Les auteurs tiennent à remercier Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) et Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc) pour une excellente assistance technique avec des expériences de microscopie. Cette étude a été financée par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (à OPO) et K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), l&#39;American Heart Association 13GRNT16220002 (à OPO) et Ben Lipps J. bourse de recherche de l&#39;American Society of Nephrology (DVI).

Les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le Comité de soin et l&#39;utilisation institutionnelle animale au Collège médical du Wisconsin et de l&#39;Université du Health Science Center Texas à Houston et étaient en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1 montre principales étapes de la séparation des tissus et la procédure de traitement. En bref, les reins des rats PCK ou SD sont utilisés pour l&#39;isolation manuelle de monocouches épithéliales des canaux collecteurs soit de tubes ou des kystes non-composé en bonne santé. Ici, nous avons étudié les reins à partir de 4-16 semaines vieux rats PCK 10,13. 1. Isolement des kystes rénaux et tubules communicantes (CNT) / des tubes collecteurs (CD) Segments <ol><li> Anesthetize animal expérimental avec de l&#39;isoflurane (5% induction, 1,5 à 2,5% de maintenance) / note 2 O médical ou autre méthode approuvée. Les animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer le suffisantevel de l&#39;anesthésie. Respiratoires vitesse de réaction et de pincement de l&#39;orteil Stable sont utilisés pour confirmer l&#39;anesthésie appropriée. </li><li> Laparotomie et rincer les reins, avec un tampon phosphate salin (PBS) à travers l&#39;aorte abdominale 17. <ol><li> Préparer un cathéter de tuyaux en polyéthylène (PE50) et le connecter à une pompe seringue remplie de PBS. Couper la peau et la paroi abdominale le long de la ligne blanche, puis faire une incision abdominale transversale à travers l&#39;abdomen de droite à gauche et déplacer les organes abdominaux avec des cotons-tiges pour obtenir l&#39;accès à l&#39;aorte descendante avec branchement mésentériques et coeliaques artères. Humidifiez les organes internes avec une solution saline au chaud pendant d&#39;autres procédures pour empêcher leur sécheresse. </li><li> Placez une ligature (# 1) autour des artères mésentériques et la maladie cœliaque et une autre ligature (n ° 2) autour de l&#39;aorte sous le diaphragme (ne pas attacher). Séparez délicatement un. abdominalis par émousser disséquer les tissus conjonctifs autour de lui avec des pinces fines et placez deux ligatures ~ 3mm au-dessous de l&#39;artère rénale gauche (n ° 3) et au-dessus de la bifurcation artères iliaques (n ° 4). </li><li> Attachez ligature N ° 4 et attacher un collier de récipient autour de l&#39;aorte entre l&#39;artère rénale gauche et ligature # 3. Faire une incision entre la pince et la ligature # 4 à sonder l&#39;aorte, utiliser ligature n ° 3 pour fixer fermement le cathéter. </li><li> Relâchez la pince et assurez-vous que l&#39;impulsion de sang est visible dans le cathéter pour assurer une bonne installation. Commencez la perfusion à un débit de 6 ml / min, cravate ligatures # 1 et # 2, et couper la veine rénale gauche. Continuer à rincer pendant 1-2 min jusqu&#39;à ce que les organes sont complètement blanchis. </li><li> Couper les vaisseaux sanguins rénaux, l&#39;urètre et autour des tissus conjonctifs et adipeux avec des ciseaux pour recueillir les reins. Ensuite, faire une courte déchirure dans capsule rénale et éplucher les reins pour les décapsuler. Placez les reins en PBS glacé. L&#39;euthanasie est confirmée par une thoracotomie. </li></ol></li><li> Préparer 5 x 5 mm éclats de verre de recouvrement revêtues de poly-L-Lysine. Coupez un gla de couvertureSS avec un crayon de diamant et lieu environ 20 pi de solution à 0,01% stérile filtrée Poly-L-lysine sur chaque puce de verre. Préparer une solution saline et deux paires de pinces horloger pour la dissection. </li><li> Couper les reins avec une lame de rasoir le long du plan frontal en tranches d&#39;épaisseur 2/1 ~ mm. Placez l&#39;une des tranches sous un stéréomicroscope. Isolement de tissus devrait être fait dans une solution saline glacée. </li><li> Localiser kystes sous un stéréomicroscope comme cavités forme arrondie (figure 2A); leurs murs contiennent souvent important réseau de vaisseaux sanguins proliféré. Aide d&#39;une pince à pointe fine dissèquent la couche épithéliale interne d&#39;un kyste aussi mince que possible pour obtenir une zone de monocouche. Attacher à une puce en verre recouvert de poly-L-Lysine. Collant surface Poly-L-lysine permet au chercheur de positionner fermement la couche interne du kyste sur verre. Exposer le kyste avec le côté apical pour fournir un accès pour les pipettes (figure 2B). </li><li> Utilisez PCK ou SD rat enfanttranches centrales ney contenant papille pour l&#39;isolement de non dilatées CNT / CCDsegments 18-21. REMARQUE: tissus papillaires sont plus durables que le cortex et en maintenant des bandes tubulaires papillaires avec une pince et déchirant le long axe radial de la tranche peut être clivée en secteurs minces. Tubules individuels sont visibles et peuvent être retirées pour être placé sur des puces de verre de couverture. </li><li> Identifier les segments CNT / CCD par bifurcations, de transparence plus élevé que les tubules proximaux et grandes cellules bien visible (figure 2C). Placez la puce de verre de couverture avec tubules fixés sous un microscope équipé d&#39;micromanipulateurs appropriés pour micropipettes conduite. Utilisation micropipettes pointus tubules split-ouvertes et joindre leurs bords pour le verre pour rendre la surface apicale accessible (figure 2D). </li></ol> Électrophysiologie 2. Single Channel patch-clamp <ol><li> Remplir la chambre de patch-clamp avec une solution de bain et transférer la puce de verre de couvertureavec des tissus isolés à la chambre. Veiller à ce que les micro-pipettes de patch-clamp ont une résistance de 7-10 MQ pour des mesures fiables (cellule attachée) sur des cellules. </li><li> Pour les mesures cellule attachée, définir le taux de gain de l&#39;amplificateur à 20x et passe-bas les courants à 300 Hz par un filtre à huit pôles Bessel. Pour les canaux ENaC surveillance, utiliser une solution de bain, en mm: 150 NaCl, CaCl2 1, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7,4); pipette: 140 LiCl, MgCl 2 2 et 10 HEPES (pH 7,4). </li><li> Mener une expérience de patch-clamp conventionnel dans un mode cellule attachée 10. Sélectionner une cellule dans la monocouche epitheliale et l&#39;approche de la pipette à la membrane apicale. Former un joint haute résistance entre une pipette et la membrane cellulaire en appliquant une aspiration douce. Une fois un joint gigaohm haute résistance est formée, un protocole sans interstice à un potentiel de maintien devrait être lancé pour l&#39;activité de surveillance du canal d&#39;intérêt. </li><li> Simples données actuelles Channel Store écart-libres de gigaPhoques Ohm pour analyse ultérieure. Analyser les événements de canaux en utilisant un logiciel généralement fourni avec des configurations de patch-clamp 18. Calculer l&#39;activité du canal que NPo où N désigne le nombre de canaux actifs dans le patch et P o est ouverte probabilité moyenne des canaux. REMARQUE: Utilisez des kystes ou des tubules isolés dans des expériences de patch-clamp pour pas plus de 30 min. </li></ol> 3. Ratiométrique épifluorescence mesures de la concentration intracellulaire de calcium dans les cellules épithéliales <ol><li> Utilisez 5 mM Fura-2 heures dissous dans le DMSO. Solution aliquote du stock dans des tubes coniques de 500 pi individuels (environ 10 pi). Protéger de la lumière et de stocker dans le congélateur à -20 ° C pour un maximum de six mois. </li><li> Incuber kystes isolés et les tubules dédoublé ouvert pour 30-40 min dans PSS (en mm: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, CaCl 2 2 et 10 HEPES à pH 7,35) contenant 5 uM de Fura-2 heures colorant et 0.05% d&#39;acide pluronique pour aider à disperser les esters acétoxyméthyliques. Pour cela, placez les tissus dans le 3,5 cm plat contenant le chargement cocktail, protéger de la lumière et incuber sur un agitateur lent à la température ambiante. </li><li> Changer Fura-deux heures contenant les médias à nettoyer PSS après incubation et placez le tissu sous un microscope pour effectuer une imagerie complémentaire à épifluorescence. </li><li> Tournez sur la caméra CCD et source de lumière stable (système de monochromateur) équipé de roue à filtres (chaque position du filtre peut être associé à son propre niveau d&#39;atténuation, sélectionné chaque fois que le filtre est appelé). </li><li> Trouver le tissu dans le champ lumineux. Commutateur de détection du signal de fluorescence et régler l&#39;intensité de la source de lumière en utilisant des filtres de densité neutre et puissance de la lampe pour éviter la saturation du signal. </li><li> Surveiller Fura-2 AM fluorescence dans l&#39;échantillon de tissu avec une excitation à 340/380 nm ratiométrique avec une fréquence de 0,125 Hz ou plus. Utilisez un 40 × / NA 1.3 ou similaire objectif pour bon résolutionsimage tion. </li><li> Pour le traitement et les calculs d&#39;image importer la séquence d&#39;images. Assurez-vous de séparer les canaux et utiliser un mode HyperStack en niveaux de gris. Sélectionnez plusieurs régions d&#39;intérêt (cellules simple kyste ou des zones sélectionnées de tissu kystique) et de calculer les valeurs d&#39;intensité pour chaque canal (340 et 380 nm) dans le logiciel d&#39;analyse de données pratique; valeurs d&#39;intensité de fond soustraire de chaque point de données. </li><li> Pour chaque point de temps de calculer le rapport des intensités des Fura-2 AM 340 à 380 canaux. Terrain scatter / ligne des changements de point de temps de la Ca transitoire pour chaque région et de calculer des valeurs moyennes / SE. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nous avons décrit ici applications de la technique de patch-clamp conventionnel et imagerie épifluorescence de calcium à des monocouches épithéliales kystiques dérivées d&#39;un modèle génétique murine de ARPKD. Le protocole se compose de trois étapes, dont la plus grande attention devrait être accordée à l&#39;isolement des kystes (étape 1.5 de la section des protocoles) et les études électrophysiologiques. Ces procédures clés nécessitent une formation approfondie et de patience, et le lecteur ne de...

Les canaux ioniques jouent un rôle important dans de nombreuses fonctions physiologiques, y compris la croissance et la différenciation cellulaires. Les maladies rénales autosomiques dominants et récessifs polykystiques (PKRAD et PKRAR, respectivement) sont des troubles génétiques caractérisées par le développement de kystes remplis de fluide rénal de l&#39;origine des cellules épithéliales tubulaires. PKD est causée par des mutations de gènes codant pour PKD1 ou PKD2 polycystines 1 et 2, des protéines membranaires impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et la différenciation. PKD2 par lui-même ou sous forme de complexe avec PKD1 fonctionnent également en tant que cation -permeable canal 1 de Ca2 +. Les mutations du gène codant fibrocystine PKHD1 (une protéine de type récepteur cils associés impliqués dans le tubulogenèse et / ou maintien de la polarité de l&#39;épithélium) sont l&#39;impulsion génétique de ARPKD 2. La croissance de kyste est un phénomène complexe accompagnée de la prolifération perturbée 3,4, 5 l&#39;angiogenèse, la dédifférenciation et la perte de polairelité de cellules tubulaires 6-8. Réabsorption défectueuse et la sécrétion augmentée dans l&#39;épithélium kystique contribuent à l&#39;accumulation de liquide dans la lumière et l&#39;expansion kyste 9,10. Facultés dépendant du débit [Ca2 +] i la signalisation a été également liée à kystogenèse cours PKD 11-15. Ici, nous décrivons une méthode appropriée pour la mesure de patch-clamp de l&#39;activité de canal unique et les niveaux intracellulaires de Ca2 + dans des monocouches epitheliales kystiques isolés de rats PCK. Cette méthode a été appliquée avec succès par nous pour caractériser l&#39;activité du canal Na + épithélial (ENAC) et 10 [Ca2 +] i dépendante processus induits par le Ca 2+ TRPV4 -permeable et purinergique cascade de signalisation 13. Dans ces études, nous avons utilisé des rats PCK, un modèle de ARPKD causée par une mutation spontanée dans le gène PKHD1. La souche PCK était originallY provenant de rats 16 rats ainsi SD sont utilisés comme un contrôle approprié pour la comparaison avec la souche PCK Sprague-Dawley (SD). En conséquence, les deux segments de rats SD néphron et des conduits non dilaté collecte isolés à partir de rats PCK mêmes peuvent servir de deux groupes de comparaison différents pour des expériences sur l&#39;épithélium kystique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1015">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:183px;">F-14185</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Flou-8</td>
			<td style="width:219px;">AAT Bioquest</td>
			<td style="width:183px;">21091</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">P4707</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Pluronic acid</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">F-68&#160;</td>
			<td style="width:333px;">solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Shaker</td>
			<td style="width:219px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:183px;">260350</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Light source</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">Lambda XL</td>
			<td style="width:333px;">with integrated shutter/filter wheel driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Neutral density filters</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">ND4, ND8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Objective</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SFluo&#160;</td>
			<td style="width:333px;">40/1.3 DIC WD 0.22&#160;&#160; oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Camera</td>
			<td style="width:219px;">Andor Technologies</td>
			<td style="width:183px;">Zyla sCMOS</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:283px;">Nikon&#160; microscope (inverted)</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon Eclipse TE2000-S</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:219px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:183px;">6661B52</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Diamond pencil</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:183px;">22268912</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Image acquisition software</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Nikon NIS-Elements&#160;</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:283px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:219px;">ImageJ</td>
			<td style="width:183px;">http://imagej.nih.gov/</td>
			<td style="width:333px;">ND Utility plugin allows to import images in the native Nikon Instruments .nd2 format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Patch Clamp amplifier</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Data Acquisition System</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">Digidata 1440A</td>
			<td style="width:333px;">Axon Digidata&#174; System</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Low Pass Filter</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">LPF-8</td>
			<td style="width:333px;">8 pole Bessel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:219px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:183px;">1B150F-4</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:283px;">Micropipette Puller</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">P-97</td>
			<td style="width:333px;">Flaming/Brown type micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microforge</td>
			<td style="width:219px;">Narishige</td>
			<td style="width:183px;">MF-830</td>
			<td style="width:333px;">Japan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Motorized Micromanipulator</td>
			<td style="width:219px;">Sutter Instrument Co</td>
			<td style="width:183px;">MP-225</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">Eclipse Ti</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Microvibration isolation table</td>
			<td style="width:219px;">TMC</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">equipped with Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Multichannel valve perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">AutoMake Scientific</td>
			<td style="width:183px;">Valve Bank II</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Recording/perfusion chamber</td>
			<td style="width:219px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:183px;">RC-26</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Software</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:183px;">pClamp 10 . 2</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Temperature controlled surgical table&#160;</td>
			<td style="width:219px;">MCW core</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;">for rodents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Binocular stereomicroscope</td>
			<td style="width:219px;">Nikon</td>
			<td style="width:183px;">SMZ745</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Syringe pump-based perfusion system</td>
			<td style="width:219px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">polyethylene tubing</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;">PE50</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Isofluorane anesthesia</td>
			<td style="width:219px;"><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td>
			<td style="width:183px;">911103</td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;"></td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:333px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:283px;">Other basic reagents</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implementing patch clamp and live fluorescence microscopy to monitor functional properties of freshly isolated pkd epithelium

Cyst initiation et l&#39;expansion au cours de la maladie polykystique des reins est un processus complexe caractérisé par des anomalies dans la prolifération des cellules tubulaire, l&#39;accumulation de fluide luminal et formation de la matrice extracellulaire. L&#39;activité des canaux ioniques et la signalisation intracellulaire de calcium sont des paramètres physiologiques clés qui déterminent les fonctions de l&#39;épithélium tubulaire. Nous avons développé une méthode appropriée pour l&#39;observation en temps réel de l&#39;activité des canaux ioniques avec la technique de patch-clamp et l&#39;enregistrement de Ca2 + intracellulaire niveau dans les monocouches épithéliales fraîchement isolés à partir de kystes rénaux. Rats PCK, un modèle génétique autosomique récessive de la maladie polykystique des reins (ARPKD), ont été utilisés ici pour l&#39;analyse ex vivo de canaux ioniques et des flux de calcium. Décrit ici est une procédure étape par étape détaillé destiné à isoler monocouches kystiques et tubules non dilatée de PCK ou rats normaux Sprague Dawley (SD), et de surveiller l&#39;activité de canal unique et dynamique intracellulaire de Ca2 +.Cette méthode ne nécessite pas de traitement enzymatique et permet une analyse dans un cadre natif de monocouche épithéliale fraîchement isolés. De plus, cette technique est très sensible aux variations de calcium intracellulaire et génère des images à haute résolution pour des mesures précises. Enfin, isolé épithélium kystique peut encore être utilisé pour la coloration avec des anticorps ou des colorants, la préparation des cultures primaires et la purification de différents dosages biochimiques.

Implication potentielle dans ENaC cystogénèse a été démontrée par de nombreuses études qui observe perturbé le facteur de croissance épidermique (EGF) de signalisation dans la progression PKD 22-25 et la réabsorption du sodium dans anormal ARPKD Les modèles murins et les cultures de tissus 26-28. Par exemple, Veizis et al. Ont montré que l&#39;absorption de Na + sensible à l&#39;amiloride est diminuée dans les cellules CD à partir du modèle de non-orthologue de s...

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Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Les canaux ioniques exprimés dans l&#39;épithélium tubulaire rénal jouent un rôle important dans la pathologie de la maladie polykystique des reins. Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux utilisés pour effectuer l&#39;analyse et le niveau de calcium intracellulaire mesures patch-clamp dans l&#39;épithélium kystique fraîchement isolées à partir de reins de rongeurs.

Mise en œuvre de patch clamp en direct et microscopie de fluorescence pour surveiller propriétés fonctionnelles des fraîchement isolés PKD épithélium

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K vues.  Medical College of Wisconsin.  Les canaux ioniques exprimés dans l'épithélium tubulaire rénal jouent un rôle important dans la pathologie de la maladie polykystique des reins. Nous décrivons ici les protocoles expérimentaux utilisés pour effectuer l'analyse et le niveau de calcium intracellulaire mesures patch-clamp dans l'épithélium kystique fraîchement isolées à partir de reins de rongeurs. 

Vidéo: Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

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Biologie

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Pressure-polishing Pipettes for Improved Patch-clamp Recording

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording. We first developed this method for fabricating pipettes suitable for recording from small (&lt;3 m) neuronal cell bodies. The basic principal is similar to glass-blowing and combines air pressure and heat to modify the shape of patch pipettes prepared by a conventional micropipette puller. It can be applied to so-called soft (soda lime) and hard (borosilicate) glasses. Generally speaking, pressure polishing can reduce pipette resistance by 25% without decreasing the diameter of the tip opening (Goodman and Lockery, 2000). It can be applied to virtually any type of glass and requires only the addition of a high-pressure valve and fitting to a microforge. This technique is essential for recording from ultrasmall cells (&lt;5 m) and can also improve single-channel recording by minimizing pipette resistance. The blunt shape is also useful for perforated-patch clamp recording since this tip shape results in a larger membrane bleb available for perforation.

This is a guide to modifying the shape of glass micropipettes. Specifically, by using heat and air pressure the taper is widened without increasing the tip opening, leading to lower pipette resistance. This is critical to obtain low noise recordings of small cells but is useful in many applications.

Pression de polissage Pipettes Amélioration patch-clamp

Pressure-polishing is a method for shaping glass pipettes for patch-clamp recording.  We first developed this method for fabricating pipettes suitable for ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Imagerie time-lapse de la mitose après transfection de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basées sur la fluorescence de mesure de l&#39;entrée du calcium magasin fonctionnant dans des cellules vivantes: à partir de cellules cancéreuses en culture de fibre musculaire squelettique

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

Préparation des liposomes de géant pour l&#39;imagerie et de patch-clamp électrophysiologie

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal cellulaire attaché patch-clamp enregistrement

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Reconstitution d&#39;une protéine transmembranaire, le Ion canal de voltage-dépendants, KvAP, en géant vésicules unilamellaires pour la microscopie et Patch études Clamp

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Single-channel Analysis and Calcium Imaging in the Podocytes of the Freshly Isolated Glomeruli

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells in the pathogenesis of various renal diseases has been established since podocyte injury leads to proteinuria and foot process effacement. It was previously reported that various endogenous agents may cause a dramatic overload in intracellular Ca2+ concentration in podocytes, presumably leading to albuminuria, and this likely occurs via calcium-conducting ion channels. Therefore, it appeared important to study calcium handling in the podocytes both under normal conditions and in various pathological states. However, available experimental approaches have remained somewhat limited to cultured and transfected cells. Although they represent a good basic model for such studies, they are essentially extracted from the native environment of the glomerulus. Here we describe the methodology of studying podocytes as a part of the freshly isolated whole glomerulus. This preparation retains the functional potential of the podocytes, which are still attached to the capillaries; therefore, podocytes remain in the environment that conserves the major parts of the glomeruli filtration apparatus. The present manuscript elaborates on two experimental approaches that allow 1) real-time detection of calcium concentration changes with the help of ratiometric confocal fluorescence microscopy, and 2) the recording of the single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli. These methodologies utilize the advantages of the native environment of the glomerulus that enable researchers to resolve acute changes in the intracellular calcium handling in response to applications of various agents, measure basal concentration of calcium within the cells (for instance, to evaluate disease progression), and assess and manipulate calcium conductance at the level of single ion channels.

Changes in the intracellular calcium levels in the podocytes are one of the most important means to control the filtration function of glomeruli. Here we explain a high-throughput approach that allows detection of real-time calcium handling and single ion channels activity in the podocytes of the freshly isolated glomeruli.

Single-channel Analyse et Imagerie de calcium dans les podocytes des glomérules fraîchement isolés

Podocytes (renal glomerular epithelial cells) are known to regulate glomerular permeability and maintain glomerular structure; a key role for these cells ...