de densité avec la suspension de cellules. </li><li> Centrifugeuse avec un rotor swing-out à 500 g pendant 30 min à 4 ° C sans le frein. Il est très important pour désactiver le frein pour éviter de mélanger les cellules et lOsing le gradient. Les leucocytes se trouvent à l&#39;interface entre le milieu à gradient de densité et le tampon FACS. </li><li> Retirer la couche supérieure qui contient les débris de la mémoire tampon et la cellule FACS très soigneusement à l&#39;aide d&#39;une pipette. La bande de l&#39;interface contenant les cellules mononucléaires déciduales et une partie des leucocytes polynucléaires. </li><li> Transférer les cellules à l&#39;interface complètement dans un nouveau tube de plastique de 15 ml. Ajouter au moins 3 fois plus de volume de tampon FACS. </li><li> Centrifuger à 300 g pendant 5 min à pastiller les cellules. Aspirer le surnageant et laver les cellules avec un tampon FACS. Pastiller les cellules avec un autre centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante. REMARQUE: Pour effectuer la culture de cellules, voir l&#39;étape 4. Pour effectuer le tri de cellules, voir l&#39;étape 5. Pour effectuer immunophénotypage, voir l&#39;étape 6. </li></ol> 4. Applications - culture cellulaire <ol><li> Re-suspendre les cellules de l&#39;étape 3.7 dans 1 ml de milieu de culture RPMI 1640. Compter les cellules viables using un compteur automatique de cellules ou d&#39;un hémocytomètre et une solution bleu trypan 0,4%. </li><li> Additionner la quantité de milieu de culture RPMI pour obtenir une concentration cellulaire de 1 x 10 6 cellules / ml. Les cellules sont maintenant prêts pour la culture. </li></ol> 5. Les demandes - Isolement de macrophages pour la culture de cellules primaires <ol><li> Pour isoler CD14 + cellules magnétiquement marquer les cellules de l&#39;étape 3.7 avec des microbilles CD14 (20 perles de pi par 10 7 cellules), incuber pendant 15 min à 4 ° C, et CD14 séparé + cellules d&#39;autres types de cellules par application d&#39;un champ magnétique. Après 2 lavages avec du tampon MACS et le retrait du champ magnétique, éluer les cellules CD14 + retenues magnétiquement avec un tampon MACS. </li><li> Après la centrifugation, remettre en suspension les culots cellulaires dans du milieu de culture RPMI 1640. Les cellules sont prêtes pour le placage (Figure 2). </li></ol> 6. Applications - IMMUNOPHENOTYPAGE <ol><li> Pour utiliser les cellules pour immunophenotyping, re-suspendre les cellules de l&#39;étape 3.7 dans 1 ml de PBS 1x. Compter les cellules viables en utilisant un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre et une solution de bleu trypan à 0,4%. </li><li> Étiqueter les cellules avec un colorant de viabilité peut être fixée (figure 3). Laver les cellules deux fois avec du tampon FACS et remettre en suspension les cellules dans du tampon de coloration. Incuber avec un bloqueur FcR pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter les anticorps conjugués à des fluorochromes extracellulaires. Par exemple, dans ce protocole, en utilisant l&#39;anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15, anti-CD56 et des anticorps (tableau 1). Incuber pendant 30 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Après deux lavages avec 1 x PBS, les cellules seront analysés dans 500 ul de tampon de coloration en utilisant un cytomètre de flux. Une représentation de la stratégie de déclenchement utilisé pour analyser les sous-populations de leucocytes présents dans les tissus déciduales est représenté sur la Figure 4. </li></ol>

The authors disclose no conflicts of interest.

Caractérisation des propriétés fonctionnelles et phénotypiques de l&#39;infiltration des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale humaine est essentielle pour la compréhension des mécanismes immunitaires qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs techniques ont été décrites pour isoler les leucocytes de l&#39;interface materno-fœtale humaine pendant la grossesse 10,14,25,28,37,42,43. Cependant, chacune de ces techniques est distinct, met en oeuvre des enzymes ou des combinaisons ...

La grossesse est caractérisé par trois phases distinctes: une immunologiques) implantation et la placentation précoce associée à une réponse pro-inflammatoire (par exemple, implantation ressemble à un «plaie»); 2) le deuxième trimestre et la plupart du troisième trimestre de la grossesse, lorsque l&#39;homéostasie immunitaire est atteint grâce à un état majoritairement anti-inflammatoire à l&#39;interface materno-fœtale; et 3) la parturition, un état ​​pro-inflammatoire 1-7. Les cellules immunitaires jouent un rôle important dans la régulation de la réponse inflammatoire à l&#39;interface materno-fœtale où leur abondance et le changement de localisation pendant la grossesse 6-9. Chez les humains, l&#39;interface materno-fœtale représente une zone de contact direct entre la mère (caduque) et foetale (chorion ou trophoblaste) tissus. Cette interface comprend: 1) la caduque pariétale qui tapisse la cavité utérine ne sont pas couverts par le placenta et est en juxtapositionau laeve de chorion; et 2) les caduque basale, situé dans la plaque basale du placenta où il est envahi par les trophoblastes interstitiels 10 (Figure 1). L&#39;intimité de ces zones de contact crée les conditions pour l&#39;exposition du fœtus à l&#39;antigénique immunitaire 11-13 du système maternelle. Sans surprise, les leucocytes comprennent jusqu&#39;à 30 à 40% des cellules déciduales 8,9,14,15 en plus des cellules de type stromal typiques et les cellules glandulaires 8,14,16. Le rôle des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale englobe de multiples processus qui incluent la limitation de l&#39;invasion trophoblaste 17, le remodelage des artères spiralées 18,19, maintien de la tolérance maternelle 12,20, et l&#39;initiation du travail 21-26. Les leucocytes à la fois de l&#39;adaptation et des membres innée du système immunitaire, à savoir, les cellules T, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes B, les cellules dendritiques et les cellules NK, ont été identifiés dans les tissus déciduales, et leurIl a été démontré proportions et l&#39;état d&#39;activation de varier spatialement et temporellement pendant toute la gestation 6-10,12,14,24,27-30. Perturbations dans la population et / ou de la fonction des leucocytes sont associés à un avortement spontané 31, 32 pré-éclampsie, une restriction de croissance intra-utérin 32,33 et 7,24 travail prématuré. Par conséquent, l&#39;étude des caractéristiques phénotypiques et la fonctionnalité des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale humaine facilitera l&#39;élucidation des voies immunologiques surexprimés dans les troubles de la grossesse. Un des outils les plus puissants utilisés pour déterminer le phénotype et les propriétés fonctionnelles de leucocytes est la cytométrie de flux, une technologie qui permet l&#39;analyse quantitative de plusieurs paramètres simultanément 34-36. Pour analyser les leucocytes par cytométrie de flux, l&#39;isolement des leucocytes dans une suspension à cellule unique est nécessaire. Par conséquent, un procédé pour séparer l&#39;infiltration leukocytes de l&#39;interface materno-fœtale est nécessaire pour étudier leur propriétés phénotypiques et fonctionnels. Plusieurs méthodes ont été décrites pour isoler les leucocytes de l&#39;interface materno-fœtale humaine 10,14,25,27,37-39. Alors que certains appliquent désagrégation mécanique 10,25,27,38, d&#39;autres utilisent la digestion enzymatique 37,40 pour la dissociation des tissus. Parce que la désagrégation mécanique produit un rendement plus faible et la viabilité réduite 41, et la dissociation enzymatique peut affecter la viabilité et la surface de la cellule marqueur rétention 42, le procédé décrit ici combine dissociation mécanique douce avec prétraitement enzymatique pour augmenter le rendement des leucocytes isolés sans compromettre la viabilité des cellules. Une combinaison de méthodes similaire a été démontrée comme étant efficace dans la séparation de leucocytes à partir des tissus déciduales à l&#39;interface materno-fœtale 39. Par conséquent, le protocole décrit ici implique mécadésagrégation nique avec un dissociateur automatique de tissu qui augmente la cohérence tout en économisant du temps et de la main-d&#39;œuvre par rapport à hachage traditionnel avec des scalpels opposées, lames de rasoir, des ciseaux chirurgicaux ou 10,28. L&#39;enzyme choisie pour la dissociation des tissus était Accutase. Contrairement à la collagénase utilisée par 43, 44 dispase, la trypsine et 45, Accutase (une solution de détachement cellulaire) combine à la fois des activités protéolytique et collagénolytiques général qui contribuent à la dissociation efficace et doux 46,47. Après dissociation, les leucocytes sont enrichies à partir de la population totale des cellules déciduales par centrifugation en gradient de densité. Différents milieux de gradient de densité ont été utilisés précédemment, le plus commun qui sont Percoll (une suspension de particules de silice colloïdale) 48 et Ficoll (un polymère de saccharose avec un poids moléculaire synthétique de haute) 49. L&#39;efficacité supérieure de l&#39;isolement par le polymère de saccharose a été previoisa nt montré 50, et le protocole décrit ici encore prouve que ce média de gradient de densité produit une pureté suffisamment élevé de leucocytes mononucléaires. Par conséquent, le protocole décrit ici combine la désagrégation du tissu mécanique avec un dissociateur automatique de tissu, la digestion enzymatique avec une solution de détachement de la cellule, et la séparation des leucocytes avec un milieu de gradient de densité (1,077 + 0,001 g / ml) pour isoler les leucocytes à partir de tissus déciduales humaines. Ce protocole a été prouvé pour préserver les antigènes de surface des cellules ainsi que la viabilité des cellules. Les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour de multiples applications qui comprennent immunophénotypage avec la cytométrie de flux et des études fonctionnelles in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&#160;</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>(1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small Petri dishes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>(cell detachment solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 2 mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>FALCON/Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI culture medium 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22400-089</td>
			<td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic chamber slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>HEPA Class 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ISOTEMP 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexelcom</td>
			<td>Cellometer Auto2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre-separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>(Fc Block)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human cell surface antigen antibodies&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>346202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>20% density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MAXQ 4450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSR-Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SpinChron DLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

La grossesse est caractérisée par l&#39;infiltration de leucocytes dans les tissus reproducteurs et à l&#39;interface materno-fœtale (caduque basale et caduque pariétale). Cette interface est le site anatomique de contact entre la mère et de tissus foetaux; par conséquent, il est un site d&#39;action immunologique au cours de la grossesse. Infiltrant leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale jouent un rôle central dans l&#39;implantation, l&#39;entretien de la grossesse, et le calendrier de livraison. Par conséquent, les caractérisations phénotypiques et fonctionnelles de ces leucocytes fourniront des renseignements sur les mécanismes qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs protocoles ont été décrits dans le but d&#39;isoler leucocytes infiltrant des caduque basale et parietalis caduque; Cependant, le manque de cohérence dans les réactifs, les enzymes, et les temps d&#39;incubation, il est difficile de comparer ces résultats. Décrit ici est une nouvelle approche qui combine l&#39;utilisation de diss mécaniques et enzymatiques doucestechniques de ociation de préserver la viabilité et l&#39;intégrité des marqueurs intracellulaires et extracellulaires dans les leucocytes isolés à partir de tissus humains à l&#39;interface materno-fœtale. Mis à part l&#39;immunophénotypage, culture cellulaire, et le tri de cellules, les applications futures de ce protocole sont nombreuses et variées. À la suite de ce protocole, les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour déterminer la méthylation de l&#39;ADN, l&#39;expression de gènes cibles, de fonctionnalité in vitro de leucocytes (par exemple, la phagocytose, la cytotoxicité, la prolifération des cellules T, et de la plasticité, etc.), et la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène à l&#39;interface materno-fœtale. En outre, en utilisant le protocole décrit, ce laboratoire a été en mesure de décrire les leucocytes nouvelles et rares à l&#39;interface materno-fœtale.

. La dissection de tissus humains à l&#39;interface materno-fœtale (caduque basale et caduque parietalis) est représenté en figure 1 Cette procédure comprend la dissection de la plaque de base, qui comprend les caduque basale (Figure 1A - D). Le basalis caduque est obtenue en enlevant la villosités placentaires (côté fœtal) à partir de la plaque de base (Figure 1C). Le parietalis caduque est recueilli par grattant doucement la membrane chorion...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolement des leucocytes à partir de l&#39;interface humaine materno-fœtale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.9K vues.  NICHD/NIH/DHHS. Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis. 

Vidéo: Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Isolement du cerveau infiltrant Leucocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Isolement et analyse de Brain-séquestrés de leucocytes<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-souris infectées

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

Bioénergétique et les oxydatif: Protocoles pour l&#39;isolement et l&#39;évaluation des leucocytes humains et plaquettes

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Analyser les effets des cellules stromales sur le recrutement des leucocytes de débit

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

Isolement de cellules dendritiques de l’appareil reproducteur féminin humain pour des études phénotypiques et fonctionnelles

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...