La bioimpression 3D avec des bactéries est une technique nouvellement développée. Ce protocole offre un moyen facile de construire des biofilms conçus 3D imprimés avec des bactéries. Le principal avantage de cette technique est la capacité de produire des biofilms imprimés en 3D à l’aide d’une imprimante 3D maison peu coûteuse.
Une application possible de notre imprimante 3D est de créer des biofilms modèles reproductibles qui peuvent être utilisés pour développer de nouvelles thérapies antibactériennes. Notre approche d’impression 3D peut être appliquée à tout type de bactéries compatible avec notre bioink à base d’alginate. La préparation du bioink et des substrats d’impression sont des procédures assez standard, tandis que le processus d’impression 3D, en particulier l’étalonnage de l’axe Z est une étape cruciale qui nécessite une certaine pratique.
L’étalonnage de la hauteur d’accès définie influencera la résolution de notre imprimante 3D et dépend fortement de l’expérience personnelle. Cette procédure nécessite des ajustements manuels, et il est difficile d’être décrit dans un format écrit. Connectez une pointe de pipette de 200 microlitres à une longueur de tube en silicone, et montez la pointe pipette sur la tête d’extrème de l’imprimante 3D en remplacement de l’extrème d’origine.
Ensuite, ajoutez quatre millilitres d’une solution de chlorure de calcium cinq molaires à 400 millilitres d’agar de 1% dissous dans le bouillon Luria-Bertani, et complétons-le avec les antibiotiques et les inducteurs appropriés. Ensuite, distribuez 20 millilitres de la solution d’agar LB dans chaque boîte de Pétri de 150 millimètres par 15 millimètres. Sécher le plat pendant 30 minutes à température ambiante, le couvercle à moitié ouvert.
Préparer une solution d’alginate de sodium à 3 %, et la chauffer au point d’ébullition trois fois pour stériliser la solution. Ensuite, conservez la solution stérile à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée. Pour préparer la composante bactérienne du bioink, cultivez des bactéries E.coli transportant des plasmides pour l’expression constitutive du GFP dans 50 millilitres de milieu LB contenant des antibiotiques.
Secouez la culture à 250 rPM et 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après la croissance nocturne de la culture, pelleter les bactéries pendant cinq minutes à 3220 fois la gravité, puis enlever le surnatant. Resuspendez la pastille bactérienne dans 10 millilitres de LB moyen, et ajouter 10 millilitres d’alginate de sodium 3%.
Connectez l’imprimante 3D à un ordinateur et ouvrez le logiciel d’impression 3D. Cliquez sur le bouton Accueil pour les axes X, Y et Z, pour déplacer la tête d’impression vers sa position d’origine. Pour chaque impression, placez un substrat d’impression préparé sur un emplacement particulier sur le lit d’impression.
Soulevez la tête d’impression à une hauteur de plus de 22 millimètres sous contrôle manuel, de sorte qu’elle ne heurte pas le bord de la boîte de Pétri pendant le mouvement. Placez la tête d’impression sur le dessus de la plaque et déplacez-la vers le bas jusqu’à ce que la pointe pipette entre en contact avec la surface d’impression. Assignez cette position z-axe comme Z1, la hauteur de la surface d’impression.
Ensuite, levez la tête d’impression et déplacez-la manuellement à l’extérieur de la zone de la plaque. Si la distance de travail entre la tête d’impression et la surface de la plaque est définie comme Z2, entrez la hauteur de la surface d’impression ainsi que la distance de travail dans le programme d’impression comme valeur Z pendant l’impression. Chargez un fichier de code G préprogrammé contenant des commandes pour l’impression de la forme désirée.
À chaque ligne de commande, la position de la tête d’impression peut être modifiée dans les axes X, Y ou Z. Assurez-vous d’entrer la valeur Z pendant toutes les étapes d’impression comme la hauteur de la surface d’impression ainsi que la distance de travail. Chargez le bioink liquide dans des seringues et montez-les dans la pompe à seringues du bioimprimeur 3D.
Ensuite, réglez la vitesse d’extrusion à 0,3 millilitres par heure. Imprimez le bioink sur le substrat d’impression en cliquant sur le bouton Imprimer. Attendez de démarrer la pompe à seringues jusqu’à ce que l’impression ait commencé, et avant que la tête d’impression entre en contact avec la surface d’impression.
Lors de l’impression, contrôlez le mouvement de la tête d’impression entièrement par le logiciel. Arrêtez la pompe à seringues dès que la tête d’impression arrive au dernier point d’impression, sinon l’excès de bioink tombera sur le substrat d’impression et réduira la résolution d’impression. Pour la construction de structures 3D, tous les mouvements de la tête d’impression sont contrôlés dans l’éditeur de code G.
Pour augmenter la hauteur d’impression de la deuxième couche, tapez la hauteur d’impression de la première couche et augmentez la valeur Z du code de 0,2 millimètre. Par la suite, augmentez la valeur Z de 0,1 millimètre, lorsque vous vous déplacez vers une couche supérieure. Incuber les échantillons imprimés à température ambiante pendant trois à six jours pour permettre la production des composants du biofilm tels que les fibres de Curli.
Ensuite, placez la plaque sur un scanner fluorescent et imagez les plaques. Pour dissoudre la matrice d’alginate, ajouter 20 millilitres d’une solution de citrate de sodium molaire de 0,5 molaire au pH 7, au substrat imprimé. Incuber la plaque à température ambiante pendant deux heures tout en secouant à 30 rpm.
Ensuite, jetez à nouveau le liquide et l’image des plaques, pour les comparer avec les images des plaques avant et après le traitement au citrate. Le bioimprimeur 3D peut créer des bactéries encapsulant les hydrogels dans une variété de formes bidimensionnelles et tridimensionnelles. Ces formes imprimées peuvent ensuite être utilisées pour évaluer si la formation du biofilm a été un succès ou si la matrice d’alginate est complètement dissoute à l’aide d’une solution de citrate de sodium.
Dans le cas du bioink sans le plasmide inductible de production de Curli, le modèle imprimé a été complètement dissous après le traitement de citrate de sodium, signifiant qu’aucun réseau de Curli de biofilm ne s’était formé. Les bactéries contenant le plasmide inductible de production de Curli n’ont pas été dissoutes après traitement au citrate de sodium, ce qui indique que les bactéries imprimées ont été en mesure de former un réseau Curli suffisamment étendu pour stabiliser le modèle imprimé des bactéries. Pour construire des structures multicouques, des couches supplémentaires peuvent être imprimées en contrôlant l’éditeur de code G.
L’augmentation du nombre de couches imprimées dans un échantillon a fait augmenter progressivement la largeur et la hauteur des structures imprimées. Lorsque E.coli a conçu pour produire de façon inductible des protéines Curli ont été imprimées dans des structures à plusieurs niveaux, le traitement du citrate de sodium n’a pas dissous les échantillons, tandis que les structures multicoucouches contenant des E.coli non productrices de Curli ont été dissoutes. Les parties les plus critiques de la procédure d’impression 3D sont l’étalonnage de l’axe Z, et la coordination du démarrage de l’impression et du démarrage de la pompe à seringues.
Le bioink développé pour ce processus est assez doux, avec une faible dureté. D’autres modifications pourraient être apportées au bioink, afin de fournir et d’améliorer la stabilité mécanique. Cette technique d’impression 3D permet la production de biofilms aux excellentes propriétés mécaniques, ce qui peut permettre la fabrication de matériaux biomimétiques.
Lorsque vous manipulez ces bactéries, portez une protection adéquate, comme des gants.
