Ce protocole est significatif parce qu’il peut être utilisé pour interroger les répertoires immunitaires des donneurs humains afin d’identifier des cellules B rares et spécifiques aux antigènes. Cette technique nous permet d’obtenir des chaînes lourdes et légères nativement appariées, qui peuvent être rapidement clonées, puis directement testées contre l’antigène ou les antigènes d’intérêt. Mike Morton, technicien de notre laboratoire, démontrera la procédure.
Au moins une heure après le dégel et le rétablissement, recueillir le donneur PBMC par centrifugation. Et re-suspendre les cellules en 50 millilitres de glace froide MES Buffer pour le comptage. Pelleter les cellules par une autre centrifugation, et isoler les cellules B CD22-positives par sélection positive avec des microbilles CD22 selon les protocoles standard.
Recueillir la perle isolée cellules CD22-positives par centrifugation et resuspendre les cellules à quatre fois 10 à la septième cellule par millilitre de concentration tampon Vax. Ajoutez un cocktail d’anticorps IgG CD19 CD27 aux cellules selon les recommandations de dilution du fabricant avec mélange doux, et aliquot 10 aux septièmes cellules dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour le contrôle négatif. Ajouter un tétramers de steptavidine de biotine doublement étiqueté au tube de commande négatif à une concentration finale de 36 nanomolaires chacun avec un PE et un APC, multiplié par le nombre de peptides dans le tube de tri.
Apportez le volume final dans chaque tube de 2,5 millilitres avec tampon Vax frais et ajoutez les tétramers peptidiques au tri du tube à 36 nanomolaires chaque PE et APC. Après centrifugage, amener les cellules à deux fois 10 à la 6e pour 100 microlitres de concentration du SCT pour une incubation de 30 à 60 minutes, dans l’obscurité, à quatre degrés Celsius, avec rotation. À la fin de l’incubation, lavez les cellules deux fois dans un tampon tbs frais par lavage avant de filtrer les échantillons dans des tubes individuels à bouchon de filtre de cinq millilitres.
Tacher les échantillons avec une concentration finale de 0,3 micromolaire de DAPI comme marqueur de l’intégrité de la membrane cellulaire. Et exécutez le contrôle négatif entier sur le trieur de cellules pour régler les barrières de cytométrie d’écoulement pour isoler les populations cellulaires appropriées pour le tri de cellule simple. Tracez l’antigène PE contre l’antigène APC et réglez la porte R8 comme un antigène PE-positif, et quadrant APC-positif avec un faible nombre d’événements dans la double porte positive.
Ensuite, trier le CD19-positif unique CD27-positif antigène PE-positif, antigène APC-positifs cellules dans les puits individuels d’un Master Mix préparé 96 plaque bien. À la fin du tri, couvrir la plaque avec des tampons de ruban d’aluminium, et centrifuger les cellules pendant une minute à 400 fois g avant moins 80 degrés de stockage. Pour effectuer une réaction de transcriptase inverse, décongeler les cellules B triées sur la glace pendant deux minutes avant de faire tourner la plaque pendant deux minutes à 3300 fois g pour tirer le contenu du puits au fond de la plaque avant l’ouverture.
Après avoir traité les cellules avec une enzyme appropriée Master Mix, ajouter 2,5 microlitres d’ADN gratuit comme un modèle pour chaque réaction PCR, et ajouter des amorces à une concentration finale de 1 micromolaire à chaque réaction. Ensuite, ajoutez une concentration de 2 X de tampon de polymésase de 10 X à chaque puits pour porter le volume final à 25 microlitres par réaction. Et exécutez les réactions PCR à chaîne lourde et légère pendant 50 cycles chacun.
À la fin des réactions, exécutez les échantillons sur le gel d’agarose de 1% pour visualiser les coups positifs d’amplification. Isoler les réactions en chaîne lourde et légère jumelées de la même cellule par extraction de gel. Déterminer la concentration de fragments d’ADN par la densité optique à 60 pour des calculs précis de mélange de ligature.
Combinez les fragments de chaîne lourds et légers récupérés avec un fragment de maillon et l’épine dorsale vectorielle d’expression à l’aide d’une réaction de ligature de quatre fragments selon les instructions du fabricant. Et transformer les réactions de ligature en bactéries chimiquement compétentes selon les instructions du fabricant. Une fois plaqué sur des plaques antibiotiques, ajouter quatre millilitres de milieu de croissance avec des antibiotiques à la culture de transformation restante pour l’incubation pendant la nuit à 37 degrés Celsius à 250 rotations par minute.
Le lendemain matin, préparez une mini-préparation d’ADN à partir des cultures de mélange de ligature du jour au lendemain selon les instructions du fabricant et déterminez la concentration d’ADN plasmide qui en résulte. Pour confirmer la spécificité d’antigène des anticorps isolés, transfect 10 microgrammes de l’ADN de miniprep avec le réagent cationic de base de lipide dans une suspension de 10 millilitres de 293 cellules. Incuber la culture cellulaire trois à quatre jours à 37 degrés Celsius et 8% de dioxyde de carbone et 125 rotations par minute.
À la fin de l’incubation, centrifuger la culture pendant 10 minutes à 1000 fois g, et récupérer le milieu clarifié. Mesurer la concentration d’IgG dans le supernatant par affinité avec la protéine A et tester chaque anticorps dans le supernatant à une concentration de 25 microgrammes par millilitre par ELISA par rapport aux peptides individuels utilisés pour le type selon les protocoles ELISA standard. Ensuite, confirmez les coups positifs de l’écran avec un ELISA supplémentaire en utilisant des dilutions de supernatant IgG pour générer une courbe de concentration à partir de 20 microlitres par millilitre et en traçant contre la densité optique pour chaque antigène montrant la réactivité à l’écran initial ELISA.
Pour isoler les anticorps spécifiques aux antigènes des donneurs humains, une série de portes de cytométrie peuvent être conçues pour isoler les cellules B de la mémoire cible. Les lymphocytes sont isolés en fonction de leur taille cellulaire et de leur granularité, à l’aide de la dispersion vers l’avant et le côté. Après l’exclusion des doublets et des cellules mortes, les marqueurs phénotypiques permettent la ségrégation des cellules B CD19 positives d’IgG et des cellules B de mémoire CD27-positives.
La première lecture du clonage à cellule unique est une confirmation de l’amplification des chaînes variables lourdes et légères respectives. Ici, un exemple d’amplification très efficace de 24 cellules simples avec une récupération 42% jumelée après PCR est montré. Après le clonage d’IgG, le vecteur d’expression IgG est transpécifique dans le rein embryonnaire humain 293 cellules.
Les anticorps récupérés sont examinés contre le panneau original des peptides de Tau marqués pour la réactivité par ELISA. Une confirmation supplémentaire est ensuite effectuée à l’aide d’une courbe de concentration des mêmes échantillons d’anticorps recombinants par rapport aux peptides identifiés dans l’écran initial. Pour chaque coup positif, un clone plasmide individuel peut être isolé de la piscine transformée et reconfirmé par la même méthode ELISA.
L’objectif est d’amplifier les séquences à partir de cellules individuelles, donc la chose la plus importante à retenir est que toute contamination sera amplifiée au cours de la partie PCR de cette procédure. Cette procédure donne des anticorps recombinants humains intacts, ce qui permet la purification et la caractérisation fonctionnelle d’autant d’anticorps que vous souhaitez générer.
