Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la leucémie lymphoïde chronique, comme le pronostic précis des patients. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, rapide et très précise. Les implications de cette technique s’étendent vers le pronostic robuste, plus particulièrement les certifications de risque avec des patients présentant la leucémie lymphocytique chronique parce que le pronostic précis peut plus tard définir la gestion thérapeutique de la maladie.
La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, comme la sélection des produits PCR et les types d’analyse des séquences de digestion sont difficiles à apprendre parce qu’ils nécessitent à la fois de la précision et de l’expérience. Pour commencer cette procédure, ajouter 200 microlitres d’EDTA à un tube de collecte stérile de 50 millilitres. Ajouter 20 millilitres de sang périphérique et 15 millilitres de rpmi moyen au tube et pipette de haut en bas deux à trois fois pour mélanger.
Ensuite, ajoutez 15 millilitres de gradient de densité moyen à un nouveau tube de collecte de 50 millilitres. Superposez lentement la solution sanguine périphérique sur le milieu de gradient de densité, en s’assurant qu’elle ne perturbe pas le gradient. Centrifugeuse à 800 fois G pendant 20 minutes avec le frein centrifugeuse éteint.
Ensuite, utilisez une pipette Pasteur stérile pour recueillir l’anneau cellulaire mononucléaire qui s’est formé entre la couche supérieure plaquette plasmatique et la couche moyenne de gradient de densité et le transférer dans un nouveau tube stérile de collecte de 15 millilitres. Ajoutez le support RPMI de telle sorte que le volume final est de 12 millilitres et pipette la solution de haut en bas pour mélanger. Centrifugeuse à 800 fois G pendant huit minutes.
Jeter le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire avec 10 millilitres de milieu RPMI. Centrifugeuse à nouveau à 750 fois G pendant huit minutes. Après cela, jeter le supernatant et dissoudre la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS.
À l’aide d’une nouvelle plaque Bauer, former un nombre de cellules en mélangeant 20 microlitres d’échantillon et 80 microlitres d’une à 10 solution turque. Si le traitement en aval de l’échantillon n’est pas prévu pour le même jour, centrifugez l’échantillon à 750 fois G pendant huit minutes. Jetez le supernatant et rangez la pastille cellulaire à moins 80 degrés Celsius.
Tout d’abord, préparer le mélange d’amorce à l’aide de quantités équimolaires de chaque amorce de sous-groupe pour assurer une amplification impartiale. Mélangez les reagents PCR comme indiqué dans le tableau deux du protocole texte. Ajouter 0,5 microlitres de polymésase TAP au tube PCR contenant les reagents PCR mélangés.
Ajoutez ensuite 100 nanogrammes de gDNA ou deux microlitres d’ADNC. Exécutez le protocole PCR thermique tel que détaillé dans le tableau trois du protocole de texte. Après cela, vérifiez si les produits PCR d’environ 500 paires de base lors de l’utilisation d’amorces de litre IGHV ou 350 paires de base lors de l’utilisation des mélanges d’amorce IGHPFR1.
Pour commencer la purification du produit PCR, chargez le volume total du produit PCR sur un gel d’agarose à faible fondant de trois pour cent. Laissez les produits PCR fonctionner sur le gel jusqu’à ce qu’ils se séparent de l’arrière-plan. Exciser les bandes PCR pointues, puis les purifier et les élitiser.
Si deux réarrangements sont détectés, les deux bandes doivent être excisées et séquencées séparément. Pour effectuer le nettoyage exo-sève, suivez les instructions du fabricant concernant les volumes spécifiques à utiliser. Vortex doucement chaque échantillon pour les mélanger et les incuber sur un bloc PCR à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Inactivez les enzymes en les chauffant à 85 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cela, chargez une petite quantité des produits PCR sur un gel d’agarose de trois pour cent pour évaluer la pureté du produit. Le dernier point de contrôle avant le séquençage est la détermination de la clonalité de l’échantillon à l’aide de l’analyse des fragments.
Pour commencer à analyser la séquence, démarrez le logiciel approprié. Spécifiez l’espèce, comme l’homo sapiens, et le type de récepteur ou le locus. Rythmez les séquences à analyser en format fasta et y compris les identificateurs dans la zone de texte en lots de jusqu’à 50 séquences par course.
Ensuite, choisissez l’une des trois options d’affichage suivantes pour les résultats. Vue détaillée: choisissez cette option afin d’obtenir les résultats pour chaque séquence individuellement. Vue de synthèse : choisissez cette option pour compiler un tableau récapitulatif commandé par le gène IGHV et le nom de l’allèle ou par ordre d’entrée de séquence.
Cette option fournit également un alignement des séquences qui, dans n’importe quel lot soumis, sont attribuées au même gène et allèle IGHV, et enfin au fichier Excel. Choisissez cette option pour fournir tous les fichiers de sortie sous forme de feuilles de calcul intégrées dans un seul fichier. Seule l’utilisation d’amorces de litre IGHV permet d’amplifier toute la longueur de l’IGHV réarrangé, permettant ainsi de déterminer la vraie charge HSM.
Le produit PCR attendu est d’environ 500 paires de base. Dans de rares cas où les amorces de litre d’IGHV ne peuvent pas amplifier le réarrangement clonotypic d’IG, des amorces d’IGHBFR1 peuvent être employées. Le produit PCR attendu est d’environ 350 paires de base.
Les séquences obtenues sont ensuite analysées à l’aide de l’outil IMG TV Quest. La première ligne du tableau des résultats indique la fonctionnalité de la séquence, car une séquence réarrangée par IG peut être productive ou improductive. Un réarrangement du gène IGH est improductif est stop codons sont présents dans la région VDJ et / ou si le réarrangement est hors cadre en raison d’insertions / suppressions.
Il est important de noter que seuls les réarrangements productifs et donc fonctionnels doivent être analysés plus avant. Lors de l’utilisation des paramètres IMG TV Quest par défaut, les insertions et les suppressions ne sont pas automatiquement détectées, mais des indications fortes qu’une séquence peut effectuer de telles modifications sont fournies par l’outil et une alerte d’avertissement apparaît en dessous du tableau de résumé des résultats. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler d’atterrir les produits PCR sur le gel assez longtemps afin que le lien clonal peut être discriminé à partir du fond polyclonal.
Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’immunogénétique chronique de leucémie lymphocytique pour explorer l’impact pronostique du statut somatique d’épimutation dans les patients. N’oubliez pas que travailler avec du bromure d’éthylium peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que travailler sous le capot en tout temps doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
