Ce travail a été soutenu par le support de gouvernement en vertu de la concession numéro EPS-0903795 attribués par la National Science Foundation, NIH NIDCR R01-DE019355 (MJY PI), et Grant 8P20 GM103444 (YM PI).

1. Préparation de gélatine substrat contenant pour Three-Dimensional Bioprinting d&#39;alginate hydrogels <ol><li> Préparer le substrat calcium / gélatine selon la méthode de substrat calcium / gélatine décrite par Pataky et al 11 pour éviter viabilité réduite associée à une teneur élevée. La méthode de substrat calcium / gélatine est listé ci-dessous. <ol><li> Moissonneuse chlorure de calcium dihydraté (1,5% en poids), du chlorure de sodium (0,9% en poids), et de la gélatine porcine (2% en poids) dans de l&#39;eau distillée et porter à ébullition pendant 2 min à créer une solution de gélatine à 100 mM. </li></ol></li><li> Verser 5 ml de la solution de gélatine / calcium dans 100 mm boîtes de Pétri standard, tourbillonner la solution autour de lui pour un revêtement uniforme sur la surface, et le placer sur une surface plane dans le réfrigérateur pour gel O / N (permet de gélifier au moins 8 h avant utilisation). </li><li> Pour augmenter l&#39;opacité de la surface du substrat, ajouter le dioxyde de titane (0,3% en poids) à la / CaCl 2 une solution de gélatine. Agiter pendant 10 min. Autoclave la solution de gélatine / TiO 2 sur le cycle de liquides pendant 30 min à stériliser. <ol><li> Ajouter 3 ml de la / TiO 2 de solution de gélatine à la surface des plaques de gélatine préparés précédemment. Agiter le mélange pour assurer qu&#39;elle est répartie uniformément sur la surface. Laisser gel dans le réfrigérateur à 4 ° C O / N (laisser gélifier au moins 8 heures avant utilisation). Les supports doivent être utilisés dans les 3 jours. </li></ol></li></ol> 2. Alginate oxydation <ol><li> Oxyder le bioink d&#39;alginate de sodium suivant le procédé de l&#39;alginate partiellement oxydé par Bouhadir et al 30 décrit ci-dessous. <ol><li> Pour faire une solution d&#39;alginate oxydé 5%, dissoudre 1 g d&#39;alginate de sodium dans 100 ml d&#39;eau distillée. Ajouter une solution aqueuse de periodate de sodium (0,25 M, 0,25 mmol), de l&#39;agent oxydant, pour produire une solution d&#39;oxydation de 5%. Agiter pendant 19 heures à température ambiante. Ajouter 40 ml d&#39;éthylène glycol à la solution après 24 h pour terminer la reaction. </li><li> Dissoudre 2,5 g de chlorure de sodium dans la solution. Ajouter une quantité en excès de l&#39;alcool d&#39;éthyle (2: 1 ratio) pour précipiter les alginates oxydés. Centrifuger à 1000 xg pour recueillir les précipités et re-les dissoudre dans de l&#39;eau distillée. Répétez le lavage à l&#39;éthanol. </li><li> Lyophiliser les pastilles d&#39;alginate oxydés et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Déterminer le degré d&#39;oxydation en mesurant le pourcentage de periodate de sodium avant d&#39;être consommé par la terminaison de l&#39;éthylène glycol. <ol><li> Préparer une solution d&#39;iodure de potassium (20% p / v, pH 7,0 tampon de phosphate de sodium) et une solution de thyodene (10% p / v, pH 7,0 tampon de phosphate de sodium). Mélanger les deux solutions avec l&#39;alginate oxydé à température ambiante. </li><li> Peu à peu tomber la solution de periodate d&#39;alginate de sodium et réagi dans le mélange de solutions d&#39;iodure de potassium et theodyne. Mesurer l&#39;absorbance du mélange par spectrophotométrie à 426 nm. Lorsque celui-ci atteint unmaximal, enregistrer le volume utilisé de solution de periodate alginate de sodium et que V 1. </li><li> La réaction est <img alt="Equation 1" fo:content-width="0.8in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.jpg" width="120" /> . La quantité de periodate de sodium qui n&#39;a pas réagi est <img alt="Équation 1.5" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/53156/53156eq1.5.jpg" width="150" /></li><li> Soustraire le montant de periodate de sodium qui n&#39;a pas réagi de la concentration initiale pour déterminer la quantité de sodium consommée periodate. En utilisant la formule précédente, déterminer le degré d&#39;oxydation finale de l&#39;alginate. </li></ol></li></ol> 3. Alginate Peptide Conjugaison <ol><li> Ligands conjugués avec une séquence arginine-glycine-aspartate exposée (peptide) dans l&#39;alginate oxydé préalablement préparé en suivant le procédé de conjugaison de l&#39;alginate de RGD Rowley et al 31 décrit ci-dessous, de promouvoir la fixation des cellules et la diffusion. </li><li> Utilisez carbod aqueusechimie iimide avec G 4 RGDSPto conjugué 31. </li><li> Dissoudre 1 g de 5% d&#39;alginate oxydé en un acide éthanesulfonique 0,1 M 2- (N-morpholino) (MES), pH = 4. Ajouter 1-éthyl- (diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC, 0,54 mmol) et de N-hydroxysuccinimide ( NHS, 0,27 mmol) à 2: 1 pour former l&#39;amide intermédiaire. </li><li> Ajouter 0,28 mmol peptide, un couplage à la chaîne principale du polymère d&#39;alginate par l&#39;intermédiaire de l&#39;aminé terminale. Agiter à RT O / N. </li><li> Arrêter la réaction de couplage en ajoutant 2,5 g de chlorure de sodium à la solution. Ajouter une quantité en excès de l&#39;alcool d&#39;éthyle (2: 1 ratio) pour précipiter les alginates oxydés. Centrifuger le mélange à 4000 xg pendant 5 minutes pour recueillir les précipités. Aspirer les médias dans la hotte de culture cellulaire et re-dissoudre les précipités dans de l&#39;eau distillée. Répétez le lavage à l&#39;éthanol. </li><li> Lyophiliser les précipités jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit complètement séché (apparaîtra comme une substance poudreuse blanche) et de les stocker dans le réfrigérateur à -20 ° C pour plus tardutiliser. </li></ol> 4. adipeux humain cellules stromales de Tissue Culture cellulaire (de hADSC) <ol><li> Cellules de stroma de tissu adipeux humain de culture (de hADSC) dans 75 cm traitées flacons de culture cellulaire (flacons T75), recouvert de 15 ml bas DMEM en glucose avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline-streptomycine, 1% de glutamine et 1% antimycine. Changer les médias, dans la hotte de culture de cellules, tous les deux jours jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient atteint la confluence (80-90%). </li><li> Une fois confluentes, transférer les flacons T75 à la hotte de culture cellulaire et de la suspension de hADSC en utilisant le procédé de digestion enzymatique de la trypsine. <ol><li> Dans la hotte, aspirer la totalité du milieu de culture cellulaire hors des cellules. Rincer avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec calcium et de magnésium (DPBS ++). Aspirer le DPBS ++ hors des cellules. </li><li> Alors que dans le capot, faire une solution de trypsine et DPBS ++ en mélangeant 1 ml de trypsine et 4 ml DPBS ++. Chaque flacon nécessite 5 ml de la solution, alors assurez le volume approprié pour le nombre de flacons confluentes. Ajouter 5 ml de la trypsine / DPBS ++ à chaque ballon et les mettre dans l&#39;incubateur pendant 2 min. </li><li> Après 2 min, retirer les flacons et tapoter sur les côtés de leur desserrer les cellules des fonds. Regardez chaque ballon sous un microscope pour assurer que les cellules sont suspendues. Placez les flacons de retour dans la hotte de culture cellulaire et ajouter 3 ml de milieux de culture cellulaire appropriée à chaque flacon. Ceci met fin à la réaction de la trypsine. </li><li> Transférer le milieu cellulaire chargé dans chaque flacon et mis dans un 50 ml conique. Centrifuger eux à 1000 g pendant 5 min. Les cellules doivent apparaître comme une petite pastille blanche dans le fond du cône. Transfert retour à la hotte de culture cellulaire et aspirer les médias. Remettre en suspension les cellules dans 2 ml de milieu de culture cellulaire. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre sous un microscope. Une fois que les cellules ont été comptés, dans la hotte de culture, aliquote la quantité de support contenant ~ 1,3 million cellules et le transfert de 15 ml conique. Centrifuger la conique de 15 ml contenant les cellules à nouveau pendant 5 min à 1000 x g. </li><li> Dans la hotte de culture, les cellules restantes réensemencer dans plusieurs flacons T-75, en ajoutant une concentration de 350.000 cellules ~ à chaque flacon. Ajouter 15 ml de milieu DMEM et revenir à l&#39;incubateur jusqu&#39;à confluence à nouveau. </li><li> Une fois le cycle de centrifugation est terminée, le retour 15 ml conique de la culture cellulaire. Aspirer le support du culot de cellules et remettre en suspension les cellules dans une solution d&#39;alginate aqueuse à une concentration de 1,3 millions de cellules par millilitre de bioink, terteriating la solution souvent il n&#39;y a donc une répartition homogène des cellules dans tout le bioink. Chargez la solution de cellules chargées dans une seringue de 3 ml d&#39;imprimante compatible stérile et visser le 22 G embout en plastique stérile. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinter Setup <ol><li> Allumer le bioprinter, chacun des ordinateurs de distributeur, et le recirculating bain d&#39;eau. <ol><li> Régler manuellement la température du bain d&#39;eau de recirculation pour le mécanisme de gélification. </li><li> Définir manuellement les paramètres d&#39;impression pour chaque distributeur sur l&#39;ordinateur corrélation de distributeur. Réglez le volume de distribution à 230 nl, nombre de backsteps à 0, et le taux de distribution de 10 ul -sec. </li></ol></li><li> Ouvrez le logiciel de conception et le programme pour visualiser l&#39;écran de la caméra USB sur l&#39;ordinateur. <ol><li> En utilisant le logiciel, saisir manuellement les coordonnées d&#39;un réseau de 5 x 5 points avec 2.4 mm espacement entre les gouttes. </li><li> Définissez les paramètres d&#39;impression d&#39;être: distance entre extrémité de pointe et la surface de substrat = 0,1 mm; hauteur seringue est levé entre les dépôts = 20 mm; la quantité de temps par dépôt = 1 sec. </li><li> Enregistrez le programme et l&#39;envoyer au robot. </li></ol></li><li> Placer le plat de gélatine / TiO 2 contenant Petri sur la scène de l&#39;imprimante C à 4 ° C. Fermez et verrouillez la porte de la chambre. </li><li> Utilisez le PLC surInItialize les sources de lumière ultraviolette, et la stérilisation de la chambre pendant 90 secondes. </li><li> Une fois la stérilisation est terminée, ouvrez la chambre et charger la seringue contenant en suspension dans alginate dans Gun 1. Fermer de hADSC et verrouiller la porte de la chambre. </li><li> Utilisez le PLC pour activer le système de ventilation, attendre 30 secondes pour la pression interne de l&#39;équilibre. </li><li> Sur l&#39;ordinateur, exécutez le programme contenant les paramètres de la voie et d&#39;impression géométriques. </li><li> Tout au long du processus d&#39;impression, regarder l&#39;affichage de la caméra USB sur l&#39;ordinateur pour confirmer l&#39;impression précise et uniforme. </li><li> Une fois l&#39;impression terminée, permettre les constructions à du gel pendant 40 min. </li></ol> 6. évaluation de la viabilité cellulaire <ol><li> Couvrir les constructions qui ne vont pas à imager immédiatement post-impression dans DMEM et de stocker dans l&#39;incubateur jusqu&#39;à ce que le temps de l&#39;imagerie. </li><li> Pour quantifier la viabilité des constructions, les teindre en utilisant un test de viabilité / cytotoxicité fluorescente à base, une image en utilisant la microscopie confocale. <ol><li> En suivant les instructions du kit, préparer une solution de coloration contenant la calcéine AM et éthidium homodimère-1. Pour 10 ml de solution de coloration, ajouter 20 ul de l&#39;éthidium homodimère-1 et 5 ul de la calcéine heures à 10 ml de solution stérile, tampon phosphate salin (+ magnésium + calcium; DPBS ++) de culture de tissus de qualité Dulbecco. </li><li> Plonger les constructions bioprinted dans la solution de tache pendant 15 minutes dans l&#39;obscurité. </li><li> Image les constructions colorées en utilisant un système de microscope confocal aux jours 0 et 8. prendre plusieurs photos de chaque construction bioprinted, en utilisant des paramètres Z-stack de 30 tranches optiques sur une profondeur de 300 um, et de compter manuellement les cellules. Si les cellules semblent jaune ou verte comptent eux aussi vivant, et si rouge, les compter comme morts. </li></ol></li><li> Calculer le pourcentage de viabilité cellulaire comme le nombre de cellules vivantes divisé par le nombre total de cellules dans la construction; La viabilité cellulaire = nombre decellules vivantes (vert + jaune) / nombre de cellules totales (vert + jaune + rouge) x 100%. </li><li> Calculer la quantité de prolifération de cellules pour chaque échantillon comme le nombre de cellules de 8 jours, divisé par le nombre de cellules au jour 0; La prolifération cellulaire = nombre de cellules vivantes au jour 8 / cellules vivantes compte au jour 0 x 100%. </li></ol> 7. RGD peptide Conjugaison Analyse <ol><li> Pour analyser le succès de RGD peptide conjugaison sur l&#39;alginate, l&#39;alginate de comparer RGD-conjugué et alginate non-conjugué. Pour cela, l&#39;image des constructions imprimés faire en utilisant (4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (DAPI) et phalloidin taches. <ol><li> Faire les phalloidins solution de travail en diluant 5 ul de la solution mère méthanolique avec 200 ul de DPBS ++. Conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Faire une solution stock de 300 um de la tache DAPI suivant l&#39;équation: (0,10509 g / L) / (350,3 g / mol) = 3 × 10 -4 M = 0,0003 = 0,300 M mm = 300 um. Assurez-èmesolution e DAPI de travail en diluant la solution de stock 1: 100 dans du DPBS ++ pour obtenir 3uM solution. Conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Immerger complètement l&#39;échantillon dans 4% de paraformaldehyde. Incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver trois fois avec du DPBS ++, laissant la solution reposer pendant 5 min à chaque lavage. Transférer l&#39;échantillon de gel du bien à une lame de verre, en feuilletant le gel au cours du processus. Immerger le gel dans 0,1% de Triton X-100 (0,1 g / 100 ml) dans du DPBS ++ pendant 10 min. Laver trois fois avec du DPBS ++, permettant 5 min pour chaque lavage. </li><li> Colorer les constructions avec la phalloïdine imprimés en les immergeant dans la solution de travail. Couvrir de papier aluminium et laisser incuber pendant 4 heures. Enlever la tache de phalloïdine et laver trois fois avec DPBS ++. Le premier lavage doit être rapide, les derniers lavages devraient s&#39;asseoir pendant 5 minutes chacun. </li><li> Colorer les constructions imprimés avec DAPI en les immergeant dans la solution de travail DAPI. Couvrir de papier aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 30 min. lavagetrois fois avec DPBS ++, permettant à chaque lavage pour reposer pendant 5 min. Observer et l&#39;image les échantillons sur un système de microscope confocal. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

L&#39;objectif principal de l&#39;ingénierie tissulaire est de combler le fossé entre la pénurie d&#39;organes et les besoins de transplantation en développant des substituts biologiques capables de restaurer, maintenir ou améliorer functio de tissu natif. Cela a conduit à la fabrication directe d&#39;échafaudages avec un complexe, géométrie externe anatomiquement correcte, et un contrôle précis sur la geometr interne. Bioprinting en trois dimensions est une méthode utilisée pour générer des constructions...

L&#39;ingénierie tissulaire utilise les principes de la biologie et de l&#39;ingénierie dans le développement de substituts fonctionnels pour maintenir, restaurer ou améliorer tissu natif et. La capacité de générer des constructions biomimétiques en trois dimensions à la demande serait de faciliter les progrès scientifiques et technologiques dans l&#39;ingénierie tissulaire, ainsi que dans les capteurs à base de cellules, médicaments / dépistage de la toxicité, modèles de tissus ou une tumeur, et d&#39;autres. L&#39;organisation tridimensionnelle des constructions de génie tissulaire est une composante fondamentale de la méthode de fabrication, car il doit étroitement imiter l&#39;interaction hautement organisé des cellules et la matrice extracellulaire dans le tissu natif. Échafaudages biodégradables en trois dimensions et la forme de formation sont des facteurs critiques dans la génération de nouvelles constructions de tissu parce que les cellules migrent pour former une couche à deux dimensions de cellules, mais pas la capacité de croître en trois dimensions désirée. L&#39;échafaudage sert de base temporaire pour cellulairel&#39;attachement et la prolifération, de sorte qu&#39;il doit être construit à partir de matériaux à porosité et la biodégradabilité contrôlable et integrit mécanique suffisante. Les matériaux d&#39;échafaudage ne doivent pas être cytotoxiques ou une réponse indésirable créer à partir de l&#39;hôte. Les hydrogels ont été couramment utilisé dans les techniques d&#39;ingénierie tissulaire, et en raison de leur caractère hydrophile, les hydrogels permettre l&#39;échange de fluide et de gaz à travers le structur. En combinant différents hydrogels, les propriétés de l&#39;hydrogel synthétisé sont modifiables à répondre à l&#39;exigence d&#39;application distincte. L&#39;approche de l&#39;ingénierie tissulaire classique implique la création d&#39;échafaudages sacrificielles poreuses acellulaire qui sont ensemencés avec des cellules post-fabricatio. De nombreuses techniques ont été employées, telles que le collage de la fibre, coulée au solvant, moulage et faire fondre, mais avérée peu efficace pour les applications d&#39;ingénierie tissulaire. Des méthodes de liaison des fibres des fibres permettent à être alignés dans des formes spécifiques, mais ils ne sont capables de production échafaudage très mince. Méthodes de coulée de solvant produites constructions très poreuses, cependant la membrane plus grand produit était seulement 3 mm thic. Par conséquent, la création de constructions à trois dimensions est impossible en utilisant ces techniques. Techniques de moulage par fusion prouvé réussi à produire des échafaudages tridimensionnels, mais de telles températures élevées sont nécessaires que les matériaux biologiques ne peuvent être incorporés pendant le procès de production. Les échafaudages ensemencés post-fabrication sont limitées dans leur capacité à répondre aux exigences de l&#39;ingénierie tissulaire pour produire des échafaudages tridimensionnels avec microstructures prédéfinis ou contrôlables et. Un autre problème majeur avec les technologies échafaudage de semis solides est l&#39;insuffisance de vascularisation et une mauvaise mécanique. Bioprinting a depuis été étendue à trois dimensions à l&#39;aide de gels, non toxiques, biodégradables thermo-réversible à remédier aux inconvénients de classique. Quelques-uns du solide freeform fabrication techniques actuellement employées sont bioprinting impression jet d&#39;encre et laser assistée. Techniques de bioprinting assistée par laser utilisent une source laser pulsée, une plaque de cible, et un substrat de réception afin de générer trois dimensions. Cependant, cette technique est limitée en raison du faible débit, la faible viabilité des cellules, et ne peut que produire régime limité de structures fabriquées car seuls photoréticulables prépolymères peuvent être utilisés pour former un hydrogel réticulé. Impression jet d&#39;encre a été développé comme une méthode non-contact qui reproduit les données d&#39;images numériques sur un substrat par dépôt d&#39;encre picolitres. Toutefois, l&#39;impression à jet d&#39;encre ne produit pas une haute résolution construction, construit expérience rapide dénaturation des protéines, et la plupart des cellules sont lysées pendant le dépôt. Actuellement, de nouvelles méthodes de fabrication de bioprinting additif ont été développés. Dans ces systèmes, des cellules, des protéines, des facteurs de croissance, et biomimétiques hydrogels sont généralement intégrés dans la matrice-mèreEIAA au cours du processus de fabrication et en même temps déposé utilisation de servomoteurs commandés par ordinateur pour générer des constructions cellulaires chargé base échafaudage en trois dimensions qui imitent la microarchitecture du natif. Les hydrogels chargés de cellules constituent le bioink, qui peut être hétérogène, constitué de plusieurs types de cellules ou homogène. Systèmes de fabrication additive dépôt bioink goutte-à-goutte ou de la couche par couche par l&#39;intermédiaire de seringues et embouts jetables sur une scène capable de se déplacer dans les x, y et z contrôlé par ordinateur. Grâce à un logiciel informatique, l&#39;architecture d&#39;échafaudages imprimés peut être facilement manipulé en fonction des besoins de l&#39;application. Contrairement aux techniques classiques, les technologies médicales tridimensionnelles (imagerie par résonance magnétique, tomographie par ordinateur) peuvent être incorporés dans les dessins, générant construction spécifique au patient. Ces méthodes permettent également la possibilité de produire des constructions en raison des remplacements vascularisés sont produites avec un l ultérieuredensité cellulaire Ocal, permettant des interactions cellule-cellule et l&#39;amélioration de la probabilité de post-implantation Surviva. L&#39;imprimante Palmetto est un système multi-distributeur en trois dimensions sur mesure qui utilise des méthodes de fabrication de robots programmables pour générer constructions de tissu hétérogènes tridimensionnels (Figure 1). Il permet l&#39;utilisation d&#39;une pluralité de matériaux dans des combinaisons uniques de réaliser des structures hétérogènes. L&#39;initialisation de la bioprinter est l&#39;une des étapes les plus importantes dans bioprinting car il vous permet de définir une série de paramètres pour optimiser l&#39;imprimabilité des constructions bioprinted. Le bioprinter comprend un procédé de type discontinu avec démarrage, fonctionnement séquences d&#39;arrêt et contrôlées par un contrôleur logique programmable (PLC), que l&#39;utilisateur opère par le biais d&#39;un panneau de commande à écran tactile interactif (figure 1, A). Pour éviter la contamination des biomatériaux logiques du bioprinter est enfermé dans un poly-pression positive (méthacrylate de méthyle) (PMMA) chambre avec un arrestance de particules à haute efficacité (HEPA) -filtered système de circulation d&#39;air (Figure 1, B, C). L&#39;intérieur de l&#39;imprimante peut être stérilisé en utilisant des sources de lumière ultraviolette intégrées (Figure 1, D). La composante centrale de la bioprinter est un robot de positionnement entièrement programmable qui peut reproductible placer un embout de distribution avec une précision de 10 microns (Figure 1, E). Il existe trois distributeurs qui sont capables de déposer des volumes aussi petits que 230 nl aide d&#39;une vis rotative (Figure 1, F). Ils sont indépendamment programmable à l&#39;aide des ordinateurs distincts qui régissent les paramètres d&#39;impression pour chaque distributeur (figure 1, G). Rotary-vis de distribution utilise la rotation d&#39;une vis motorisé pour se déplacer vers le bas bioink une seringue et sur l&#39;embout de la seringue. Ces distributeurs sont montés sur un pneumatiqueOutil Nest ment contrôlée (figure 2A, B), ce qui permet au robot de passer distributeur monté sur le bras robotisé de l&#39;axe Z sous contrôle programmé (Figure 1, H). Le robot XYZ reçoit des instructions d&#39;impression à partir d&#39;un logiciel de conception ordinateur exécutant (Figure 1, I). Chaque programme contient les emplacements de distribution, les routines de calibrage, et des protocoles de distribution changeante. La conception de constructions générées compose essentiellement de la coordonnées XYZ où chaque distributeur se déposer de la matière. Le bioprinter comprend deux capteurs de lumière optiques (figure 2C) qui déterminent les coordonnées XYZ de l&#39;extrémité de pointe de la seringue. Ces capteurs envoient des informations de coordonnées de robot, qui les utilise pour calculer les positions des extrémités de pointe de distribution. Il est un laser de déplacement supplémentaire (figure 2D) qui projette un 633 nm diode rouge faisceau laser de la taille du spot 30 x 100 micromètres pour mesurer la distance avec un accuracy de 0,1 micromètre. Lorsque le faisceau est fortement axé le robot détermine la distance en Z de la surface d&#39;impression. Cette mesure, et l&#39;optique de mesure de l&#39;extrémité de pointe en Z des capteurs de lumière, permet le calcul de Z coordonnées exactes utilisé pour placer la pointe du distributeur par rapport à la surface d&#39;impression. Les pointes de distribution se déplacent latéralement et verticalement à travers le capteur de lumière optique X-axe orienté de trouver les centres Y et Z, et latéralement à travers un capteur d&#39;axe Y pour trouver le centre de l&#39;axe-X. La surface d&#39;impression est mappé en utilisant la formule pour une surface plane dans l&#39;espace xyz: ax + by + cz = D pour déterminer où la surface est par rapport à la position de l&#39;extrémité de la pointe de distribution. L&#39;étape d&#39;impression (Figure 1, J) occupe une boîte de Petri de l&#39;échantillon de 80 mm de diamètre et utilise un bain d&#39;eau de remise en circulation pour maintenir la température de consigne (Figure 1, K). Température de l&#39;étage peut être réglée dans une plage de -20 et reste stable au sein. Il ya une caméra USB montésur le robot à bras en Z pour fournir une vue agrandie de l&#39;embout de distribution au cours du processus d&#39;impression (Figure 1, L). Il y a une seconde caméra montée vers le haut de l&#39;intérieur de la chambre qui fournit une représentation complète de la bioprinter pendant le processus d&#39;impression (figure 1, L). Un logiciel de dessin de conception assistée par ordinateur détermine le motif de dépôt et permet à l&#39;utilisateur de générer des gouttelettes espacées de façon incrémentielle et des structures complexes (figure 3). Voies en trois dimensions peuvent être codées manuellement dans le logiciel de conception imprimante compatible ou importées à partir d&#39;un logiciel séparé assistée par ordinateur dessin de conception (figure 4, tableau 1). Le logiciel d&#39;impression compatible permet variations des paramètres d&#39;impression tels que le procédé de dépôt (dépôt de gouttelettes unique ou dépôt en continu de la voie), de la géométrie en trois dimensions des voies, la vitesse de dépôt, la distance entre l&#39;extrémité d&#39;embout de seringue et substTaux surface d&#39;impression, la quantité de temps pour déposer une goutte individuelle, et la hauteur et la vitesse de la seringue est levée entre le dépôt des gouttes. Chaque programme contient XYZ lieux de distribution, les routines de calibrage de pointe, et des protocoles de distribution changeante de fournir un environnement stérile, sans intervention de l&#39;opérateur, lors de l&#39;impression. Le contrôleur logique programmable (PLC) du robot reçoit des instructions de l&#39;ordinateur exécutant le logiciel de conception et de contrôle le calendrier des événements à partir des contrôleurs externes (par exemple, les distributeurs). Pour ce faire, l&#39;automate utilise un mécanisme de bouclage pour contrôler les distributeurs , dispositif de positionnement robotique, et les facteurs environnementaux. Trois dimensions bioprinting écriture directe utilisant un système de distribution de liquide rotatif-vis permet le processus de dépôt de cellules pour être plus efficace, plus précis et plus facile que les méthodes précédentes. Cette étude montre l&#39;bioprinter construit sur mesure est capable de générer des CEhydrogel constructions de LL-chargé avec la viabilité cellulaire élevée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Positioning Robot (JR2000 XYZ)</td>
			<td>Janome&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensers: SDAV Linear Drive SmartDispensers</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Light Sensors:&#160;</td>
			<td>Keyensce</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Displacement Laser: OD Mini</td>
			<td>SICK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recirculating Water Bath: Polystat</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-12122-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB Cameras: Dino-Lite Premier 5MP</td>
			<td>AnMo Electrionics/YSC Technologies</td>
			<td>AD7013MT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer-Compatible Computer Design Software: JR-C Points</td>
			<td>Janome</td>
			<td></td>
			<td>Comes with purchase of Janome Robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer-Aided Design Drawing Software: Visual PathBuilder</td>
			<td>RatioServ</td>
			<td></td>
			<td>Can be downloaded at: www.ratioserv.com/index.php/downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printer 3 cc Syringes:&#160;</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>122051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 G Dispenser Tips</td>
			<td>Fishman Corporation</td>
			<td>Z520122&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10035-04-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9000-70-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium Dioxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13462-67-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protanal LF 20/40 Alginate (Sodium Alginate)</td>
			<td>FMC BioPolymer</td>
			<td>9005-38-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647-01-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Mallinckrodt Baker, Inc</td>
			<td>9300-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Periodate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7790-28-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hADSC</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-5006</td>
			<td>Store in vials in liquid nitrogen until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5012</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Mammalian Viability Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td>Store in the dark at -80&#176;C until use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>130672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-ethyl-(dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1769&#160;</td>
			<td>10 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, +Calcium, +Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14040133</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, -Calcium, -Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190144</td>
			<td>Warm in 37&#176;C water before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RGD Peptides</td>
			<td>International Peptides</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Phalloidin Stain</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>A22283</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(4&#8217;, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) (DAPI) Stain</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R37606</td>
			<td>Store at -20&#176;C until use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

viability of bioprinted cellular constructs using a three dispenser cartesian printer

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of three-dimensional bioprinting in tissue engineering has generated new methods for the printing of cells and matrix to fabricate biomimetic tissue constructs. The solid freeform fabrication (SFF) method developed for three-dimensional bioprinting uses an additive manufacturing approach by depositing droplets of cells and hydrogels in a layer-by-layer fashion. Bioprinting fabrication is dependent on the specific placement of biological materials into three-dimensional architectures, and the printed constructs should closely mimic the complex organization of cells and extracellular matrices in native tissue. This paper highlights the use of the Palmetto Printer, a Cartesian bioprinter, as well as the process of producing spatially organized, viable constructs while simultaneously allowing control of environmental factors. This methodology utilizes computer-aided design and computer-aided manufacturing to produce these specific and complex geometries. Finally, this approach allows for the reproducible production of fabricated constructs optimized by controllable printing parameters.

Les résultats démontrent la bioprinter est capable de déposer des cellules hydrogels chargés dans des emplacements spécifiques en trois dimensions précise et cohérente en utilisant le logiciel assisté par ordinateur. Ces logiciels de déterminer l&#39;emplacement de chaque gouttelette et le contrôle de nombreux paramètres de distribution (figure 3,4). La répétabilité de la bioprinter à déposer de manière appropriée biomatériaux est essentielle à sa réussite dans les applications d&#3...

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Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Viabilité de Bioprinted cellulaires constructions Utilisation d&#39;une imprimante cartésienne Distributeur Trois

Tissue engineering has centralized its focus on the construction of replacements for non-functional or damaged tissue. The utilization of ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.9K vues.  Medical University of South Carolina. A Cartesian bioprinter was designed and fabricated to allow multi-material deposition in precise, reproducible geometries, while also allowing control of environmental factors. Utilizing the three-dimensional bioprinter, complex and viable constructs may be printed and easily reproduced.

Vidéo: Viability of Bioprinted Cellular Constructs Using a Three Dispenser Cartesian Printer

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

La peau Three-Dimensional Human Reconstruire Modèle: un outil pour étudier la peau normale et la progression du mélanome

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Recherche

Bio-ingénierie

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor microfabrication.1-10 Recently, thermal inkjet printing has also been used for gene transfection.8,9 The thermal inkjet printing process was shown to temporarily disrupt the cell membranes without affecting cell viability. The transient pores in the membrane can be used to introduce molecules, which would otherwise be too large to pass through the membrane, into the cell cytoplasm.8,9,11
The application being demonstrated here is the use of thermal inkjet printing for the incorporation of fluorescently labeled g-actin monomers into cells. The advantage of using thermal ink-jet printing to inject molecules into cells is that the technique is relatively benign to cells.8, 12 Cell viability after printing has been shown to be similar to standard cell plating methods1,8. In addition, inkjet printing can process thousands of cells in minutes, which is much faster than manual microinjection. The pores created by printing have been shown to close within about two hours. However, there is a limit to the size of the pore created (~10 nm) with this printing technique, which limits the technique to injecting cells with small proteins and/or particles. 8,9,11
A standard HP DeskJet 500 printer was modified to allow for cell printing.3, 5, 8 The cover of the printer was removed and the paper feed mechanism was bypassed using a mechanical lever. A stage was created to allow for placement of microscope slides and coverslips directly under the print head. Ink cartridges were opened, the ink was removed and they were cleaned prior to use with cells. The printing pattern was created using standard drawing software, which then controlled the printer through a simple print command. 3T3 fibroblasts were grown to confluence, trypsinized, and then resuspended into phosphate buffered saline with soluble fluorescently labeled g-actin monomers. The cell suspension was pipetted into the ink cartridge and lines of cells were printed onto glass microscope cover slips. The live cells were imaged using fluorescence microscopy and actin was found throughout the cytoplasm. Incorporation of fluorescent actin into the cell allows for imaging of short-time cytoskeletal dynamics and is useful for a wide range of applications.13-15

A description of the methods used to convert an HP DeskJet 500 printer into a bioprinter. The printer is capable of processing living cells, which causes transient pores in the membrane. These pores can be utilized to incorporate small molecules, including fluorescent G-actin, into the printed cells.

Création transitoires pores de la membrane cellulaire à l&#39;aide d&#39;une imprimante jet d&#39;encre standard

Bioprinting has a wide range of applications and significance, including tissue engineering, direct cell application therapies, and biosensor ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo évaluation quantitative de la structure du myocarde, Fonction, perfusion et la viabilité utilisant la tomographie cardiaque Micro-calculées

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting cellularisées Constructs Utilisation d&#39;un spécifique de tissu Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Layered alginate Constructs: Une plate-forme pour la coopération en culture des populations de cellules hétérogènes

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in nucleus pulposus (NP) extrusion leads to intervertebral disc destruction. Currently available surgical treatments reduce the pain but do not restore the mechanical functionality of the spine. In order to preserve mechanical features of the spine, total disc or nucleus replacement thus became a wide interest. However, this arthroplasty era is still in an immature state, since none of the existing products have been clinically evaluated.
This study intends to test the biocompatibility of a novel nucleus implant made of knitted titanium wires. Despite all mechanical advantages, the material has its limits for conventional optical analysis as the resulting implant is non-transparent. Here we present a strategy that describes in vitro visualization, tracking and viability testing of osteochondro-progenitor cells on the scaffold. This protocol can be used to visualize the efficiency of the cleaning protocol as well as to investigate the biocompatibility of these and other non-transparent scaffolds. Furthermore, this protocol can be used to show adherence pattern of cells as well as cell viability and proliferation rates on/in the scaffold. This in vitro biocompatibility testing assay provides a propitious tool to analyze cell-material interaction in non-transparent and opaque scaffolds.

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &amp;#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Here we present a fluorophore based imaging technique to detect cell viability on a non-transparent titanium scaffold as well as to detect glimpses of the scaffold impurities. This protocol troubleshoots the drawback of imaging cell-cell or cell-metal interactions on non-transparent scaffolds.

Imagerie cellulaire Viabilité sur Echafaudages non transparents - Utilisation de l&#39;exemple d&#39;un roman en maille de titane Implant

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

Traitement des constructions de ligament avec un sérum conditionné par l&#39;exercice: un modèle d&#39;ingénierie des tissus de traduction

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabrication d’un réseau multiplexé microenvironnement cellulaire artificiel

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry : Une approche puissante et non invasive pour étudier le métabolisme énergétique cellulaire

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Conception d’une imprimante 3D Open-Source, Low-Cost Bioink et Food Melt Extrusion

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...