The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.

1. Amplification VDJ 1.1) Extraction d&#39;ADN des échantillons de tumeurs <ol><li> Extraire l&#39;ADN des sections minces (10-20 um) de PTOM tissus normaux ou malignes embarqués gelés. <ol><li> Digest 10-30 coupes minces de tissu enrobé par une coupe au microtome de cryostat dans 4 ml de tampon de lyse nucléique (Tris-HCl 0,0075 M, pH 8,2; 0,3 M de NaCl; 0,002 M Na 2 EDTA) avec de la proteinase K (0,5 mg / ml, concentration finale ) et 0,625% de SDS dans un tube de centrifugation de 15 ml dans un bain d&#39;eau à 37 ° pendant une nuit. </li><li> Ajouter 1 ml de NaCl saturé (5 M) au mélange de digestion et agiter vigoureusement pendant 15 sec. </li><li> Centrifuger à 1100 g pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation de 15 ml et ajouter deux volumes d&#39;éthanol à 100%. </li><li> Mélanger en retournant le tube 6-8 fois. Centrifuger à 5000 xg pendant 60 min à 4 ° C pour recueillir le précipité d&#39;ADN. </li><li> Laver le culot d&#39;ADN à deux reprises avec 70% d&#39;éthanol. Centrifuge à 5000 g pendant 15 min à chaque fois pour recueillir le culot. </li><li> Dissoudre l&#39;ADN dans un tampon TE 100-400 pi à la température ambiante sur une nuit d&#39;agitation. Le rendement en ADN est de 5 à 200 ug (de concentration finale comprise entre 50 à 500 ng / ul) en fonction de la taille du tissu </li></ol></li><li> Extraire l&#39;ADN à partir de sections minces (10 à 20 um) d&#39;fixés à la formaline, noyés (FFPE) un tissu normal ou maligne paraffin-. <ol><li> Incuber les coupes de paraffine dans 1 ml de xylène deux fois à la température ambiante pendant 10 min à chaque fois dans un tube de 1,5 ml à De-paraffinize. Recueillir les coupes de tissu par centrifugation à 13 000 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Incuber les coupes dans 1 ml d&#39;éthanol à 100% deux fois à la température ambiante, 10 min à chaque fois pour éliminer les xylènes de résidus. Recueillir les coupes de tissu par centrifugation à 13 000 xg pendant 5 min à température ambiante. La paraffine est complètement dissous à ce point et que la section de tissu est restants. </li><li> Air-sécher les sections de chambre température pendant 10-15 min. </li><li> Faire une solution à 0,5 mg / ml protéinase K avec un tampon 1x PCR (dilué à partir du tampon 10x PCR avec de l&#39;eau sans nucléase). Ajouter la solution de Proteinase K échantillons dans un volume final de 50 à 100 ul et incuber une nuit à 37 ° C. </li><li> Chauffer les échantillons à 95 ° C pendant 10 minutes pour inactiver la proteinase K. Remarque: Lors de cette étape, l&#39;ADN de l&#39;échantillon est dissous dans le tampon de PCR et peut être utilisé dans les étapes 1.2 et 1.3 directement. Le rendement en ADN est de 0,5 à 20 ug (de concentration finale comprise entre 10 à 200 ng / ul) en fonction de la taille du tissu. </li></ol></li></ol> 1.2) d&#39;évaluation de la qualité de l&#39;ADN <ol><li> Mélanger 0,25 ul ADN polymérase Taq avec 45 pi de mélange maître de la trousse de l&#39;échelle commerciale dans un tube PCR. </li><li> Ajouter 5 ul ADN préparé à partir de 1.1.1.7 ou 1.1.2.5 dans le tube PCR et bien mélanger par pipetage de haut en bas pendant au moins 5 fois. </li><li> Utiliser les conditions suivantes pour amplifier l&#39;ADN: 95 ° C pendant7 min; suivie par 35 cycles de 45 s à 95 ° C, 45 s à 60 ° C et 90 sec à 72 ° C; puis 72 ° C pendant 10 min et maintenez à 15 ° C. </li><li> Préparation d&#39;un gel d&#39;agarose à 2% dans du TBE (Tris / Borate / EDTA). </li><li> Mélanger réaction de PCR de 20 pi avec 4 ul de colorant de charge 6x, et charger sur un gel d&#39;agarose à 2%. </li><li> Colorer le gel d&#39;agarose avec 0,5 pg / ml de bromure d&#39;éthidium solution et détecter les produits de PCR avec un système de gel de l&#39;imagination. Remarque: les échantillons qui donnent des 5 produits de PCR à des tailles de 100, 200, 300, 400 et 600 pb sera continué à générer des amplicons VDJ. ATTENTION: Le bromure d&#39;éthidium est un mutagène puissant. S&#39;il vous plaît manipuler avec une extrême prudence en portant des équipements de protection, gants à savoir, et d&#39;en disposer dans des conteneurs spécifiques par les directives de l&#39;institution. </li></ol> 1.3) VDJ PCR 1.3.1) Amplify recombiné IgH VDJ segment de la Région cadre 1 (IgVHFR1) <ol><li> Mélanger 45 ul mélange maître de l&#39;étiquette du tubeed comme &quot;Mix 2&quot; d&#39;une hypermutation somatique IGH dosage pour la détection Gel kit commercial, 0,25 ul de l&#39;ADN polymerase Taq, l&#39;ADN de l&#39;échantillon et 5 ul préparé à partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou dans un tube PCR. </li><li> Utiliser les conditions suivantes pour amplifier l&#39;ADN: 95 ° C pendant 7 min; suivie par 35 cycles de 45 s à 95 ° C, 45 s à 60 ° C et 90 sec à 72 ° C; puis 72 ° C pendant 10 min et maintenez à 15 ° C. </li><li> Résoudre le produit de PCR dans un ensemble de gel agarose à 2% par électrophorèse. </li><li> Colorer le gel d&#39;agarose avec 0,5 pg / ml de bromure d&#39;éthidium solution et détecter les produits de PCR avec un système d&#39;imagerie de gel. Un amplicon monoclonal est prévu avec la gamme de taille de 310 à 380 pb. </li><li> Exciser la partie de gel contenant l&#39;amplicon monoclonal entre 310-380 pb. </li><li> Purifier l&#39;ADN excisé à partir du gel en utilisant un kit d&#39;extraction de gel norme selon le protocole du fabricant. Remarque: pour les échantillons qui FR1 fragments ont pu être obtenus, il n&#39;y a pas besoin de amplement IgVHFR2 et IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Amplify recombiné IgH VDJ segment de cadre Région 2 (IgVHFR2) <ol><li> Mélanger 45 ul de mélange-maître à partir du tube appelée &quot;Tube B&quot; d&#39;un commercial IGH Gene Clonality Assay kit de détection de gel, 0,25 ul de l&#39;ADN polymerase Taq, l&#39;ADN de l&#39;échantillon et 5 ul préparé à partir 1.1.1.7 1.1.2.5 ou dans un tube PCR . </li><li> Utiliser les conditions suivantes pour amplifier l&#39;ADN: 95 ° C pendant 7 min; suivie par 35 cycles de 45 s à 95 ° C, 45 s à 60 ° C et 90 sec à 72 ° C; puis 72 ° C pendant 10 min et laisser à 15 ° C. </li><li> Résoudre le produit de PCR dans un ensemble de gel agarose à 2% par électrophorèse. </li><li> Visualiser le produit (s) PCR de 0,5 pg / ml de bromure d&#39;éthidium coloration. Un amplicon monoclonal peut être observé dans la plage de taille de 250 à 295 pb. </li><li> Exciser la partie de gel contenant l&#39;amplicon monoclonal entre 250 à 295 pb. </li><li> Purifier l&#39;ADN à partir de gel excisée en utilisant un extrait de normale GelKit ion selon le protocole du fabricant. </li></ol> 1.4) Optimiser VDJ PCR <ol><li> Les conditions de PCR modifiés suivants pour amplifier IgVHFR1 et IgVHFR2 utilisant de l&#39;ADN sous-optimale: 95 ° C pendant 7 min, 40 cycles de 95 ° C pendant 60 sec, 60 ° C pendant 60 sec, et 72 ° C pendant 90 sec, extension finale à 72 ° C pendant 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Bibliothèque Préparation et séquençage 2.1) Préparation Bibliothèque 2.1.1) Fin de réparation <ol><li> Transférer le produit PCR VDJ de 1,3 dans un tube PCR et ajouter Resuspension tampon de l&#39;ADN échantillon trousse de préparation pour élever le volume à 60 pi. </li><li> Ajouter 40 pi de réparation de Fin Mix de Kit de préparation de l&#39;ADN de l&#39;échantillon et bien mélanger. </li><li> Incuber la réaction à 30 ° C pendant 30 minutes dans un thermocycleur préchauffé (30 ° C) avec un couvercle préchauffé à 100 ° C. </li><li> Mélanger 136 pi billes magnétiques et 24 ul g PCRl&#39;eau rade d&#39;abord dans un tube de 1,5 ml, puis transférer la totalité de la réaction en fin de réparation à 2.1.1.3 dans le tube de 1,5 ml et bien mélanger avec la solution de perles. </li><li> Placer les tubes sur un support magnétique pendant 2 min pour permettre la séparation des billes de la solution. Aspirer le surnageant et laver les perles avec 80% EtOH frais préparé deux fois tandis que le tube est sur le support magnétique. </li><li> Aspirer la solution d&#39;éthanol complètement et permettre aux billes sécher à l&#39;air pendant 15 min à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Prenez le tube de la béquille et remettre les billes magnétiques dans 17,5 ul Resuspension tampon. </li><li> Placer les tubes de retour sur le support magnétique pendant 2 min à des billes distinctes de la mémoire tampon de remise en suspension. Retirer le tampon de remise en suspension (produit Fin de réparation est remis en suspension dans le tampon Resuspension maintenant) dans un tube de PCR clean. </li></ol> 2.1.2) A-tailing <ol><li> Ajouter 12,5 pi A-tailing mélange dans le tube PCR contenant le produit Fin de réparation et mélanger soigneusement. </li&gt; <li> Incuber le tube PCR à 37 ° C pendant 30 minutes dans un thermocycleur préchauffé (37 ° C) avec un couvercle pré-chauffé à 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adaptateur ligature <ol><li> Ajouter 2,5 pi de tampon de remise en suspension, 2,5 pi de mélange de ligature, et 2,5 pi Index adaptateur ADN dans la réaction de A-tailing. </li><li> Incuber la réaction à 30 ° C pendant 30 minG dans un thermocycleur préchauffé (30 ° C) avec un couvercle préchauffé à 100 ° C. </li><li> Ajouter 5 ul arrêt Tampon ligature dans chaque réaction et mélanger soigneusement. </li><li> Mélanger 42,5 billes magnétiques ul bien mélangés pour nettoyer la réaction suivante étapes 2.1.1.5 à 2.1.1.8. Ajouter 50 ul Resuspension tampon pour éluer le produit de l&#39;adaptateur ligaturé. </li><li> Nettoyez le produit de l&#39;adaptateur ligaturé pour une deuxième fois en utilisant 50 ul bien mélangés perles AMPure XP, et on élue le produit en 25 tampon Resuspension ul dans un tube propre PCR. </li></ol> 2.1.4) Fragments amplifier l&#39;ADN <ol><li> Ajouter 5 ul PCR Primer Cocktail et 25 pi PCR Master Mix au tube PCR contenant le produit de l&#39;adaptateur ligaturé et bien mélanger. </li><li> Effectuer une amplification dans un thermocycleur préprogrammée avec les conditions suivantes: 98 ° C pendant 30 s; 10 cycles de 98 ° C pendant 10 sec, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s; puis 72 ° C pendant 5 min et maintenez à 10 ° C. </li><li> Nettoyer la réaction en utilisant 50 pi de billes magnétiques bien mélangés, et éluer le produit final dans 30 ul de tampon de remise en suspension. </li></ol> 2.1.5) Bibliothèque de validation <ol><li> Quantifier le produit final avec un fluoromètre en utilisant le protocole du fabricant. Concentration finale de bibliothèque est comprise entre 2,5 à 20 ng / ul. </li><li> Évaluer la qualité du produit final en utilisant un instrument d&#39;analyse de l&#39;ADN avec puce haute sensibilité selon le protocole du fabricant. Attendez-vous à une seule bande avec la taille attendue pour soit IGVHFR1, IGVHFR2 ou IGVHFR3. Texpected taille de la bibliothèque produit correspond à la taille de l&#39;amplicon de VDJ original et de la taille des adaptateurs (~ 125 pb). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR et séquençage Bibliothèque Pooling <ol><li> Calculer la molarité de chaque fraction bibliothèque en utilisant la formule suivante: nM = [(ng / 1,000) / 660 pb *] x 10 9 où ng est la concentration de la bibliothèque VDJ-PCR mesurée à l&#39;étape 2.1.5.1 pb et est le pic taille de la bibliothèque VDJ-PCR mesurée à l&#39;étape 2.1.5.2. </li><li> Diluer la bibliothèque à 2 nM (10 pi au total) avec de l&#39;eau exempte de DNase. </li><li> On combine les 10 ul de 2 nM de bibliothèques dilué ensemble dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter un volume égal de contrôle de pointe dans PhiX dans le tube de 1,5 ml. </li><li> Chargez la piscine à une concentration de 7 pM sur une cuve à circulation. </li><li> Séquencer les bibliothèques en utilisant un séquenceur couplé à cycle de gamme 150 selon le protocole du fabricant. </li></ol> Analyse des données 3. Remarque: Un summAry des scripts de bioinformatique utilisés dans cette section peut être trouvé comme un fichier de code supplémentaire. 3.1) Alignement et QC <ol><li> Carte jumelé fin séquençage lit contre un IGH V humaine, D et base de données de région J téléchargé à partir du site web de IMGT 11 en utilisant un algorithme BLAST nucléotidique adaptée basée sur &#39;blastn&#39; disponibles à partir de NCBI avec écart pénalité d&#39;ouverture de 2, l&#39;écart pénalité d&#39;extension de 1, longueur de mot de 7, et le seuil de 10 -4 e-valeur. Jeter la paire lu ne correspond pas à la fois un IGH V et une région J. </li><li> Comptez le nombre de paires de lire restants qui ont IGH V et J correspondances pour obtenir les fréquences de correspondant combinaisons de VJ travers tous lu paires obtenues à partir de la course de séquençage sur l&#39;échantillon. Comptez une lecture paire si elle est mappée à la fois un IGH V et J gène, puis ajouter son allèle le compte correspondant pour la combinaison de VJ particulier. </li><li> Classez les chiffres pour chaque région VDJ recombiné obtenu à partir de 3.1.2 de la hauteEst au plus bas. La région VDJ a le plus haut lectures comptage est définie comme la combinaison majeure de réarrangement. </li><li> Jeter séquences alignées qui couvrent moins de 35% du domaine réarrangement majeur identifié dans 3.1.3. </li></ol> 3.2) Profil SHM identification <ol><li> Comptez tous les modèles SHM à travers le lit de l&#39;étape 3.1.3. Définissez chaque modèle SHM comme un sous-clone. </li><li> Comptez le nombre de sous-clones qui sont correspondant à différents modèles uniques SHM, et le nombre de lectures qui sont mis en correspondance avec des sous-clones individuels. </li></ol> 3.3) représentation graphique des résultats <ol><li> Effectuer l&#39;analyse phylogénétique sur les sous-clones en utilisant leurs modèles SHM correspondants en utilisant un quartier méthode de package R &quot;singe&quot; d&#39;assemblage selon le protocole du fabricant. Calculer une matrice de distances à partir des alignements distincts individuels pour recréer la phylogénie de sous-clone ancrée à la séquence de la lignée germinale du VJ combinaison en question pour chaque ensemble de l&#39;échantillon apparié. </li><li> Utilisation de la séquence nucléotidique de chaque sous-clone en tant que vecteur de caractères et de calculer la distance de chaîne approximative entre tous les sous-clones dans la majeure réarrangement VJ à la fois pour le diagnostic et des échantillons de rechute correspondants en utilisant une mesure de distance de Levenshtein où mathématiquement la distance entre deux alignements est donné par d x, y (i, j) où d x, y (i, j) = 1 si i ≠ j et 0 sinon, puis additionner cette fonction sur la longueur de la chaîne correspondant à des séquences nucléotidiques I et J. </li><li> Afficher graphiquement la matrice résultant des distances de sous-clone et le nombre de leurs sous-clone correspondantes dans les deux façons suivantes: <ol><li> Utilisez le paquet R &quot;masse&quot;, selon le protocole du fabricant d&#39;appliquer analyse multidimensionnelle à la matrice de distance de sous-clone et de générer un principe à deux dimensions coordonnées de carte, qui est ensuite tracée avec le logarithmesubclonal de chiffres que le rayon du cercle. </li><li> Construire un graphe non orienté sur la base de la distance de Levenshtein, où les sommets correspondent à chaque sous-clone distinct provenant de la majeure réarrangement VJ. Remarque: Si la distance entre deux clones distincts est égal à un, alors il existe une arête entre ces deux sommets. Si la distance est supérieure à un, alors il n&#39;y a pas de bord en les reliant. </li><li> Le graphique du 3.3.3.2 en utilisant la fonction de tkplot dans le package de R &quot;IGRAPH&quot; avec la mise en page Kamada Kawai selon le protocole du fabricant. Le rayon des sommets est proportionnelle à la racine cubique du nombre total de clones mis en correspondance avec elle et l&#39;ombrage utilise une gamme rouge et bleu pour indiquer que la proportion de clones qui soit font partie du diagnostic (bleu) ou de rechute (rouge) échantillons . </li></ol></li></ol> 3.4) Hétérogénéité (entropie) Mesure <ol><li> Examiner les numéros et les chiffres de sous-clone de lamotifs individuels de mutations somatiques se produisent dans la majeure réarrangement VJ pour chaque ensemble d&#39;échantillons appariés. </li><li> Calculer l&#39;entropie empirique et entropie empirique résiduelle ajusté pour le nombre de clones distincts dans chaque échantillon en utilisant l&#39;estimation de l&#39;entropie en fonction histogramme standard. </li></ol>

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The authors have no conflicts of interest to disclose.

En raison du nombre pratiquement illimité d&#39;itérations de l&#39;information de séquence codée par réarrangement VDJ et SHM au locus IGH des cellules B humaines, l&#39;examen de l&#39;ensemble IGH répertoire en haut débit profond séquençage avéré être un moyen efficace et complet pour délimiter clonale et les populations de cellules B sous-clones. De plus, cette stratégie peut être utilisée pour étudier la trajectoire de l&#39;évolution clonale de développement des cellules B de la tumeur, la rémi...

Le cancer est une maladie clonale. Depuis, il ya trente ans, lorsque Peter C. Nowell a proposé le cancer clonale modèle d&#39;évolution 1, de nombreuses études ont tenté de disséquer populations clonales dans les échantillons de tumeurs et de reconstruire les modèles d&#39;expansion et l&#39;évolution clonale qui sous-tendent le processus de tumorigenèse 2. Récemment, le séquençage du génome entier a permis aux enquêteurs de prendre un regard profond sur l&#39;hétérogénéité et l&#39;évolution clonale 3,4. Toutefois, en raison de l&#39;absence de marqueurs traitables dans de nombreux types de cellules, il est difficile d&#39;en déduire l&#39;architecture clonale chemin précis et évolutif. Heureusement, il est un marqueur de clonalité naturelle dans les cellules B matures à partir de laquelle de nombreuses tumeurs malignes lymphoïdes, y compris DLBCL, sont originaires. En réponse à la stimulation antigénique, chaque cellule B peut former une séquence productive seule IgH VDJ en rejoignant un V H (variable), un D (diversité), et un J H (rejoindre) le segment ensemble à partir d&#39;une grande piscine de ces segments. Au cours de cette prPROCESSUS, de petites portions de la séquence d&#39;origine peuvent être supprimés et les nucleotides non basés sur des modèles supplémentaires peuvent être ajoutées pour créer un réarrangement VDJ unique. Ce réarrangement VDJ spécifique peut être hérité dans toute la descendance de cette cellule B, marquage donc lymphocytes B matures individuelle et sa progéniture 5. En outre, SHM se produit sur ​​les séquences VDJ recombinés dans le centre germinatif (GC) réaction ultérieure pour introduire des mutations supplémentaires pour l&#39;expansion de la piscine de l&#39;anticorps et la mise en valeur des anticorps d&#39;affinité 6. Par conséquent, en comparant et contrastant VDJ SHM et des motifs d&#39;échantillons de lymphome qui ont subi ces procédés, l&#39;hétérogénéité intra-tumorale pourrait être délimitée et voie d&#39;évolution clonale de la maladie peut être déduite. Auparavant, le réarrangement VDJ et SHM pourraient être identifiés par amplification par PCR les régions recombinés, le clonage des produits de PCR, puis séquençage de Sanger pour obtenir des informations de séquence. Cette approche is à faible débit et faible rendement, récupérer seulement une très petite partie de l&#39;ensemble du répertoire de VDJ recombiné, et d&#39;entraver la caractérisation de la représentation globale de la population clonale dans un échantillon donné. Une approche modifiée a été créée en générant END indexés bibliothèques de séquençage de produits PCR et VDJ effectuer PE séquençage 2x150 pb pour obtenir plus d&#39;un demi-million de séquences VDJ recombinées par échantillon. En outre, un pipeline personnalisé a été développé pour effectuer un contrôle de qualité (QC), aligner, séquençage filtre VDJ lit d&#39;identifier réarrangements et SHM de chaque lecture, et effectuer une analyse phylogénétique sur l&#39;architecture clonale de chaque échantillon. En outre, une nouvelle approche a été établi afin de mieux caractériser les modèles de l&#39;évolution clonale pour les échantillons prélevés à divers stades de la maladie. Nous avons appliqué cette technique à des échantillons de patients DLBCL. LMNH-B est une forme agressive de lymphome non hodgkinien à la rechute fréquente dans près d&#39;un eIRD des patients 7. Rechutes surviennent normalement DLBCL début, dans les 2 à 3 ans suivant le diagnostic initial, bien que certains ne se produisent après 5 ans 8. Pronostic pour les patients en rechute est faible, avec seulement 10% la réalisation de trois années de survie sans progression due à des options de traitement limitées. Ceci est la base de la nécessité urgente de nouvelles approches pour traiter DLBCL rechute 9,10. Cependant, les mécanismes moléculaires associés à la rechute LMNH-B sont encore largement inconnu. En particulier, le rôle de l&#39;hétérogénéité clonale au moment du diagnostic et l&#39;évolution clonale au cours du développement de rechute LMNH-B sont actuellement non caractérisé, ce qui rend difficile de définir un biomarqueur précis et plus utile pour prédire une rechute. Pour répondre à ces questions, nous avons appliqué notre approche VDJ-séquençage sur plusieurs paires de paires d&#39;échantillons de diagnostic LMNH-rechute primaire appariés. Deux scénarios évolutifs clonales distinctes de rechute ont émergé de la comparaison des architectures clonales entre le diagnostic et le samp rechuteles mécanismes moléculaires qui suggère multiples peut être impliqué dans DLBCL rechute.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ethanol</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89125-170</td>
			<td style="width:197px;">200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">TE buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12090-015</td>
			<td style="width:197px;">10 mM Tris&#183;Cl, pH 8.0; 10mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>EM-XX0055-6</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td>25530-015</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">U1515</td>
			<td style="width:197px;">10 mM each nucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10x PCR Buffer&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11699105001</td>
			<td>Without MgCl2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:359px;">AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2</td>
			<td style="width:163px;">Life Technonogies</td>
			<td style="width:123px;">4311806</td>
			<td>50 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Specimen Control Size Ladder</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>2-096-0020</td>
			<td>33 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:359px;">IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td style="width:123px;">5-101-0030</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">IGH Gene Clonality Assay - Gel Detection</td>
			<td style="width:163px;">Invivoscribe Technologies&#160;</td>
			<td>1-101-0020</td>
			<td style="width:197px;">33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:123px;">M8291</td>
			<td>20 &#181;l at 5 U/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Corning (cellgro)</td>
			<td style="width:123px;">46-011-CM</td>
			<td style="width:197px;">6x1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50X TAE BUFFER&#160;&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101414-298</td>
			<td style="width:197px;">1 L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:197px;">10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">25 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10597011</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15628-019</td>
			<td style="width:197px;">1 &#181;g/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16500-500</td>
			<td style="width:197px;">500 g</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40% Acrylamide/Bis Solution</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1610144</td>
			<td style="width:197px;">500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:197px;">50 columns</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:163px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:123px;">A63881</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">Q32854</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:123px;">5067-4626</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:163px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">MiSeq</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:359px;">PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td>
			<td style="width:163px;">Illumina</td>
			<td>FC-121-2001</td>
			<td style="width:197px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:359px;">Magnetic stand</td>
			<td style="width:163px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4457858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:359px;">Gel imaging system</td>
			<td style="width:163px;">Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>170-8370</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vdj-seq: deep sequencing analysis of rearranged immunoglobulin heavy chain gene to reveal clonal evolution patterns of b cell lymphoma

Clonalité tumeur compréhension est essentielle pour comprendre les mécanismes impliqués dans la tumorigenèse et progression de la maladie. En outre, la compréhension des changements de composition de clones qui se produisent dans une tumeur en réponse à certains micro-environnement ou traitements peut conduire à la conception d&#39;approches plus sophistiquées et efficaces pour éradiquer les cellules tumorales. Cependant, le suivi des tumeurs sous-populations clonales a été difficile en raison du manque de marqueurs distinguables. Pour résoudre ce problème, un protocole VDJ-seq a été créé pour suivre les tendances de l&#39;évolution clonale de lymphome à grandes cellules B (LMNH-B) rechute diffuse en exploitant recombinaison VDJ et hypermutation somatique (SHM), deux caractéristiques uniques de lymphomes à cellules B. Dans ce protocole, le séquençage de prochaine génération (NGS) bibliothèques ayant un potentiel d&#39;indexation ont été construits à partir amplifié immunoglobuline réarrangé chaîne lourde (IgH) région VDJ de paires de diagnostic primaire et de rechute samp DLBCLles. En moyenne, plus de la moitié millions séquences VDJ par échantillon ont été obtenus après le séquençage, qui contiennent à la fois réarrangement VDJ et informations SHM. En outre, les pipelines bioinformatiques personnalisés ont été développés pour utiliser pleinement l&#39;information de séquence pour la caractérisation des IgH-VDJ répertoire au sein de ces échantillons. En outre, le pipeline permet la reconstruction et la comparaison de l&#39;architecture clonale de tumeurs individuelles, ce qui permet l&#39;examen de l&#39;hétérogénéité clonale dans les tumeurs de diagnostic et de déduction de motifs de l&#39;évolution clonale entre le diagnostic de tumeurs et des paires de rechute. Lors de l&#39;application de cette analyse à plusieurs paires diagnostic-rechute, nous avons découvert des preuves essentielles que de multiples tumeurs distinctif des modèles évolutifs pourraient conduire à DLBCL rechute. En outre, cette approche peut être étendu à d&#39;autres aspects cliniques, tels que l&#39;identification de la maladie résiduelle minimale, le suivi des progrès de la rechute et la réponse au traitement, et l&#39;enquête de repertoire immunitairees dans des contextes non-lymphome.

La procédure globale de séquençage VDJ (VDJ-seq), y compris l&#39;extraction d&#39;ADN, recombiné VDJ région d&#39;amplification et de purification, la construction de la bibliothèque de séquençage, lit le traitement et l&#39;analyse phylogénétique, est représenté sur la figure 1. Régulièrement 5-200 pg d&#39;ADN peut être extrait à partir de coupes de tissus congelés ou solide 0,5-20 ug d&#39;ADN à partir de coupes de tissus inclus en paraffine fixés au formol. En fo...

Watch this Scientific Journal Video about VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma at JoVE.com

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

VDJ-Seq: Analyse en profondeur de séquençage de Rearranged immunoglobuline chaîne lourde Gene à révéler des modèles clonale évolution de B Lymphome

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

JoVE Journal

Medicine

26.5K vues.  Weill Cornell Medical College. This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes. 

Vidéo: VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions between vitreous substructures and the retina underlie several vitreoretinal diseases, including retinal tear and detachment, macular pucker, macular hole, age-related macular degeneration, vitreomacular traction, proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy, and inherited vitreoretinopathies. 1,2 The molecular composition of the vitreous substructures is not known. Since the vitreous body is transparent with limited surgical access, it has been difficult to study its substructures at the molecular level. We developed a method to separate and preserve these tissues for proteomic and biochemical analysis. The dissection technique in this experimental video shows how to isolate vitreous base, anterior hyaloid, vitreous core, and vitreous cortex from postmortem human eyes. One-dimensional SDS-PAGE analyses of each vitreous component showed that our dissection technique resulted in four unique protein profiles corresponding to each substructure of the human vitreous body. Identification of differentially compartmentalized proteins will reveal candidate molecules underlying various vitreoretinal diseases.

This video shows an effective technique for differentiating and dissecting the various semi-transparent structures of the human vitreous body in post mortem eyes.

Dissection de l&#39;homme des éléments du corps vitré de l&#39;analyse protéomique

The vitreous is an optically clear, collagenous extracellular matrix that fills the inside of the eye and overlies the retina. 1,2 Abnormal interactions ...

Recherche

Médecine

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Création et propagation des tumeurs de l&#39;homme en rétinoblastome immunitaire chez les souris déficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Production et détection d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) dans les cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

ADN vecteur basé sur l&#39;interférence ARN pour étudier la fonction des gènes dans le cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

Deep Neuromuscular Blockade Leads to a Larger Intraabdominal Volume During Laparoscopy

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that lowering the insufflation pressure during surgery may reduce the risk of post-operative pain. In this pilot study, a method is presented for measuring the intra-abdominal space available to the surgeon during laproscopy, in order to examine whether the relaxation produced by deep neuromuscular blockade can increase the working surgical space sufficiently to permit a reduction in the CO2 insufflation pressure. Using the laproscopic grasper, the distance from the promontory to the skin is measured at two different insufflation pressures: 8 mm Hg and 12 mm Hg. After the initial measurements, a neuromuscular blocking agent (rocuronium) is administered to the patient and the intra-abdominal volume is measured again. Pilot data collected from 15 patients shows that the intra-abdominal space at 8 mm Hg with blockade is comparable to the intra-abdominal space measured at 12 mm Hg without blockade. The impact of neuromuscular blockade was not correlated with patient height, weight, BMI, and age. Thus, using neuromuscular blockade to maintain a steady volume while reducing insufflation pressure may produce improved patient outcomes.

This article presents a method for measuring the working abdominal volume during laproscopic myomectomy using the surgical grasper, and applies this technique to obtain pilot data on whether deep neuromuscular blockade (NMB) can enable the use of lower insufflation pressure. Reduced insufflation pressure during laproscopic surgery has been shown to reduce post-operative pain, and thus the use of NMB during surgery may enable improved patient outcomes.

Le blocage neuromusculaire profonde mène à un volume intra-abdominale Agrandir pendant la laparoscopie

Shoulder pain is a commonly reported symptom following laparoscopic procedures such as myomectomy or hysterectomy, and recent studies have shown that ...

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of breast tissue patterns in mammograms. We hypothesize that architectural distortion modifies the normal orientation of breast tissue patterns in mammographic images before the formation of masses or tumors. In the initial steps of our methods, the oriented structures in a given mammogram are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect node-like sites of radiating or intersecting tissue patterns. Each detected site is then characterized using the node value, fractal dimension, and a measure of angular dispersion specifically designed to represent spiculating patterns associated with architectural distortion.
Our methods were tested with a database of 106 prior mammograms of 56 interval-cancer cases and 52 mammograms of 13 normal cases using the features developed for the characterization of architectural distortion, pattern classification via quadratic discriminant analysis, and validation with the leave-one-patient out procedure. According to the results of free-response receiver operating characteristic analysis, our methods have demonstrated the capability to detect architectural distortion in prior mammograms, taken 15 months (on the average) before clinical diagnosis of breast cancer, with a sensitivity of 80% at about five false positives per patient.

Detection of Architectural Distortion in Prior Mammograms via Analysis of Oriented Patterns

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms. Oriented structures are analyzed using Gabor filters and phase portraits to detect sites of radiating tissue patterns. Each site is characterized and classified using measures to represent spiculating patterns. The methods should assist in the detection of breast cancer.

Détection de distorsion architecturale dans mammographies antérieures<em&gt; Par</em&gt; Analyse des modèles orientés

We demonstrate methods for the detection of architectural distortion in prior mammograms of interval-cancer cases based on analysis of the orientation of ...

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease (PD) pathogenesis are less understood. Gene-environment interaction models have utility in unmasking the impact of specific cellular pathways in toxicity that may not be observed using a solely genetic or toxicant disease model alone.&#160;To evaluate if distinct LOX isozymes selectively contribute to PD-related neurodegeneration, transgenic (i.e. 5-LOX and 12/15-LOX deficient) mice can be challenged with a toxin that mimics cell injury and death in the disorder.&#160;Here we describe the use of a neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), which produces a nigrostriatal lesion to elucidate the distinct contributions of LOX isozymes to neurodegeneration related to PD. The use of MPTP in mouse, and nonhuman primate, is well-established to recapitulate the nigrostriatal damage in PD.&#160;The extent of MPTP-induced lesioning is measured by HPLC analysis of dopamine and its metabolites and semi-quantitative Western blot analysis of striatum for tyrosine hydroxylase (TH), the rate-limiting enzyme for the synthesis of dopamine. To assess inflammatory markers, which may demonstrate LOX isozyme-selective sensitivity, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Iba-1 immunohistochemistry are performed on brain sections containing substantia nigra, and GFAP Western blot analysis is performed on striatal homogenates.&#160;This experimental approach can provide novel insights into gene-environment interactions underlying nigrostriatal degeneration and PD.

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson&#039;s Disease

Lipoxygenase (LOX) isozymes can generate products that may increase or decrease neuroinflammation and neurodegeneration.&#160;A gene-environment interaction study could identify LOX isozyme-specific effects. Using the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) model of nigrostriatal damage in two LOX isozyme-deficient transgenic lines allows for comparison of the contribution of LOX isozymes on dopaminergic integrity and inflammation.

Modèles d’interaction gène-environnement pour démasquer les mécanismes de susceptibilité dans la maladie de Parkinson

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Concentrez Formation: Un test cellulaire pour déterminer le potentiel oncogène d&#39;un gène

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from clinical and biological sources. The method is unbiased and universal; it uses random primers for cDNA synthesis and requires no prior knowledge of the viral sequence content. Before library construction, selective RNase H-based digestion is used to deplete unwanted RNA &#8212; including poly(rA) carrier and ribosomal RNA &#8212; from the viral RNA sample. Selective depletion improves both the data quality and the number of unique reads in viral RNA sequencing libraries. Moreover, a transposase-based &#39;tagmentation&#39; step is used in the protocol as it reduces overall library construction time. The protocol has enabled rapid deep sequencing of over 600 Lassa and Ebola virus samples-including collections from both blood and tissue isolates-and is broadly applicable to other microbial genomics studies.

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

Le séquençage profond impartiale de l&#39;ARN virus à partir d&#39;échantillons cliniques

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. However, a specific immunoglobulin E (IgE) measurement system with a high price-performance ratio is lacking in mainland China, especially in the primary care hospitals. This paper describes the principle and operation procedures of using a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system to detect allergen-specific IgE in serum. The results were compared with those from ImmunoCAP (System 1), the industrial standard, and the reproducibility of the system to detect patients sensitized to common allergens is evaluated. The results showed that in comparison with ImmunoCAP (System 1), the BioIC System (System 2) has good precision and sensitivity in detecting serum-specific IgE against various inhalant and food allergens but with a significantly lower cost. It can serve as a good alternative to System 1 in primary care hospitals in mainland China who have lower financial affordability.

Application of Biochip Microfluidic Technology to Detect Serum Allergen-specific Immunoglobulin E sIgE

This paper presents a protocol for detecting serum-specific immunoglobulin E with a microfluidic cartridge-based chemiluminescence system and the evaluation of its usefulness in allergy diagnoses.

Application des biopuces microfluidiques technologie pour détecter sérum allergène spécifique immunoglobuline E (sIgE)

Allergic disease is common in both adults and children. Identification of the causative allergens is significant in disease management and prevention. ...