Ce travail a été soutenu par une bourse de l&#39;American Heart Association prédoctorale à JLI et les National Institutes of Health octroi R01AR056624.

A. seul polymère Électrofilage <ol><li> Avant de préparer la solution électrofilage, faire une solution à 0,5% en poids du photoamorceur, Irgacure 2959 (I2959), dans l&#39;eau déminéralisée en dissolvant à 37 ° C pendant plusieurs jours. Cette étape n&#39;est pas nécessaire si un polymère photoréactif n&#39;est pas utilisé. </li><li> Combinez méthacrylatée acide hyaluronique (Meha, voir Burdick et al. Pour la synthèse), le poly (oxyde d&#39;éthylène) (PEO, 900 kDa), et I2959 dans l&#39;eau désionisée pour préparer une solution avec une concentration finale de 2% en poids Meha, 3% en poids % en poids de PEO, et 0,05 I2959. Utilisez un vortex pour mélanger la solution jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit claire. Le type de polymère et de concentration, ainsi que le solvant utilisé peut être modifié à cette étape, selon les propriétés souhaitées échafaudage. </li><li> Transférer la solution dans une seringue et fixer une jauge de 18, 6 pouces de long, l&#39;aiguille extrémité émoussée à la fin. </li><li> Programme d&#39;une seringue pour éjecter à un taux de 1,2 ml / hr. Insérer la seringue et l&#39;aiguille dans le dispositif. </li><li> Fixez le fil à la terre d&#39;une source d&#39;alimentation haute tension de l&#39;appareil de collecte. Pour collecter les fibres aléatoirement distribués utiliser une plaque de métal plat, ou d&#39;utiliser un mandrin en rotation à ~ 10 m / s pour recueillir des fibres alignées. Fixez la tête chargée positivement à l&#39;aiguille. Voir Figure 1 pour un schéma de l&#39;appareil électrofilage. </li><li> Ajuster l&#39;aiguille ou d&#39;un dispositif de collecte, de telle sorte que il ya une distance de 15 cm entre les deux. </li><li> Démarrer le flux de la pompe à seringue. Lorsque le liquide est visualisée sur la pointe de l&#39;aiguille, tournez sur la source d&#39;alimentation et régler la tension à 22 kV. </li><li> Après la collection est complète (de quelques minutes pour les films minces, jusqu&#39;à 24 heures pour un matelas plus épais), enlever l&#39;échafaud de l&#39;appareil de collecte et de le stocker sous vide pendant une nuit pour assurer l&#39;élimination complète du solvant. </li><li> Visualisez la morphologie des fibres par microscopie électronique à balayage (MEB), un échafaudage représentatif est montré dans la figure 1 pour les deux structures alignées et non-alignés. </li></ol> Remarque: Le débit de l&#39;échantillon, la distance à l&#39;appareil de collecte, et la tension dépend de la combinaison de polymères et de solvants et doivent être optimisés pour chaque système, généralement par l&#39;observation de la morphologie échafaud avec SEM. Photoréticulation B. et Photopatterning <ol><li> Découpez 5mm X 5mm échantillons du tapis échafaud. </li><li> Préparez-vous à réticulation en plaçant chaque échafaudage sur une feuille couverte lame de verre, en plaçant le photomasque directement sur l&#39;échafaud, couvrant avec une lame de verre propre et écrêtage deux extrémités avec pinces pour reliure. Remarque: quatre échantillons qui peut être fait à la fois, et une transparence sans un motif peut être utilisé pour la réticulation si un motif n&#39;est pas souhaitée. </li><li> Purger échafaudage mis en place dans une chambre d&#39;azote. Il est important de garder le concept exempt d&#39;oxygène, qui peuvent inhiber la réticulation. </li><li> Placez échafaudage de configuration dans la chambre de l&#39;azote sous ~ 10 mW / cm 2 de lumière de 365 nm avec un adaptateur collimation pendant 5 minutes. Voir schéma de la figure 2. </li><li> Retirez chaque échafaudage et le placer dans une plaque 12 puits. </li><li> Ajouter 2 mL d&#39;eau déminéralisée dans chaque puits, la plaque de parafilm pour éviter l&#39;évaporation de l&#39;eau et placer à 37 ° C pendant 24 heures. Changez l&#39;eau trois fois. </li><li> Visualisez formation de pores au microscope optique (voir exemple en figure 2). Les échafaudages sont maintenant prêts à utiliser. </li></ol> Remarque: photoréticulation n&#39;est pas nécessaire pour de nombreux types de polymères, cependant photopatterning ne peut être utilisée avec des polymères photoréactifs. C. Double Polymer électrofilage avec fluorescent visualisation fibre <ol><li> Préparer une solution à 5% en poids de PEO (200 kDa) dans l&#39;éthanol à 90%. Incorporer à 700 rpm à 50 ° C pendant au moins 2 heures avant électrofilage. </li><li> Transférer la solution de PEO à une seringue et ajouter DAPI pour une concentration finale de 10 mg / mL dans la solution électrofilage. Enveloppez la seringue dans l&#39;aluminium pour le protéger de la lumière. </li><li> Préparer la même solution décrite dans l&#39;étape A2, à l&#39;exception également ajouter méthacryloxyéthyle thiocarbamoyle rhodamine B (MeRho, 683,24 g / mol) pour une concentration finale de 25 pM dans la solution électrofilage. Enveloppez la seringue dans l&#39;aluminium pour le protéger de la lumière. </li><li> Soigneusement utiliser du scotch pour sécuriser des lamelles en verre méthacrylatée (voir Khademhosseini et al.) À la surface du mandrin. Remarque: les fibres deviennent attachés à lamelles de verre méthacrylatée. </li><li> Fixez une extrémité d&#39;un morceau de 5 mm de long tube en silicone avec des pièces jointes luer lock à l&#39;un des seringues et attacher l&#39;autre extrémité à une aiguille. Insérer la seringue dans le pousse-seringue et mettre l&#39;aiguille à travers le trou dans le paysan. Répétez avec l&#39;autre seringue et paysan sur le site en face du mandrin. Les vanneurs traduire le longueur du mandrin et sont utilisés pour assurer une distribution égale des deux polymères résultant de la échafaud. Voir schéma de la figure 3. </li><li> Ajustez les paramètres décrits dans la Section A de façon appropriée conformément au Tableau 1. S&#39;assurer que les pointes d&#39;aiguille sont centrées sur le mandrin. Tableau 1. Double Polymer Paramètres Électrofilage <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Seringue </td><td> Paysan à la pointe de l&#39;aiguille (cm) </td><td> Pointe de l&#39;aiguille à mandrin (cm) </td><td> Débit (ml / h) </td><td> Tension appliquée (kV) </td></tr><tr><td> Meha </td><td> 6 </td><td> 15 </td><td> 1.2 </td><td> 22 </td></tr><tr><td> PEO </td><td> 6 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 15 </td></tr></tbody></table> </li><li> Une fois que tout est correctement aligné, éteignez les lumières et tourner sur le mandrin et le pousse-seringues. Retirer le papier d&#39;aluminium à partir des seringues. Lorsque le liquide est visible sur la pointe des deux aiguilles, tournez simultanément sur les blocs d&#39;alimentation et branchez le vanneurs. </li><li> Lorsque la collecte est terminée, éteignez l&#39;alimentation et le mandrin et débranchez le vanneurs. Retirez délicatement les lamelles et le ruban à l&#39;aide d&#39;une lame de rasoir. </li><li> Visualisez les fibres en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres pour la rhodamine et DAPI. Voir l&#39;exemple en figure 3. Remarque: fibres fluorescentes sont les plus clairs pour voir où électrofilé pour de courtes périodes de temps (&lt;3 minutes), cependant, ce processus peut être prolongée pour une durée illimitée afin de créer des constructions plus épais, surtout sans l&#39;utilisation de l&#39;lamelles de verre . </li></ol> Cellules ensemencement D. sur les échafaudages <ol><li> Placez chaque lamelle avec électrofilé polymères attachés à un individu puits d&#39;une plaque de taille appropriée ainsi. Note: les interactions cellulaires avec les fibres sont facilement visibles par électrofilage sur des lamelles de verre méthacrylatée. En outre, MeRho peut à nouveau être utilisé pour la visualisation de la fibre. </li><li> Incuber les échafaudages en PBS nuit pour assurer une élimination complète du solvant et de toute lixiviables éventuels sous-produits. </li><li> Retirez le CPE dans les puits. </li><li> Pour stériliser les échafaudages, les placer sous une lampe germicide dans une hotte à flux laminaire pendant 30 minutes. Si une pleine échafaudage est ensemencé, flip sur l&#39;échafaud et placer sous une lampe germicide pour un autre 30 minutes. </li><li> Effectuer culture cellulaire standard et préparer une suspension cellulaire concentrée à la densité cellulaire désirée (par exemple, 6.000 cellules cm -2). Par exemple, utiliser 100 ml de suspension cellulaire pour une lamelle de 22 mm x 22 mm. Placer dans l&#39;incubateur pendant 1 heure. </li><li> Ajouter la quantité appropriée de milieux de culture cellulaire à chaque puits. Placez les échafaudages de nouveau dans l&#39;incubateur. </li><li> Colorer les cellules en utilisant un kit disponible dans le commerce Live / Dead. Remarque: d&#39;autres types de coloration des cellules, telles que le DAPI (noyaux cellulaires) et marqué par fluorescence phalloïdine (fibres de stress d&#39;actine) peut être appliqué à visualiser les cellules. </li><li> Visualisez les cellules et les fibres en utilisant un microscope à fluorescence équipé de filtres pour TRITC et FITC. Voir l&#39;exemple à la figure 4. </li></ol> Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure1tmb.jpg" border="0" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma illustrant la configuration du périphérique pour la formation d&#39;échafaudage non-alignés (en haut) et aligné échafaudage de formation (en bas). Exemple de numérisation d&#39;images en microscopie électronique de chaque type d&#39;échafaudage sont affichés. Barre d&#39;échelle = 5 um. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure1.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 1. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure2tmb.jpg" border="0" alt="Figure 2" /> Figure 2. Schéma de la méthode de structuration. Les motifs sont formés en plaçant un photomasque entre la source de lumière et d&#39;échafaudage lors de photoréticulation puis emportant polymère inaltéré. L&#39;image photomasque et SEM d&#39;échafaudages, après formation de pores et la lyophilisation. Barre d&#39;échelle = 100 pm. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure2.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure3tmb.jpg" alt="Figure 3" border="0" /> Figure 3 Schéma de la configuration multi-polymère et les paramètres électrofilage de traitement nécessaires, ainsi qu&#39;une image représentative fluorescente d&#39;un mélange de deux populations de fibres (par exemple: rouge et bleu Meha PEO). Qui ont été simultanément électrofilé pour former un échafaudage multi-polymère . Barre d&#39;échelle = 100 pm. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure3.jpg">cliquez ici</a> pour voir une plus grande version de la figure 3. <img src="/files/ftp_upload/1589/1589figure4tmb.jpg" border="0" alt="Figure 4" /> Figure 4. Un exemple d&#39;image coloration Live / Dead de cellules souches mésenchymateuses humaines et leurs interactions avec les fibres électrofilé. Barre d&#39;échelle = 100 pm. S&#39;il vous plaît <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1589/1589figure4.jpg">cliquez ici</a> pour voir une version agrandie de la figure 4.

<ol>
	<li>Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolf, M. A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+degradation+and+mechanical+behavior+of+photopolymerized+hyaluronic+acid+networks.">Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks.</a> Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).</li><li>Baker, B. M., Gee, A. O., Metter, R. B., Nathan, A. S., Marklein, R. A., Burdick, J. A., Mauck, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+to+improve+cell+infiltration+in+composite+fiber-aligned+electrospun+scaffolds+by+the+selective+removal+of+sacrificial+fibers.">The potential to improve cell infiltration in composite fiber-aligned electrospun scaffolds by the selective removal of sacrificial fibers.</a> Biomaterials. 29, 2348-2358 (2008).</li><li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications.">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Engineering. 13, 2369-2385 (2007).</li><li>Khademhosseini, A., Eng, G., Yeh, J., Fukuda, J., Blumling, J., Langer, R., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromolding+of+photocrosslinkable+hyaluronic+acid+for+cell+encapsulation+and+entrapment.">Micromolding of photocrosslinkable hyaluronic acid for cell encapsulation and entrapment.</a> J. Biomed Mater Res A. 79A, 522-532 (2006).</li><li>Mauck, R. L., Baker, B. M., Nerurkar, N. L., Burdick, J. A., Li, W. J., Tuan, R. S., Elliott, D. M., M, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+on+the+Straight+and+Narrow:+The+Mechanics+of+Nanofibrous+Assemblies+for+Fiber-Reinforced+Tissue+Regeneration.">Engineering on the Straight and Narrow: The Mechanics of Nanofibrous Assemblies for Fiber-Reinforced Tissue Regeneration.</a> Tissue Engineering B. 15, 171-193 (2009).</li><li>Sill, T. J., Von Recum, H. a. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospinning:+applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering.">Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).</li><li>Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospun+fibrous+scaffolds+with+multi-scale+and+photopatterned+porosity.">Electrospun fibrous scaffolds with multi-scale and photopatterned porosity.</a> , (2009).</li></ol>

Électrofilage a été utilisé pour préparer des échafaudages fibreux à partir de polymères. Photoréticulables échafaudages à base d&#39;acide hyaluronique ont été utilisés comme un exemple illustratif, où l&#39;exposition de lumière est nécessaire à la réticulation. Avec l&#39;utilisation de macromères réactives, telles que Meha, les canaux qui ont déjà démontré améliorée distribution cellulaire ont été incorporées dans les échafaudages avec l&#39;utilisation d&#39;un masque pendant photoré...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DAPI</td>
<td> Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>I2959</td>
<td>Reagent</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 200 kDa</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences</td>
<td>17503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEO 900 kDa</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>189456</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B</td>
<td>Reagent</td>
<td>Polysciences</td>
<td>23591-100</td>
<td>Prepare stock solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Live/Dead Stain Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>L3224</td>
<td>Contains Calcein (stains live cells green) and ethidium homodime (stains red dead cells)</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe Pump</td>
<td>Equipment</td>
<td>KD Scientific</td>
<td>KDS100</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Power Source</td>
<td>Equipment</td>
<td>Gamma High Voltage</td>
<td>ES30P-5W</td>
<td>Two are needed for dual polymer spinning</td>
</tr>
<tr>
<td>Motor</td>
<td>Equipment</td>
<td>Triem Electric Motors, Inc</td>
<td>0132022-15</td>
<td>Must attach to a custom built mandrel</td>
</tr>
<tr>
<td>Tachometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Network Tool Warehouse</td>
<td>ESI-330</td>
<td>Use to monitor mandrel speed</td>
</tr>
<tr>
<td>Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>Exfo Life Sciences Division</td>
<td>S1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51135K151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Female Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K293</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Lock Male Adapter</td>
<td>Equipment</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>51525K143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Equipment</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>14-825-16H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips</td>
<td>Equipment</td>
<td>Corning</td>
<td>2875-22</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture

Comme le domaine de l&#39;ingénierie tissulaire évolue, il ya une demande énorme pour produire des matériaux plus adaptés et les techniques de transformation afin de répondre aux exigences (par exemple, la mécanique et la vascularisation) des organes plus complexes et les tissus. Électrofilage est une technique populaire pour créer des échafaudages fibreux qui imitent l&#39;architecture et de l&#39;échelle la taille de la matrice extracellulaire native. Ces échafaudages fibreux sont également utiles comme substrats de culture cellulaire, car les fibres peuvent être utilisés pour diriger le comportement cellulaire, y compris la différenciation des cellules souches (voir examens approfondis par des Mauck<em&gt; Et al.</em&gt; Et Sill<em&gt; Et al.</em&gt; Pour plus d&#39;informations). Dans cet article, nous décrivons le processus général de électrofilage de polymères et comme un exemple, un acide hyaluronique electrospin réactif capable de réticulation avec exposition à la lumière (voir Ifkovits<em&gt; Et al.</em&gt; Pour une revue sur les matériaux photoréticulables). Nous introduisons également des capacités de traitement supplémentaires telles que photopatterning et multi-formation de polymères échafaud. Photopatterning peut être utilisé pour créer des échafaudages avec des canaux et multi-échelle pour augmenter la porosité infiltration cellulaire et la distribution des tissus. Multi-polymère échafaudages sont utiles pour mieux ajuster les propriétés (mécanique et de la dégradation) d&#39;un échafaudage, y compris sur mesure porosité pour une infiltration cellulaire. En outre, ces techniques peuvent être étendues pour inclure un large éventail de polymères et de macromères réactive pour créer des échafaudages complexes qui fournissent les repères nécessaires pour le développement de constructions tissus succès d&#39;ingénierie.

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Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

Le processus de électrofilage de polymères pour l&#39;ingénierie tissulaire et de culture cellulaire est abordée dans cet article. Plus précisément, l&#39;électrofilage des macromères photoréactif avec des capacités de traitement supplémentaires de photopatterning et multi-polymère électrofilage est décrite.

Électrofilage treillis polymères fibreux pour l&#39;ingénierie tissulaire et de la culture cellulaire

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

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Research

JoVE Journal

Biology

21.4K vues.  University of Pennsylvania. Le processus de électrofilage de polymères pour l'ingénierie tissulaire et de culture cellulaire est abordée dans cet article. Plus précisément, l'électrofilage des macromères photoréactif avec des capacités de traitement supplémentaires de photopatterning et multi-polymère électrofilage est décrite.

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Experimental Approaches to Tissue Engineering

Approches expérimentales pour le génie tissulaire

Recherche

Biologie

Micro-scale Engineering for Cell Biology

Micro-échelle d&#39;ingénierie de biologie cellulaire

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

La microfabrication de Chip entreprises Échafaudages pour la culture cellulaire en trois dimensions

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Interview: Bioreactors and Surfaced-Modified 3D-Scaffolds for Stem Cell Research

A Nature Editorial in 2003 asked the question "Good-bye, flat biology?" What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems, mainly monolayer cultures, often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.
The last generation of CellChips -- micro-thermoformed containers -- a specific technology was developed, which offers the additional possibility to modify the whole surface of the 3D formed containers. This allows a surface-patterning on a submicron scale with distinct signalling molecules. Sensors and signal electrodes may be incorporated. Applications range from basic research in cell biology to toxicology and pharmacology. Using biodegradable polymers, clinical applications become a possibility. Furthermore, the last generation of micro-thermoformed chips has been optimized to allow for cheap mass production.

In the past many in vitro culture systems -- mainly monolayer cultures -- often suffered from the disadvantage that differentiated primary cells had a relatively short life-span and de-differentiated during culture. As a consequence, most of their organ-specific functions were lost rapidly. Thus, in order to reproduce better conditions for these cells in vitro, modifications and adaptations have been made to conventional monolayer cultures.

Interview: bioréacteurs et de surfaçage-Modified-3D Echafaudages pour la recherche de cellules souches

A Nature Editorial in 2003 asked the question  "Good-bye, flat biology?"  What does this question imply? In the past, many in vitro culture systems,  ...

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Encapsulation Cellulaire dans les hydrogels 3D pour l&#39;ingénierie tissulaire

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

Ingénierie cellulaire perméable protéines

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un système de culture de cellules épithéliales de l&#39;iris Pigment étudier la régénération Lens Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

Transduction of Human Cells with Polymer-complexed Ecotropic Lentivirus for Enhanced Biosafety

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for laboratory personnel. Pantropic lentiviruses, such as the commonly used VSV-G pseudotype, are a valuable tool for studying gene function because they can transduce many cell types, including non-dividing cells. However, researchers may wish to avoid production and centrifugation of pantropic viruses encoding oncogenes due to higher biosafety level handling requirements and safety issues. Several potent oncogenes, including c-Myc and SV40 large T antigen, are known to enhance production of induced pluripotent stem cells (iPSC). All other known iPSC-inducing genetic changes (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, and p53 loss of function) also have links to cancer, making them of relatively high safety concern as well. 
While these cancer-related viruses are useful in studying cellular reprogramming and pluripotency, they must be used safely. To address these biosafety issues, we demonstrate a method for transduction of human cells with ecotropic lentivirus, with additional emphasis on reduced cost and convenient handling. We have produced ecotropic lentivirus with sufficiently high titer to transduce greater than 90% of receptor-expressing human cells exposed to the virus, validating the efficacy of this approach. 
Lentivirus is often concentrated by ultracentrifugation; however, this process takes several hours and can produce aerosols infectious to human biomedical researchers. As an alternative, viral particles can be more safely sedimented onto cells by complexation with chondroitin sulfate and polybrene (CS/PB). This technique increases the functional viral titer up to 3-fold in cells stably expressing murine retrovirus receptor, with negligible added time and cost. Transduction of human dermal fibroblasts (HDFs) is maximally enhanced using CS/PB concentrations approximately 4-fold lower than the optimal value previously reported for cancer cell lines, suggesting that polymer concentration should be titrated for the target cell type of interest. We therefore describe the use of methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) to assay for polymer toxicity in a new cell type. We observe equivalent viability of HDFs after viral transduction using either polymer complexation or the standard dose of polybrene (PB, 6 &mu;g/ml), indicating minimal acute toxicity.
In this protocol, we describe the use of ecotropic lentivirus for overexpression of oncogenes in human cells, reducing biosafety risks and increasing the transduction rate. We also demonstrate the use of polymer complexation to enhance transduction while avoiding aerosol-forming centrifugation of viral particles.

Lentiviruses are a valuable research tool for exploring gene function; however, researchers may wish to avoid production of pantropic lentivirus encoding known or suspected oncogenes. As an alternative, we present a safer protocol for use of ecotropic lentivirus on human cells modified to express the ecotropic receptor mSlc7a1.

Transduction des cellules humaines avec des polymères complexés Lentivirus écotrope pour Enhanced biosécurité

Stem and tumor cell biology studies often require viral transduction of human cells with known or suspected oncogenes, raising major safety issues for ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Induction et les essais de l&#39;hypoxie en culture cellulaire

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...