The research leading to these AirPROM results has received funding from the European Union under grant agreement&#160;n&#176; 270194.This work was also funded by the National Centre for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research (NC3Rs), and the Engineering and Physical Research Centre (EPSRC) Doctoral Training Centre (DTC) in Regenerative Medicine, U.K.

ASM cellules primaires de personnes non asthmatiques ont été isolés à partir de biopsies bronchiques à l&#39;hôpital Glenfield (Leicester, Royaume-Uni) comme décrit précédemment. La recherche a été approuvé par le Comité d&#39;éthique de Leicestershire et les patients ont donné leur consentement écrit et éclairé. 1. Électrofilage PET scellants (Figure 2) <ol><li> Préparer une solution (10 ml) de boisson de qualité de la bouteille PET dans un 1: 1 dichlorométhane (DCMro) - acide trifluoroacétique (TFA) solution. PET concentrations de 8%, 30% et 10% en poids / volume (poids / volume) sont nécessaires pour nanofibres, microfibre et alignés échafaudages respectivement, puis remuer la solution O / N à la température ambiante pour le PET se dissoudre. </li><li> Transférer la solution PET dans une seringue et attacher un 23-G (pour nanofibres) ou un 18-G (pour microfibre et alignés) aiguille à la seringue et placer la seringue dans une pompe seringue motorisé. Assurez-vous que la pointe de l&#39;aiguille est tourné vers le bas. </li><li> Placez le mandrel 15 cm de la pointe de l&#39;aiguille, assurant l&#39;aiguille est dirigée vers le centre du tambour. </li><li> Fixez la fourniture d&#39;électricité à la pointe de l&#39;aiguille avec pinces crocodile et la terre le mandrin (via la prise de banane) à la terre. Allumer l&#39;alimentation du mandrin et vitesse réglée à 60 tours par minute (l&#39;équivalent d&#39;environ 13,2 m · min -1) pour nanofibres et microfibre échafaudages. Régler la vitesse de 2000 tours par minute (équivalent à environ 440 m · min -1) pour échafaudages alignés. </li><li> Régler la pompe à seringue à un débit de 0,5 ml de flux · h -1 pour nanofibres échafaudages aléatoires et alignés ou 2,0 ml · h -1 pour les échafaudages en microfibres. Laisser la pompe fonctionner jusqu&#39;à ce que la solution est extrudée à partir de la pointe de l&#39;aiguille afin d&#39;évacuer l&#39;air dans l&#39;aiguille. Puis arrêter la pompe. </li><li> Sur la pompe seringue, réglez le volume total de la solution d&#39;être expulsé à 2 ml et démarrer la pompe. </li><li> Set tension d&#39;alimentation 14 kV, et l&#39;interrupteur sur le supp de puissanceLy. </li><li> Electrospin jusqu&#39;à 2 ml de solution a été électrofilées (4 h pour les nanofibres et échafaudages alignés, 1 heure pour les échafaudages en microfibres). </li><li> Couper l&#39;échafaudage avec une lame le long de la largeur du mandrin. On obtient ainsi une feuille 2D d&#39;échafaudage de la taille de la zone de surface du mandrin (dans ce cas, une feuille rectangulaire de 22 cm x 11 cm) qui peut être soigneusement détaché du mandrin). Stocker l&#39;échafaud dans une feuille d&#39;aluminium pour réduire la charge électrostatique). Remarque: échafaudages biphasiques sont produites par électrofilage séquentielle un échafaudage de nanofibres directement sur un échafaudage en microfibre. </li></ol> 2. Stérilisation des échafaudages avant utilisation en culture cellulaire <ol><li> De la feuille d&#39;échafaudage, punch out disques d&#39;échafaudages biphasique ou alignés en utilisant un stylo de biopsie de 0,8 mm de diamètre et de s&#39;y tenir joint à l&#39;aide d&#39;aquarium colle non toxique. </li><li> Stériliser à l&#39;aide d&#39;échafaudages irradiation ultraviolette pendant 30 minutes de chaque côté de l&#39;échafaudage avant trempage dans une 20% Vol / vol solution d&#39;antibiotique / antifongique (2x10 5 unités ml -1 pénicilline G, 2.000 mg ml -1 sulfate de streptomycine et 500 pg ml -1 amphotéricine B) O / N à 4 ° C. </li><li> Laver échafaudages avec PBS trois fois, puis échafaudages de magasins dans des plaques de TCP ainsi dans PBS à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 3. Constituants cellulaires Culture Media <ol><li> Culture CALU3 cellules épithéliales dans les médias DMEM-F12 complété avec du sérum de 10% vol / vol de veau foetal (FCS), solution à 2 nM L-glutamine, 1% vol / vol antibiotiques / solution antimycosique (10.000 unités ml -1 pénicilline G, 100 mg ml -1 sulfate de streptomycine et 25 pg ml -1 amphotéricine B). </li><li> Culture de fibroblastes MRC5 et de cellules dans des milieux ASM DMEM supplémenté avec du sérum de 10% vol / vol de veau foetal (FCS), une solution 2 nM de L-glutamine, 1% vol / vol antibiotique / antimycotique solution (10 000 unités ml-1 de pénicilline G, une00 mg ml -1 sulfate de streptomycine et 25 pg ml -1 amphotéricine B). </li><li> Culture cellule épithéliale-fibroblastes-ASM co-cultures dans un DMEM-F12 70:30: mélange des médias DMEM. </li></ol> 4. Ensemencement des fibroblastes et cellules épithéliales sur biphasique Échafaudages <ol><li> Dans une plaque de culture de tissu, faire tremper les échafaudages dans les médias DMEM-complétées et incuber à 37 ° C pendant 1 heure avant l&#39;ensemencement des cellules. </li><li> Retirez les médias DMEM-complétés, placer la phase de microfibre de échafaudage apicale et de semences 1.5 x10 4 MRC5 cellules de fibroblastes dans 30 pi de milieu DMEM-complétées. Agiter la plaque sur un agitateur orbital pendant 2 heures, avant de quitter dans un incubateur à 37 ° C 5% de CO 2 dans l&#39;air O / N. </li><li> Tournez sur l&#39;échafaud si la phase de nanofibres d&#39;échafaudage face apicale, semences 3.0 x10 4 CALU3 cellules épithéliales dans 30 pi de DMEM-F12 supplémenté médias sur la phase de nanofibres de l&#39;échafaud et incuber for 2 h à 37 ° C, 5% CO 2 dans l&#39;air avant l&#39;immersion dans l&#39;échafaud 70:30 DMEM-F12: DMEM supplémenté médias O / N avant le transfert dans le bioréacteur. </li></ol> 5. Ensemencement des cellules de l&#39;ASM sur le alignés Échafaudages <ol><li> Dans une plaque de culture de tissu, faire tremper les échafaudages dans les médias DMEM-complétées et incuber pendant 1 heure à 37 ° C avant d&#39;ensemencer 2,5 x10 4 cellules dans 30 ul de milieu DMEM-complétées et incubation pendant 2 heures (37 ° C, 5% CO 2 dans l&#39;air). Immerger échafaudage en retour de milieu DMEM supplémenté dans l&#39;incubateur et laisser O / N avant la mise en place d&#39;un tri-culture dans le bioréacteur. </li></ol> 6. Mise en place du Tri-culture en utilisant le système de bioréacteur (Figure 7) <ol><li> Placez l&#39;échafaud joint biphasique dans la rainure à l&#39;intérieur une chambre avec la phase épithéliale vers le haut dans la chambre. </li><li> Placer l&#39;échafaudage alignée sous l&#39;échafaud biphasique (de sorte qu&#39;il est adjacent à la microfiber phase de l&#39;échafaudage biphasique) et verrouiller les deux chambres du bioréacteur ensemble. </li><li> Assembler deux circuits d&#39;écoulement de perfusion reliés à deux réservoirs moyen (milieu DMEM-F12-complétés dans le réservoir apical, DMEM-F12 / milieu DMEM-additionné dans le réservoir de base) et des supports de pompage autour des deux circuits à environ 0,1 ml / min en utilisant une pompe péristaltique (40 ml médias sont recyclés à travers chaque circuit). Chambre toutes les parties du système intérieur d&#39;un incubateur à 37 ° C, 5% CO 2 dans l&#39;air. </li><li> Après une semaine, retirez le support de la chambre apicale, et de la culture les cellules épithéliales de l&#39;ILA pour une semaine de plus avant l&#39;analyse. </li></ol>

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The Authors have nothing to disclose.

La capacité de electrospin fibres polymères ayant des propriétés structurales comparables à ECM naturel a conduit à de nombreux polymères naturels ou synthétiques, ou des mélanges de polymères étant électrofilé à recréer ces environnements,. La manipulation des paramètres du processus (y compris le choix de polymère, la concentration de polymère, solvant, la distance de la pointe de l&#39;aiguille et de la température) peuvent toutes les caractéristiques influence d&#39;échafaudage; certains paramètres peuvent cependant avoir un plus grand impact sur ​​les propriétés d&#39;échafaudage que d&#39;autres 25,. Lors de la modification diamètre des fibres PET, on a trouvé des paramètres clés de la concentration du polymère utilisé, la vitesse à laquelle la solution de polymère était électrofilé, et le diamètre de l&#39;aiguille. Lorsque électrofilature fibres alignées les paramètres clés sont la méthode de collecte utilisé (un mandrin en rotation), et la vitesse à laquelle les de mandrin tourne. Grâce à la réduction de la vitesse de mandrin à 60 tours par minute, nous avons trouvé les échafaudages alignés au hasard produits ont montré une plus grande échafaudage uniconformité par rapport à électrofilature sur une plaque de collecteur plat. Les caractéristiques des tissus des voies respiratoires décellularisée ont été analysés pour donner des conseils pour les différentes topographies d&#39;échafaudage développés pour la culture de chaque type de cellule des voies aériennes. nanofibres de électrofilées sont un échafaudage attrayante à reproduire les structures de la membrane basale en raison de la petite taille des pores, mais porosité globale élevée qui permet une diffusion accrue de métabolite tout en restreignant le mouvement cellulaire. 9 tout en optimisant les paramètres de électrofilage, une gamme de concentrations en PET et les débits ont été testés. Les fibres les plus minces ont été obtenus en utilisant une solution en poids / volume de PET de 6%, déjà utilisée par d&#39;autres groupes. Cependant, les niveaux élevés de perles, et un manque d&#39;uniformité des problèmes constants. Les tentatives initiales pour enlever le bourrelet comprenaient l&#39;addition d&#39;un tensioactif cationique, le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), à la solution pour abaisser la tension de surface, et de tester diverses sourcesde PET. L&#39;ajout de tensioactif réduit la quantité de perles, mais pas entièrement. Après avoir essayé un certain nombre de sources commerciales de granulés de PET, boisson de qualité alimentaire bouteille PET a été utilisé, en découpant des bouteilles de boisson et la dissolution de ceux-ci dans le DCM: solution de solvant TFA. L&#39;utilisation de ce que la source PET a donné lieu à une augmentation de l&#39;uniformité de la fibre et une réduction des perles de fibres. En augmentant la concentration de la solution légèrement à 8% en poids / volume et en réduisant le diamètre de l&#39;aiguille (18G à 23G), nous avons produit constamment des nanofibres sans défaut avec un diamètre de fibre d&#39;environ 250 nm. Échafaudages de nanofibres électrofilées peuvent être très électrostatique lors de la collecte du mandrin faisant la manutention manuelle des échafaudages difficiles. Cela a été améliorée par le stockage des échafaudages dans une feuille d&#39;aluminium après le filage et le trempage dans 70% IMS avant utilisation. Cela semble pour aider à dissiper la charge électrostatique résiduelle sur l&#39;échafaud du processus d&#39;électrofilage. Pour fournir topographies similaire aux micro-environnements particuliers rencontrés par les trois principaux types de cellules des voies respiratoires au sein de la paroi des voies aériennes, un protocole d&#39;électrofilage de base a été conçu pour produire trois échafaudages uniques pour ces types de cellules: par électrofilage une solution à faible concentration en PET lentement, nanofibres alignées au hasard ont été générées, sur lequel les cellules épithéliales ont été ensemencées (mimant la GAR). Par électrofilage d&#39;une solution de concentration plus élevé PET à un rythme plus rapide, des microfibres alignées au hasard ont été générées (production d&#39;un échafaudage poreux plus), dans lequel des fibroblastes ont été ensemencés (mimant immédiatement la zone de sous-muqueuse sous la GAR). Par électrofilage d&#39;une solution à faible concentration de PET sur un mandrin en rotation à grande vitesse des nanofibres alignées ont été produites, sur laquelle les cellules musculaires lisses orientées dans la direction des fibres, la production de feuilles de cellules alignées. L&#39;augmentation des diamètres des fibres conduisent à une augmentation de la taille des pores, ce qui permet une plus grande penetratio cellulairen en échafaudages et ainsi aider à créer un véritable environnement 3D,. échafaudages en microfibres ont été utilisées pour la culture de fibroblastes dans l&#39;étude pour s&#39;assurer que les cellules résidaient sur plusieurs plans au sein de l&#39;échafaudage. En augmentant la concentration de PET à 30% en poids / volume, de fibres de PET ayant un diamètre moyen de 2,5 um ont été produites. Fibres de plus de diamètre (≈ 4 pm) ont été produites en utilisant une solution à 35% de PET en poids / vol, mais l&#39;épaisseur de l&#39;uniformité échafaudage a été perdu, et une plus grande variabilité entre les fibres individuelles était apparente. Pores à l&#39;échafaud en microfibre étaient plus de 7 fois supérieures à celles mesurées dans les échafaudages de nanofibres (10,45 vs 1,43 um um respectivement), mais toujours statique ensemencement des cellules fournies pénétration cellulaire limitée. Cela a été amélioré de façon dynamique en ensemençant les cellules en utilisant un agitateur orbital, un procédé révélé efficace précédemment. Échafaudages de nanofibres hautement alignées ont été créés par électrofilage 10%poids / solution de PET de vol sur le mandrin tournant à 2000 rpm (≈ 440 m · min -1). La concentration PET a augmenté de 8% pour éviter une morphologie en forme d&#39;onde irrégulière que les fibres exposées à des concentrations inférieures. Malgré l&#39;augmentation de la concentration, en alignant les fibres réduit le diamètre moyen de la fibre (216 nm contre 255 nm, aligné contre aléatoire). La grande vitesse de l&#39;étirage des fibres avant qu&#39;elles ont séché mandrin est susceptible de provoquer cet effet. L&#39;alignement des fibres influencé l&#39;alignement des cellules ASM, et a aussi d&#39;autres effets physiologiques sur les cellules de l&#39;ASM qui ont été caractérisées ailleurs 21. La principale limitation de ce protocole est l&#39;incapacité de cellules vivantes d&#39;image sur / dans les échafaudages faisant adhérence cellulaire ou la différenciation initiale sur une période de temps prolongée impossible de déterminer sans sacrifier échantillons. Cela signifie plus d&#39;optimisation survient après la période de culture, à savoir, fixertion des échantillons et en mesurant ensuite si la culture cellulaire a été un succès après pas au cours de la culture cellulaire. L&#39;observation d&#39;un changement de couleur dans les échafaudages incubés dans alamarBlue (bleu à rose) indique cellules sont présentes et viable, mais est pas idéal. Électrofilage plusieurs polymères transparents, tels que la gélatine pourraient aider à visualiser les cellules sur les échafaudages. L&#39;électrofilage d&#39;un échafaudage à l&#39;intérieur de nanofibrous notre modèle a permis à la réplication de la GAR des voies respiratoires, de manière similaire constituée de nanofibres denses sur lequel résident les cellules épithéliales. Il a été montré précédemment que les cellules de structure ne peut pas migrer à travers l&#39;échafaudage de nanofibres 22, bien que des cellules immunes sont capables de (données non présentées). Bien avantageux pour la culture de types de cellules spécifiques sur une surface 3D (tels que cellules epitheliales et endotheliales), cette prévention de la migration des cellules de structure à travers les nanofibres peuvent être nuisibles pour la culture d&#39;autres types de cellules. Comme le muscle lisse est incapable de migrer à travers ee nanofibres alignées échafaud on assemble la coculture de trois couches avec le muscle lisse et des couches de fibroblastes face de l&#39;autre (par opposition à l&#39;échafaud alignés séparant les deux types de cellules). Bien que cela permet aux cellules d&#39;être en apposition proche, l&#39;étude actuelle ne peut pas déterminer si un type de cellule (que ce soit le muscle lisse ou de fibroblastes) dépasserait la totalité de la couche au cours d&#39;une période de culture plus longue. En dépit de ces limitations, un modèle tri-couche viable de la paroi des voies aériennes a été développé qui fournit une plate-forme alternative pour étudier les interactions entre ces multiples types cellulaires. Une étude à trois couches similaire a récemment été publiée où les fibroblastes ont été incorporées dans un hydrogel de collagène I cylindrique avec muscle lisse ensemencées sur la surface externe et les cellules epitheliales à l&#39;intérieur de la surface luminale 17. La stabilité mécanique des échafaudages électrofilées développés ici permettrait tubulaire semblable construit à former, et reste un courant recrch but au sein de notre groupe. Alors que l&#39;étude a porté sur les voies respiratoires, plusieurs organes au sein de la part du corps cette unité structurelle de la muqueuse de base, et en modifiant les locataires mis en évidence dans cette étude, les plates-formes similaires pourraient être développés pour les tissus contenant une unité de la membrane basale, y compris les vaisseaux sanguins, la vessie et la cornée, où collagène modèles multi-couches à base ont été employées.

Le domaine de la médecine régénératrice et du génie tissulaire progresse rapidement, avec des percées dans la trachée et les reins régénération deux dernières réalisations notables. Les biomatériaux développés dans l&#39;ingénierie tissulaire sont de plus en plus accessible, avec des possibilités de transfert de ces protocoles à des laboratoires moins spécialisés. Un domaine amorcée à bénéficier en augmentant l&#39;utilisation de biomatériaux est de diagnostic in vitro. Des études in vitro sont une plate-forme importante pour enquêter sur les voies de signalisation intracellulaires dans types de cellules simples, et ont contribué à délimiter les mécanismes sous-jacents de nombreux pathophysiologies de la maladie. Ces études reposent généralement sur un type de cellule unique en culture en monocouche sur plastique de culture de tissus (TCP); un (2D) de surface à deux dimensions beaucoup moins rigide et élastique poreux que les cellules (3D) de l&#39;environnement en trois dimensions sont exposés à l&#39;intérieur d&#39;un tissu ou un organe. Des modèles animaux ont été traditionnellement employed pour confirmer les effets constatés in vitro aussi se traduire pour les tissus ensemble, et peut également être utilisé comme plate-forme pré-cliniques pour étudier les maladies humaines. Toutefois, les différences inter-espèces minent cette dépendance sur des modèles animaux dans notre compréhension des maladies humaines -. Par exemple, beaucoup de compréhension de l&#39;asthme de la maladie du poumon est basée sur un modèle de souris malgré les différences inhérentes entre la condition humaine et ce modèle dont peu de preuves de l&#39;infiltration des mastocytes du bon faisceau musculaire des voies respiratoires, ou la capacité de développement de la maladie spontanée au sein de l&#39;animal modéliser 3,4. Il ya aussi des considérations éthiques relatives à l&#39;utilisation de modèles animaux, avec la norme «3R» de «remplacement, raffinement, et la réduction&quot; de l&#39;expérimentation animale est encouragé au Royaume-Uni et d&#39;autres pays. Une alternative intéressante serait la récapitulation de tissus humains in vitro structure de créations pour enquêter sur la nature coopérative entre les types de cellules humaines adultes dans une seule unité. Les cellules existent dans des formes multi-cellulaires dans le tissu 3D, chacun dans un micro-environnement unique. La culture de cellules sur TCP permet seulement la culture de monocouches de cellules, incapables de reproduire cet environnement ou fournir la capacité de la culture à cellules multiples. Biomatériaux avancement fournit l&#39;occasion de développer les deux plates-formes naturelles et synthétiques 3D pour la culture cellulaire. ECM décellularisé peut être utilisé pour la culture cellulaire 3D lorsque recellularized avec d&#39;autres types cellulaires, notamment les cellules souches 1, cependant de tels protocoles peut être complexe et prendre du temps, de la disponibilité limitée de tissu et en grande partie d&#39;origine non humaine. Autres protocoles permettent plus de contrôle sur les environnements cellulaires créées comme par nano-impression, le dépôt de l&#39;ECM, les technologies de la feuille de cellule ou électrofilature. Électrofilage crée tapis poreux 3D non-tissé de fibres avec des diamètres allant de nanomètres à micromètre, replicating dimensions ECM naturelles. Échafaudages électrofilées sont de plus en plus utilisées comme plates-formes 3D de culture de cellules -. Manipulation des paramètres Électrofilage permet un contrôle plus complexe caractéristiques d&#39;échafaudage tels que la taille des pores, le diamètre des fibres, de la topographie et de l&#39;alignement, et la chimie de surface. On a montré que des altérations de ces paramètres à affecter directement l&#39;adhésion cellulaire et de croissance, lorsque les cellules ont été cultivées de manière isolée. Ces avantages ont été exploitées dans la présente étude pour permettre la mise en culture de plusieurs types de cellules comme une seule construction de tissu en 3D, en utilisant la bronchiole des voies aériennes en tant que structure de tissu 3D du modèle. La paroi des bronchioles se compose de trois régions principales (Figure 1). La muqueuse est où les cellules épithéliales des voies respiratoires sont assis à l&#39;interface air-liquide (ALI), fournissant une barrière importante à l&#39;environnement extérieur. Ils se trouvent sur la membrane réticulaire sous-sol (RBM), un ECM étroitement compact constitué principalement de collagen IV, perlecans et laminines. La couche de sous-muqueuse se trouve directement au-dessous de la muqueuse, une région plus poreuse composée de plusieurs types de cellules, y compris les fibroblastes, les myofibroblastes et les leucocytes infiltrants dans des conditions pathologiques. Enfin faisceaux de muscle lisse des voies aériennes enveloppent de façon hélicoïdale, et sont constitués de feuilles alignées de muscle lisse des voies aériennes (EAM). Il est l&#39;état de contraction relative du muscle lisse des voies aériennes qui contrôle le ton. L&#39;emploi d&#39;échafaudages électrofilées dans le système pulmonaire avait jusqu&#39;à récemment été limitée à des fins de régénération; avec un remplacement de la trachée électrofilé transplanté avec succès. Alors que réussie, ces traitements sont limités en nombre, et se concentrent sur la trachée en raison de la nature relativement simple de la fonction du tissu. Exemples limité de modèles des voies aériennes utilisées pour le diagnostic in vitro existent, et sont principalement axées sur des mesures de contraction du muscle lisse,. Le non-toxique et aucunen-dégradable polyéthylène polymère téréphtalate (PET) a déjà été électrofilées, et a été employé dans la présente étude pour assurer échafaudages produits pourraient être stockés pendant de longues périodes sans dégrader (leur permettant d&#39;être utilisés &quot;off the shelf&quot;), et également convenir pour la culture cellulaire stable sur des périodes de temps prolongées. Des études antérieures de notre groupe ont montré que l&#39;utilisation de trois variantes d&#39;un protocole d&#39;électrofilage de base, trois individuels échafaudages PET électrofilées peuvent être produites pour fournir topographies optimales pour épithéliales en culture des voies respiratoires, des fibroblastes et des cellules musculaires lisses dans l&#39;isolement 21,22 et la co-culture de voies les cellules epitheliales et fibroblastes 22. Le diamètre des fibres a été trouvé à affecter considérablement la fonctionnalité épithéliale 22, et l&#39;alignement des fibres a permis la génération de feuilles alignées de muscle lisse 21. Ces études ont été réalisées indépendamment l&#39;une de l&#39;autre dans des conditions statiques. Dans la présente étude, ces différeéchafaudages nt, contenant des cellules humaines adultes complètement différenciées ont été co-cultivées pendant une semaine à l&#39;ALI dans un bioréacteur disponible dans le commerce comme une section 3D de la paroi des voies aériennes, fournissant un physiologiquement pertinente dans le modèle in vitro pour étudier les réponses des voies aériennes inter-cellulaires. Bien que ce protocole est d&#39;utiliser la bronchiole des voies aériennes en tant que système modèle, il pourrait être adapté en tant que plate-forme pour la co-culture 3D de la muqueuse des unités provenant d&#39;autres organes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Lucozade (GSK) bottles</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Source of PET for electrospinning. Cut into small pieces and weigh out as necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane (DCM)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Solvent for PET</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating Mandrel</td>
			<td>Built in house</td>
			<td></td>
			<td>Used to collect electrospun fibres. By rotating at different speeds, fibres can be aligned or randomly oriented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td></td>
			<td>used in the electrospinning process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for CALU3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for HASM cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Culture medium for MRC5 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic/ antimycotic solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital mixer (Orbital shake 503)</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td></td>
			<td>For dynamic seeding of cells onto microfibre scaffolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td>Watson Marlow</td>
			<td></td>
			<td>For providing media flow through bioreactor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DKube</td>
			<td>Kiyatec</td>
			<td></td>
			<td>Bioreactor for 3D cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adapting the electrospinning process to provide three unique environments for a tri-layered in vitro model of the airway wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

images de microscopie électronique à balayage des tissus des voies respiratoires décellularisée ou images immunohistologiques partir de biopsies des voies respiratoires identifiés caractéristiques souhaitables de l&#39;ECM des voies aériennes nous voulions introduire dans électrofilées topographies d&#39;échafaudage: matrice maternelle RBM se compose de fibres d&#39;environ 153 nm ± 30,6 nm (moyenne ± n = 50 mesures ) de diamètre (figure 3A et 5A), tandis que la matrice entourant la GAR est plus de nature poreuse (figure 3C). Sections immunohistologiques par faisceaux musculaires lisses montrent ASM présente comme feuilles alignées de cellules 21 (figure 3E). Cette information a été utilisée pour guider les caractéristiques introduites dans les échafaudages électrofilées. Un mandrin en rotation était capable de tourner de façon stable à des vitesses élevées (&gt; 2000 tr / 440 m · min -1) pour produire des échafaudages avec des fibres alignées. La rotation du mandrin lente (60 tours de 13,2 m · min -1) n&#39;a pas affecté l&#39;orientation des fibres, Mais échafaudages avec une épaisseur plus uniforme que lorsque électrofilature sur une plaque statique produite. En modifiant les paramètres de électrofilage (PET de concentration et de taux d&#39;écoulement de la solution), il a été possible de créer des échafaudages fibres d&#39;un diamètre de plusieurs micromètres ou centaines de nanomètres (paramètres d&#39;électrofilage sont indiqués dans le Tableau 1). électrofilées fibres ayant des diamètres de fibres équivalentes à des fibres naturelles RBM (150 nm) ont été produites en utilisant une solution de PET de 6%, mais à des concentrations aussi faibles en PET, les fibres de perles sont produites (figure 4A). Cela a été éliminé par augmentation de la concentration de la solution PET à 8%, ce qui produit des nanofibres uniformes possédant un diamètre moyen de 255 nm ± 2,4 nm (moyenne ± SEM) et la taille moyenne de pores de 1,43 pm ± 0,02 um (figures 4B, 5A et B). Pour electrospin nanofibres il était nécessaire de réduire la taille de l&#39;aiguille de 18 G à 23 G, permettant des débits plus lents whilst maintenir une vitesse d&#39;écoulement supérieur et de réduire le blocage de l&#39;aiguille, un problème récurrent avec l&#39;aiguille plus grande. Lorsque électrofilature microfibres, une augmentation de la solution PET à&gt; 30% de PET conduire à un manque d&#39;uniformité dans le diamètre des fibres (Figure 4F) en plus de multiples blocages à la pointe de l&#39;aiguille en raison de la viscosité élevée de la solution. Tapis de microfibres uniformes possédant un diamètre de fibre moyen de 2,50 pm ± 0,02 um (moyenne ± SEM) et la taille moyenne de pores de 10,45 pm ± 0,13 um ont été produites lorsque électrofilage d&#39;une solution de PET en poids / vol de 30% à un débit de 2 ml / h de débit -1 (figures 4F, 5A et B). Électrofilature séquentielle de l&#39;échafaud de nanofibres directement sur ​​un échafaudage en microfibre (encore attaché au mandrin) a créé un échafaudage biphasique (Figure 3D). Les diamètres de fibres moyenne était de 280 nm ± 20 nm et 2,30 um ± 0,06 um pour les nanofibres et microfibre phases respectivement,comparable à dimensions de nanofibres et microfibre échafaudages individuels. En outre, l&#39;épaisseur de l&#39;échafaudage biphasique a été similaire à la somme des nanofibres et des échafaudages microfibres individuelles (Figure 5C). Grâce à l&#39;augmentation de la vitesse du mandrin (2000 rpm / 440 m · min -1), hautement alignées nano- ou microfibres échafaudages ont été produites. La solution à 8% de PET en poids / vol n&#39;a pas été optimale pour produire des nanofibres alignées et fibres produites possédant une morphologie en forme d&#39;onde (figure 3F). Une augmentation à 10% de PET annulé cet effet, mais encore abouti à un diamètre de fibre réduite (216 nm ± 2,2 nm (moyenne ± SEM)) par rapport aux échafaudages de nanofibres alignées au hasard. alignement de la fibre a été calculée en déterminant la déviation de l&#39;angle de chaque fibre à partir de l&#39;angle de fibre moyenne. Dans échafaudages de nanofibres alignées 79% de fibres ont été alignées (± 10 ° angle moyen de la fibre) comparativement à 10,2% de fibres dans aligné au hasard scaff de nanofibresolds (Figure 5D). Le nanofibres échafaudage de 8% a été utilisé pour récapituler le RBM sur lequel résident les cellules épithéliales, et a été utilisé pour soutenir la culture de cellules de CALU3 (une voie aérienne cellules épithéliales en ligne). Le poids / volume microfibre échafaudage de 30%, étant plus poreux dans la nature a été utilisé pour simuler la région de la sous-muqueuse, et a été cultivé avec des cellules MRC5 (fibroblastes une cellule des voies aériennes de ligne). Les 10% en poids / volume nanofibres alignées échafaudage fourni référencement topologique pour assurer l&#39;alignement des cellules de l&#39;ASM lors de la culture sur l&#39;échafaud. Les trois types de cellules ont montré une augmentation de la viabilité lorsqu&#39;ils sont cultivés sur leurs échafaudages individuelles sur une période de 2 semaines (figure 6A), et a exprimé des protéines spécifiques de type cellulaire après la période de culture de 2 semaines (figure 6B, 6C, et 6D). Une caractérisation plus poussée des interactions individuelles cellulaire échafaudage ont été signalés ailleurs 21. Le électrofilature séquentielle de l&#39;échafaud de nanofibressur l&#39;échafaudage en microfibres réalisé respectivement un échafaudage biphasique pour la co-culture des cellules épithéliales CALU3 et des cellules de fibroblastes MRC5 sur les nanofibres et microfibres phases. La culture des deux cellules dans des conditions statiques ensemble a été rapporté ailleurs 22. D&#39;autres travaux de tenter d&#39;ajouter d&#39;autres couches de cellules ou de prolonger le temps de culture biphasique delà de 2 semaines sous conditions statiques avérées infructueuses (données non présentées). Pour un modèle de culture à trois couches sur une longue période, on a utilisé un bioréacteur d&#39;écoulement de perfusion. Le CALU3 et cellules MRC5 ont été ensemencées sur l&#39;échafaudage biphasique, et les cellules ensemencées sur un ASM échafaud alignés, et les deux ont été cultivées séparément pendant 2 jours. Les deux échafaudages ont ensuite été achetées ensemble pour former un modèle à trois couches de la paroi des voies aériennes à l&#39;intérieur du bioréacteur (Figure 7). Les deux chambres ont été perfusé avec les médias pendant 7 jours avant la chambre de l&#39;épithélium apical avait ses médias enlevés, et les cellules épithéliales ont été cultivées à laALI pendant 7 jours. Les échafaudages ont été fixés et soit sectionnés et colorés, ou échafaudages entiers ont été immunocolorées pour les marqueurs spécifiques des cellules. Les articles à travers la culture tri-couche ont montré des noyaux de cellules distribuées à travers les trois couches de la co-culture (Figure 8B). Lorsque les cellules ont été immunocolorées pour des marqueurs spécifiques des cellules, les cellules épithéliales remplis de la phase de nanofibres apical comme une cellule-couche confluente et colorées positives pour la cytokératine (Figure 8C), la phase de microfibres, les fibroblastes colorées positives pour S100A4 (figure 8D), et sur les 10% de cellules échafaudage ASM alignés colorées positif pour SM22α (Figure 8E), indiquant une bonne survie de chaque type de cellule dans le modèle 3D de la paroi des voies aériennes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig1.jpg" /> Figure 1. Le bronchiole des voies aériennes. Biopsie bronchique à partir d&#39;une gravevoies aériennes asthmatiques montre l&#39;épithélium sur la membrane réticulaire du sous-sol (RBM), avec la région de sous-muqueuse sous-jacente remplie avec des cellules mésenchymateuses, et les faisceaux de muscle lisse entourant peuplées avec des cellules de muscle lisse coloration des muscles lisses alpha-actine (brun). La barre d&#39;échelle indique 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig2.jpg" /> Figure 2. Un schéma de l&#39;appareil d&#39;électrofilage. Une seringue contenant la / solution de solvant du polymère (avec aiguille attachée) est placé sur une pompe à seringue en regard du mandrin. Un potentiel électrique est établi entre les fibres et le mandrin d&#39;aiguille provoquant être éjectées à partir de la pointe d&#39;aiguille et déposées sur le mandrin rotatif. Comme passe la fibre à travers l&#39;atmosphère,l&#39;évaporation du solvant provoquant le dépôt de fibres de polymère sur le mandrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig2large.jpg" target="_blank">cliquez ici pour S&#39;il vous plaît voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig3.jpg" /> Figure 3. Comparaison des échafaudages électrofilées à l&#39;ECM des voies respiratoires natif. Des images de microscope électronique à balayage de la membrane décellularisée du sous-sol (A), des voies respiratoires décellularisée bronchiole section (C) et une coupe histologique d&#39;un bon faisceau musculaire des voies respiratoires (colorées à l&#39;hématoxyline et de l&#39;éosine, échelle bar 40 pm) (E) par rapport à nanofibres (B) biphasique (D) et (F) alignés échafaudages en PET. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir</a>une version plus grande de cette figure. Tableau 1. Paramètres utilisés pour électrofilature la microfibre, nanofibres et alignés échafaudages individuellement et pour l&#39;échafaud biphasique. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig4.jpg" /> Figure 4. Modification des concentrations PET affecte les caractéristiques des fibres. Les images de microscopie électronique à balayage d&#39;échafaudages électrofilées filées à partir de 6%, 8%, 10% (AC), 25%, 30% et 35% (EG) (poids / volume) des solutions de PET . Également montré échafaudages sont alignés produites à partir de 8% (D) et 30% des solutions de PET (H) poids / VOL. AD imagée à 5000 x grossissement, EH imagé au 1,000X grossissement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande</a>version de ce chiffre. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig5.jpg" /> Figure 5. Propriétés de électrofilées échafaudages en PET. Courbes (A) de distribution montrant la distribution de diamètre des fibres de la membrane réticulaire sous-sol matrice extracellulaire (ECM RBM), alignés au hasard nano- et micro-fibres échafaudages, et l&#39;échafaud de nanofibres alignées. (B) histogramme montrant la distribution relative de la taille des pores dans nano- et micro-fibres échafaudages. (C) de l&#39;épaisseur moyenne des nanofibres, des échafaudages, microfibre biphasiques et alignés (moyenne ± écart-type, n = 6). (D) histogramme montrant l&#39;écart par rapport à l&#39;orientation des fibres moyenne dans les échafaudages de nanofibres aléatoires ou alignés analyse des fibres d&#39;échafaudage a été réalisée en utilisant le logiciel ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig5large.jpg" target="_blank">P</a>louer cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig6.jpg" /> Figure 6. La culture des types cellulaires individuels sur les échafaudages individuels. (A) des résultats d&#39;analyse alamarBlue cellule de viabilité de cellules ASM sur échafaudages alignés, les cellules CALU3 sur des échafaudages de nanofibres et des cellules MRC5 sur des échafaudages en microfibres (moyenne ± SEM, n = 3 20). images de microscopie électronique à balayage de la nanofibre, microfibre et des échafaudages de fibres alignées (B, C et D respectivement) et des images immunofluorescence de cellules CALU3 colorées pour la E-cadhérine (rouge), MRC5 colorées pour vinculine (rouge) et les cellules ASM colorées pour SM22α (rouge) sur toute leur échafaud spécialisé (E, F et G respectivement). Hoechst a été utilisé pour colorer les noyaux (bleu), barre d&#39;échelle indique 40 &amp;# 181;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig7.jpg" /> Figure 7. Système de perfusion pour les tri-couche modèle de paroi des voies aériennes. (A) Photographie de récipient bioréacteur relié à la pompe péristaltique et les réservoirs de médias 2x. (B) Schéma des échafaudages tri-couches. (C) Schéma des deux circuits de bioréacteurs lorsque le modèle de voies est maintenu à l&#39;interface air-liquide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/52986/52986fig8.jpg" /> Figure 8. Complete 3D modèle de paroi des voies aériennes. (A) la biopsie bronchique de la paroi des voies aériennes avec la couche de muqueuse surlignés en rouge, la région de la sous-muqueuse surligné en vert, et le faisceau de muscle lisse souligné en or. (B) Section à travers la paroi des voies respiratoires tri-couches constitué d&#39;échafaudages biphasique et alignés peuplées avec épithéliales, fibroblastes et les cellules musculaires lisses fixes après 2 semaines de co-culture. Les noyaux cellulaires ont été colorées avec du DAPI (bleu) avec échafaudage réflectance (gris) en même temps imagé. Les échafaudages ont également été fixés et immunocolorées pour les marqueurs spécifiques des cellules après 2 semaines, avec des cellules de CALU3 colorées pour cytokératine (vert) (C), les cellules MRC5 colorées pour S100A4 (vert) (D), et les cellules musculaires lisses colorées pour SM22α (rouge) ( E). La barre d&#39;échelle indique 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52986/52986fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Tableau 1.

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Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches<em&gt; In Vitro</em&gt; Modèle du mur Airway

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

adapting-electrospinning-process-to-provide-three-unique-environments

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

12.3K vues.  University of Nottingham. Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall. 

Vidéo: Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-couches électrofilage pour imiter l&#39;architecture native artérielle à l&#39;aide polycaprolactone, l&#39;élastine et du collagène: une étude préliminaire

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Recherche

Bio-ingénierie

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

Une boîte à outils pour permettre la conversion d&#39;hydrocarbures en milieu aqueux

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Étude de la séparation d’écoulement tridimensionnelle induite par un polype de pli vocal modèle

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

Cellulaire in vitro modèle de culture pour le contrôle des produits chimiques toxiques inhalés

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Génération d&#39;une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Développement d&#39;un modèle organotypique multicellulaire en trois dimensions de la muqueuse intestinale humaine Grown Sous microgravité

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Orgue Culture Modèle de la murine disque intervertébral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.