Ce protocole permet la culture in vitro et la visualisation microscopique directe des tissus isolés des voies respiratoires lors de différentes procédures de manipulation tissulaire, telles que la désépithélisation et la régénération des tissus des voies respiratoires. L’imagerie in situ proposée dans cette étude permet une surveillance rapide et non destructive de la lumière trachéale lors de l’ablation contrôlée guidée par imagerie de l’épithélium endogène et de l’administration des cellules exogènes. La plate-forme de bioréactivité guidée par imagerie et les protocoles de manipulation tissulaire peuvent être utilisés pour générer des tissus des voies respiratoires issus de la bioingénierie pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments.
La construction et l’utilisation du bioréacteur tissulaire des voies respiratoires par imagerie seront démontrées par deux doctorants de notre groupe de recherche, Mohammad Mir, et Jiawen Chen. Pour commencer à créer un dispositif d’imagerie in situ, insérez une lentille tubulaire dans un tube de lentille empilable et fixez-la à l’aide d’un anneau de retenue. Ensuite, montez l’ensemble de la table d’objectif sur une caméra CMOS scientifique via un adaptateur à monture C.
Utilisez le logiciel Micromanager pour faire fonctionner l’appareil photo et acquérir des photos et des vidéos. Lorsque vous visez un objet situé à 10 mètres de la caméra, ajustez la distance entre l’objectif tubulaire et le capteur d’imagerie de la caméra jusqu’à ce qu’une image focalisée de l’objet se forme sur l’écran de l’ordinateur. Ensuite, utilisez des composants de système de cage optique, tels que la tige d’assemblage, la plaque de cage filetée et le cube de cage pour monter une lentille filtrante sur un miroir dichroïque à double bord, super-résolution et un laser sur l’appareil.
Connectez un objectif 20X à l’appareil. Ensuite, montez une lentille verte d’un diamètre de 500 micromètres à l’extrémité distale du tube de l’objectif via le traducteur X-Y. Ajustez la distance entre les lentilles vertes et les lentilles de l’objectif pour former les images microscopiques focalisées.
Pour visualiser la lumière isolée de la trachée de rat en champ lumineux ou fluorescent, placez le bioréacteur sur la scène d’imagerie. Ensuite, infuser 500 microlitres de l’ester de carboxyfluorescéine succinimidyle fraîchement préparé, ou solution CFSE, à un débit de cinq millilitres par minute à travers la trachée via la pompe à seringue reliée au tube de la canule de trachée. Une fois que la solution CFSE remplit la trachée, arrêtez la pompe.
Après 10 minutes, lavez la lumière de la trachée en injectant 10 millilitres de PBS à l’aide de la pompe à seringue pour éliminer les réactifs CFSE résiduels non incorporés. Après le lavage, insérez l’extrémité d’imagerie distale de la lentille verte dans la trachée via le connecteur luer fixé à une extrémité de la trachée. Ensuite, déplacez doucement la lentille verte à l’intérieur de la trachée jusqu’à ce que la surface de la trachée soit focalisée.
Pour capturer les images en champ lumineux dans le logiciel micromanager, illuminez la lumière de la trachée avec de la lumière blanche à travers le cube de la cage. Ensuite, cliquez sur l’icône Live pour afficher la surface lumineuse de la trachée en temps réel. Utilisez les onglets Imagerie et Exposition pour modifier le temps d’exposition à la valeur souhaitée.
Pour régler le contraste et la luminosité des images, utilisez la fenêtre de mise à l’échelle de l’histogramme et de l’intensité pour déplacer les flèches noir et blanc au point final de l’affichage de l’histogramme interactif. Cliquez sur Arrêter en direct pour activer l’icône Snap, puis cliquez sur l’icône Snap pour figer l’image. Ensuite, utilisez le paramètre Exporter puis Images en tant qu’onglets déplacés pour enregistrer les images dans le format souhaité.
Pour obtenir des photos et des vidéos en mode fluorescent, illuminez la lumière de la trachée avec une lumière laser spécifique à CFSE à travers le cube de la cage et acquérez les images en temps réel en déplaçant la sonde d’imagerie d’avant en arrière. Une fois les photos et les vidéos obtenues, retirez doucement la lentille verte de la trachée. Pour la désépithélialisation de la trachée, instiller 50 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 2% fraîchement préparé à travers la canule de la trachée pour générer un film mince de la solution détergente sur la lumière de la trachée.
Après l’instillation, fermez les connexions de tuyauterie du bioréacteur à l’aide de bouchons mâles ou femelles et transférez le bioréacteur dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour permettre à la FDS de rester dans la trachée. Répétez l’instillation une fois. Après la deuxième instillation, retirez l’épithélium lysé et le SDS en irriguant la lumière de la trachée trois fois avec 500 microlitres de PBS via une pompe à seringue à un débit de 10 millilitres par minute.
Ensuite, placez le bioréacteur sur un agitateur pour vibrer mécaniquement à une fréquence de 20 Hertz et une amplitude de déplacement de 0,3 millimètre pour favoriser physiquement le détachement des cellules épithéliales traitées par SDS de la lumière de la trachée. Pendant que la trachée est vibrée mécaniquement, instillez 500 microlitres de PBS deux fois à travers la lumière de la trachée pour éliminer les FDS résiduelles et les débris cellulaires. Après l’ablation de l’épithélium, évaluez la clairance de la couche épithéliale en mesurant l’intensité du CFSE à l’aide du dispositif d’imagerie à lentille verte.
Après avoir préparé une trachée de rat désépithélialisée, décongeler les cellules souches mésenchymateuses congelées, ou CSM, pendant 30 secondes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Ensuite, comptez les cellules avec un hémocytomètre, puis préparez une solution cellulaire avec une concentration de cinq fois 10 à six cellules par millilitre. Ensuite, marquez les cellules de manière fluorescente en les incubant avec deux millilitres de solution cfSE de 100 micromolaires à température ambiante.
Après 15 minutes, rincer les cellules avec cinq millilitres de PBS trois fois avant de les réutiliser dans un milieu de culture DMEM frais à une concentration finale de trois fois 10 à sept cellules par millilitre. Immédiatement après la préparation de l’hydrogel de collagène I, comme décrit dans le manuscrit, ajoutez les cellules à la solution d’hydrogel avec la concentration souhaitée. Ensuite, mélangez les cellules et la solution de gel avec une micropipette pour obtenir un mélange cellulaire-hydrogel uniforme.
Ensuite, fixez une extrémité de la trachée dans le bioréacteur à une pompe à seringue programmable à travers un connecteur luer et délivrez cinq millilitres de milieu de culture frais dans la chambre du bioréacteur à 37 degrés Celsius pour couvrir la surface extérieure de la trachée. Ensuite, administrer 10 bolus de microlitres du mélange cellule-hydrogel dans la trachée désépithélialisée dans le bioréacteur pour générer une couche d’hydrogel cellulaire sur la lumière de la trachée. Après l’injection cellulaire, placez le bioréacteur dans un incubateur de culture cellulaire stérile à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour la gélification pendant 30 minutes pour permettre la gélification.
Pour visualiser la distribution des cellules implantées, stérilisez la lentille verte avec de l’alcool isopropylique ou de l’éthanol à 70% et placez le bioréacteur sur la scène d’imagerie pour obtenir les photos et les vidéos en mode champ lumineux et fluorescent. Après 30 minutes d’ensemencement cellulaire, infuser un millilitre de milieu de culture dans la lumière de la trachée à un débit d’un millilitre par minute. Enfin, cultivez la trachée ensemencée dans le bioréacteur dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant le temps souhaité.
Pendant la culture cellulaire, gardez le milieu à l’intérieur de la lumière statique, tandis que le milieu à l’extérieur de la trachée est continuellement perfusé via un flux unidirectionnel. Dans les images en champ lumineux et fluorescentes de la trachée désépithélialisée, aucun signal fluorescent n’a été observé avant le marquage CFSE. Avec le CFSE, un signal fluorescent uniforme a été observé dans tout l’épithélium.
Après la désépithélialisation, l’intensité fluorescente a été considérablement réduite, ce qui indique une ablation de l’épithélium. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de la trachée désépithélialisée a illustré l’élimination de l’épithélium pseudo-stratifié de la lumière de la trachée et la préservation des cellules et de la matrice extracellulaire, ou microstructures ECM, dans les couches tissulaires sous-jacentes. De plus, la coloration pentachrome et trichrome a confirmé le maintien de l’architecture tissulaire de la trachée et des composants ECM, tels que le collagène et les protéoglycanes.
L’immunofluorescence des cellules épithéliales et du collagène I a révélé l’élimination complète de l’épithélium et la préservation du collagène I dans le tissu sous-épithélial. Les micrographies électroniques à balayage indiquaient que la trachée native était peuplée de cellules multicindées et gobelets. Dans la trachée désépithélialisée, la membrane basale a été exposée, comme l’indiquent un réseau maillé de fibres de matrice extracellulaire et l’absence de cellules épithéliales.
Les images de fluorescence de la trachée désépithélialisée, lors de l’ensemencement avec du PBS et du collagène, sont montrées ici. Par rapport aux cellules ensemencées via un milieu de culture, les cellules marquées par fluorescence délivrées par hydrogel sont restées adhérées plus uniformément à travers la lumière. L’étude de viabilité cellulaire a démontré que la viabilité n’était pas affectée par la procédure d’administration cellulaire et que plus de 90% des cellules restaient viables.
La création d’une fine pellicule de détergent dans le processus de désépithélisation et l’utilisation de l’hydrogel comme vecteur pour les cellules sont des étapes essentielles au succès de ce protocole. Notre prochain objectif de recherche est d’implanter des cellules primaires ou souches des voies respiratoires cultivées en laboratoire sur le tissu des voies respiratoires désépithélialisé afin d’étudier si le tissu fonctionnel des voies respiratoires peut être préparé.
