The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.

NOTE: Ce protocole commence après on a isolé les mitochondries du muscle squelettique rouge. Les mitochondries ont été isolées comme décrit précédemment à partir de ~ 75 - 100 mg de muscle squelettique rouge 13. Entre 5-10 pg / pl de protéine mitochondriale sera atteint de cette quantité de tissu en remettant en suspension le culot final dans mitochondriale ≤ 50 pl de tampon d&#39;isolement pour les mitochondries (IBM) 2 (Voir Frisard et al 13). 1. Configuration <ol><li> Préparation des solutions mères de travail (tableau 1) et une solution de dosage mitochondrial (MAS) les mélanges (tableau 2) pour des analyses subséquentes. Note: La plupart de la préparation pour les essais peut être fait à l&#39;avance que la plupart des stocks des solutions et MAS peuvent être stockés. </li><li> Hydratez une cartouche de dosage respirométrique dans 1 ml de solution d&#39;étalonnage la nuit avant l&#39;expérience dans un incubateur non-CO 2 à 37 ° C. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, take hors stocks congelés (substrats et de modulateurs mitochondriales, MAS mix, MAS w / o BSA, tableau 1) et dégel dans les 37 ° C bain ou incubateur. </li><li> Préparer les solutions de substrat (Tableau 3) et les injections (tableau 5.4) et ajuster le pH si besoin (pH 7,4). Après le pH est ajusté, stocker sur de la glace. </li><li> Programme de la multi-puits machine de mesure de la consommation d&#39;oxygène au mélange approprié, attendre, et les paramètres de mesure (voir tableau 6) et fond de l&#39;étiquette et le groupe / état ​​puits en entrant d&#39;abord le logiciel d&#39;analyse, suivi par le mode &quot;Standard&quot;. <ol><li> Entrez dans le forum &quot;Invité&quot; et cliquer sur &quot;Test Wizard&quot;. Une fois dans le &quot;dosage Wizard&quot;, cliquez sur &quot;Protocole&quot; pour changer mélange, attendre, et mesurer les paramètres. Identifier les puits de fond dans le cadre du &quot;Retour. Correction &quot;onglet et assurez-vous de mettre en évidence&quot; Avez correction de fond &quot;. </li><li> Étiquette conditions en cliquant d&#39;abord sur l&#39;onglet &quot;Groupes &amp; étiquettes&quot;, puis l&#39;onglet &quot;Info Groupe&quot;. Après ces paramètres sont entrés, cliquez sur &quot;Terminer&quot;, suivie par &quot;Enregistrer le modèle&quot;. </li></ol></li></ol> 2. La série de test <ol><li> Chargez les solutions d&#39;injection dans une cartouche de série de tests et de démarrer l&#39;étalonnage en entrant d&#39;abord le logiciel d&#39;analyse, puis en entrant le mode &quot;Standard&quot;. Entrez dans le forum &quot;clients&quot;. Ouvrez le modèle enregistré dans l&#39;étape 1.5 dans le lecteur &quot;XF&quot;, sous l&#39;onglet &quot;Modèles&quot;. Une fois ouvert, cliquez sur &quot;Démarrer&quot; pour commencer l&#39;étalonnage. Remarque: La cartouche de série de tests doit être entré dans la machine avec le coin entaillé en bas à gauche. Cela prend environ 30 min. Prenez soin d&#39;injecter des solutions dans les ports appropriés. Injections dans le tableau 4-5 sont énumérés dans l&#39;ordre de chargement. </li><li> Doucement, mais bien mélanger l&#39;mitochondria de stock en agitant la solution avec une pipette de 200 pi, suivie par trituration doucement le bouillon avec une pointe de pipette 200 pi qui a eu son orifice creusé en coupant ~ 3 mm à l&#39;extrémité de la pointe avec des ciseaux. </li><li> Effectuer un dosage de l&#39;acide bicinchoninique (BCA) pour déterminer la concentration en protéine du stock mitochondrial. </li><li> En utilisant la concentration de titres acquis à partir de l&#39;étape 2.3, remettre en suspension 10 ug de protéine mitochondriale / 200 pi du mélange de substrat succinate / de la roténone (tableau 3). Remettre en suspension 14 ug de protéine mitochondriale / 200 pi des mélanges de substrat restant (Cela doit être fait pour chaque mélange de substrat) (tableau 3). Placez tous mitochondrial protéines / substrat mélange sur de la glace. Remarque: La quantité optimale de protéines mitochondriales par puits pour chaque essai a été déterminée comme décrit précédemment neuf. Il a été déterminé que le pyruvate / malate, palmitoyl carnitine / malate, glutamate / malate und flux d&#39;électrons dosages utilise 3,5 pg de protéine mitochondriale, tandis que le dosage succinate / roténone utilise 2,5 pg de protéine mitochondriale par puits. Par conséquent, le chercheur doit remettre en suspension assez protéine mitochondriale pour 4 répétitions dans cette étape car soit 2,5 pg ou 3,5 pg par 50 pi est chargé par puits (voir l&#39;étape 2.6). </li><li> Mélanger les solutions mitochondries / substrat doucement, mais à fond en agitant la solution avec une pipette de 200 pi, suivie par trituration doucement le bouillon avec une pointe de pipette 200 pi qui a eu ~ 3 mm de son extrémité coupée. </li><li> Placer une plaque de culture de cellules sur de la glace et en triple exemplaire, la charge 50 ul / puits de chacun des mélanges mitochondries / substrat. Les développeurs de l&#39;essai respirométrique de microplaques basé recommandons de laisser un minimum de deux (pas de mitochondries) puits à blanc, de préférence de chaque côté sur la plaque de culture cellulaire. </li><li> Faites tourner la plaque de culture cellulaire à 2000 g pendant 20 min à 4 ° C. Alors que la plaque est sépinglant, réchauffer les solutions de substrat dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Après l&#39;essorage est terminé, charger soigneusement 450 ul de chaque solution de substrat au-dessus de ses puits respectifs (par exemple, charger le pyruvate / malate substrat dans les puits qui ont des mitochondries initialement remis en suspension dans cette solution de substrat). Veillez à charger la plaque à température ambiante. Remarque: puits vierges ne doivent être chargés avec 500 pi de substrat. Les puits à blanc désignés pour le dosage de flux d&#39;électrons doivent être chargées avec le substrat de flux d&#39;électrons (Pyruvate / Malate + FCCP), tandis que les puits à blanc couplé dosage peuvent être chargés avec un substrat de dosage de couplage. Remarque: Si vous effectuez les analyses de flux couplée et d&#39;électrons sur la même plaque, le chercheur doit réaffecter puits de fond pour les dosages respectifs après la course de dosage est complète en utilisant la plate-forme &quot;XF Reader&quot; via l&#39;onglet &quot;Instrument&quot;. Une fois dans le paramètre &quot;Instrument&quot;, cliquez sur le &quot;Administration&quot;onglet, suivi de &quot;correction de fond&quot;. Hit &quot;End Mode Configuration de l&#39;instrument» lorsque vous avez terminé. En effet, la combinaison de l&#39;ascorbate / TMPD peut consommer O 2, donc une correction de fond séparé est nécessaire pour chaque type d&#39;essai. </li><li> Après la 450 pi de substrat sont ajoutés à chaque puits, voir la couche de mitochondries dans le puits afin d&#39;assurer les mitochondries sont dispersées uniformément dans une seule monocouche (grossissement 20X [Voir Rogers 9, Figure 4]). Wells qui ne semblent pas avoir une monocouche uniformément répartie peuvent être retirés post hoc. </li><li> Après avoir vérifié le respect mitochondrial, insérez la microplaque dans l&#39;instrument de dosage respirométrique et commencer à exécuter le test en cliquant sur &quot;OK&quot;. Remarque: Le calibrage de l&#39;étape 2.1 doit être complète avant la course commence. Une fois que le chercheur clique sur &quot;OK&quot;, la machine éjecte la plaque d&#39;utilité qui a été utilisé pour l&#39;étalonnage. <ol> &lt;li&gt; Retirer la plaque d&#39;utilité et placer la plaque de culture cellulaire qui contient les mitochondries sur le plateau. L&#39;encoche bleu sur la plaque de culture cellulaire devrait être placé dans le coin inférieur gauche du plateau. Cliquez sur &quot;continuer&quot; pour lancer le cycle de dosage. </li></ol></li><li> Après la course est terminée, éjectez la plaque de culture cellulaire et la cartouche en appuyant sur &quot;Ejecter&quot; sur l&#39;écran. <ol><li> Une fois que la plaque est éjectée, retirez et jetez la plaque de culture cellulaire et la cartouche et cliquez sur «Continuer» sur l&#39;écran. La course sera automatiquement enregistrée dans un fichier .xls dans le fichier &quot;Data&quot;. </li></ol></li><li> Ouvrez ce fichier et modifier l&#39;affichage de &quot;O2&quot; à &quot;OCR&quot; en appuyant sur la flèche vers le bas sous le &quot;Y1:« marqueur. <ol><li> Prochain changement &quot;Middle Point&quot; à &quot;Point-to-Point Tarifs&quot; dans le &quot;Data Rate affiché comme:&quot; option. Cliquez sur &quot;OK&quot; pour appliquer ces modifications. </li></ol&gt; </li><li> Cliquez sur l&#39;onglet &quot;Mode groupe bien&quot; en bas à gauche de l&#39;écran pour puits de groupe de conditions similaires. Enfin, cliquez sur l&#39;onglet &quot;moyenne de l&#39;échantillon / Standard Error&quot; vers le milieu de l&#39;écran, à gauche. Alternativement, ces commandes peuvent être configurés avant l&#39;essai commence dans le réglage «Assistant Assay&quot;. Remarque: Chaque condition d&#39;avoir une moyenne ± écart-type affiché pour chaque taux et chaque état. Il ya des mesures de débit prises par l&#39;état (Etat 2 [Coupling] / State3u [Electron Débit] respiration suivie par quatre injections). Utilisez la moyenne de l&#39;État 2 taux de la deuxième mesure, déterminer Etat 4o au point minimum après oligomycine injection, utiliser le point maximal de l&#39;Etat 3 et 3U de l&#39;Etat après l&#39;ADP et l&#39;injection FCCP, respectivement, et utiliser le point minimum pour antimycine A respiration induite pour les essais de couplage. Utilisez le point maximum pour pyruvate / malate induite État 3U respiration, utiliser le minimumpoint de départ pour la roténone induite respiration, utiliser le point maximum pour succinate induit 3U d&#39;État respiration, et d&#39;utiliser le point minimum pour antimycine Une respiration induite pour le dosage Electron Flow. Toutes les expériences ont été effectuées 3 fois et les données présentées sont les résultats d&#39;un tracé représentant. </li></ol>

<ol>
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George W. Rogers est un employé de Seahorse Bioscience qui fabrique l&#39;instrument pour lequel ces essais ont été développés.

Les méthodes présentées dans cet article fournissent des instructions étape-par-étape pour la performance d&#39;une collection de microplaques basé dosages respirométriques utilisant mitochondries isolées de 75 à 100 mg de muscle squelettique de souris. Ces analyses peuvent être effectuées avec une grande précision comme en témoigne l&#39;écart type étanche entre des puits en triple. Surtout, ces tests permettent de repérer des respirométriques où des anomalies et / ou adaptations peuvent se produire dans l&#39;ETC, cycle de Krebs, voie β-oxydation, les transporteurs de substrat, etc., dans un modèle animal couramment utilisé. Il est important de souligner la justification de l&#39;utilisation de divers carburants et les inhibiteurs utilisés dans ce protocole. Le pyruvate / malate et du glutamate / malate respirométriques dosages permettent l&#39;évaluation du complexe I respiration médiation, ainsi que l&#39;évaluation de leurs transporteurs respectifs, et dans le cas du glutamate, la désaminase 15. En variante, la combinaison desuccinate / roténone permet l&#39;évaluation des flux respiratoire mitochondriale travers Complexe II de l&#39;ETC depuis roténone inhibe complexe I et succinate fournit des électrons au complexe II via la réduction de la flavine adénine dinucléotide (FADH 2) 15. Ces essais fournissent des informations spécifiques de substrat à l&#39;efficacité de couplage et la respiration maximale. Le dosage de flux d&#39;électrons est unique en ce que la combinaison des substrats et inhibiteurs permet d&#39;évaluer de multiples complexes pendant flux respiratoire mitochondriale 9. Le mélange de substrat de départ de pyruvate / malate + FCCP permet d&#39;évaluer de respiration maximale entraîné par Complexe I, tandis que l&#39;injection de la roténone suivie par succinate permet l&#39;évaluation de respiration maximale entraîné par complexe II. L&#39;injection d&#39;antimycine A, un inhibiteur du complexe III, suivie de l&#39;injection d&#39;ascorbate / TMPD permettre à l&#39;évaluation de la respiration entraînée par Complexe IV depuis la Ascorbate / TMPD est undonneur d&#39;électrons à Cytochrome C / Complexe IV. Bien qu&#39;aucune information sur l&#39;efficacité de couplage est obtenu, la méthode est idéale pour les tailles d&#39;échantillons très petits qui empêchent l&#39;exécution de plusieurs substrats indépendamment. Enfin, l&#39;utilisation de palmitoyl carnitine / malate permet l&#39;évaluation de la coordination entre les β-oxydation et l&#39;ETC depuis l&#39;équivalent réduire produite à partir de l&#39;oxydation de l&#39;acide palmitique (β-oxydation) alimentation dans l&#39;ETC par l&#39;électron transfert flavoprotéine 15. Il est à noter que les analyses de flux de couplage et d&#39;électrons peuvent également être utilisés en tandem pour identifier des changements dans la fonction mitochondriale en raison d&#39;une intervention (traitement de la toxicomanie, de la manipulation génétique). La grande précision atteinte pour ces dosages est principalement due à un mélange intime de la mitochondrie, que ce soit avant la détermination des protéines, ou des solutions de substrat. Dans cette optique, une fois que les mitochondries est resuspendend dans le substrat de solutions, il est essentiel de mélanger cette solution soigneusement avant de charger la plaque de culture cellulaire comme décrit dans l&#39;étape 2.2 avec un orifice de l&#39;embout de pipette élargie. Le défaut de mélanger les mitochondries soigneusement mènera à une grande variation dans le dosage. En outre, à l&#39;aide d&#39;une pipette de orifice étroit permettra de créer des forces de cisaillement tout en mélangeant les mitochondries et augmente le potentiel d&#39;endommager les membranes mitochondriales et la libération de cytochrome C. L&#39;étape de l&#39;adhésion (2.7) est également une étape critique dans ce protocole. Échec pour faire tourner la plaque de culture cellulaire chargée long / assez vite se traduira par l&#39;adhésion incomplète de la mitochondrie au bien, entraînant ainsi une plus grande variabilité entre les puits et les mesures. Le protocole décrit a été optimisé pour inclure: le chargement d&#39;une quantité optimale de protéine mitochondriale par puits, en utilisant les concentrations / méthodes de préparation correcte de faire des actions et des solutions substrat, la modification de la série de tests pour assurer mitochondrial pla de l&#39;Etatteaux, et le mélange approprié de les mitochondriales actions et mitochondrial / substrat mélanges. Avant ces efforts d&#39;optimisation, les auteurs ont rencontré des pièges dans la série de tests. Ce qui suit décrit les méthodes / des modifications qui ont été utiles dans l&#39;optimisation de ce protocole dépannage. En ce qui concerne le chargement optimal, chargement trop peu de mitochondries ne seront pas provoquer une réponse robuste, tout en chargeant trop de mitochondries va épuiser l&#39;oxygène dans la microchambre et conduire à des mesures inexactes. Rogers et al 9 fournit des exemples de détermination des montants de chargement optimales de mitochondries par puits des microplaques basé dosages respirométriques. Plus souvent, trop de mitochondries est chargé par puits comme en témoignent les taux sur l&#39;état 2 100-200 pmol / min / puits et l&#39;état 3 taux&gt; 1500 pmol / min / puits. Si au cours de chargement se produit, effectuer une expérience avec des concentrations variables de la protéine mitochondriale (par exemple, entre 1 -. 10 ug) de susciter OCR dans le r dynamiqueange de la machine de mesure de la consommation d&#39;oxygène. Préparation et en utilisant les bonnes concentrations de substrats et des stocks est d&#39;une importance capitale. Toujours utiliser la forme acide de substrats / injections et ajuster le pH avec de l&#39;hydroxyde de potassium ou de HCl; tampons de sodium / solutions ne sont pas recommandés. En outre, des substrats remet en suspension / stocks dans le DMSO ou 100% d&#39;éthanol se traduira par l&#39;échec de mesure ou d&#39;erreurs. Veillez à utiliser 95% d&#39;éthanol où noté. Il est commun pour palmitoyl carnitine pour précipiter hors de l&#39;éthanol à 95% après décongélation du stock congelé, provoquant ainsi une grande variabilité. Assurez-vous de réchauffer le palmitoyl carnitine stock et vortex bien avant de l&#39;utiliser. En outre, un pyruvate / résultat d&#39;analyse malate très variable peut être dû à la pyruvate de stock être&gt; 2 semaines. Soyez sûr de refaire aliquotes congelées de pyruvate toutes les 2 semaines. La série de tests a été modifié à des mesures de 2 minutes pour assurer plateaux mitochondriales de l&#39;Etat. Si l&#39;observation de l&#39;épuisement des ADP est souhaitée, le chercheur peutprolonger la durée de la mesure dans l&#39;onglet &quot;Protocole&quot; dans le cadre du forum &quot;Assistant Assay&quot;. Enfin, une grande variabilité se produit lorsque le stock et les mitochondries mitochondrial ainsi substrat solutions ne sont pas entièrement homogénéisés avant le chargement. Si la variabilité entre les puits est élevé après la série de tests, assurez-vous de mélanger complètement la solution de substrat avant l&#39;expérience suivante. Jamais vortex les solutions mitochondries / substrat, plutôt remuer, purée, et triturer doucement avec un orifice de l&#39;embout de pipette élargie. Il ya quelques limites de cette technique qui sont à noter. Tout d&#39;abord, le nombre de puits sur la plaque de culture cellulaire utilisé pour ces essais est relativement faible (par exemple., 24 puits et au moins deux désignée pour puits à blanc). Si l&#39;on souhaite effectuer toutes 5 de ces essais sur une plaque, le chercheur est seulement capable d&#39;examiner les réponses d&#39;une souris à la fois. Toutefois, il convient de noter que 96 les instruments et sont disponibles pour higher débit. Deuxièmement, il ya des points forts et des faiblesses inhérentes à l&#39;évaluation de la dysfonction mitochondriale dans les mitochondries isolées par rapport à 1 dans des cellules intactes. Certaines faiblesses comprennent ayant moins pertinence physiologique par rapport à des cellules intactes et induisant des artefacts provenant du processus d&#39;isolement. Enfin, le succès de cette méthode est tributaire de la qualité du processus d&#39;isolement mitochondrial. Bien que certains de ces essais ont été soit développé dans les différents systèmes ou ont été validées dans d&#39;autres modèles animaux, les méthodes présentées ici sont le premier à synthétiser tous les tests mentionnés ci-dessus pour l&#39;utilisation optimale dans un environnement multi-bien la machine de mesure de la consommation d&#39;oxygène en utilisant la souris Muscle squelettique. Surtout, tous ces 5 analyses peuvent être effectuées avec la quantité de mitochondries isolées à partir de ~ 75 - 100 mg de muscle squelettique de souris, fournissant ainsi un débit élevé de matière minimale. D&#39;une grande importance, la capacité de multi-puitstechnologies de consommation d&#39;oxygène pour effectuer des essais avec des quantités minimales de mitochondries, combiné avec un procédé d&#39;isolation optimisée, permet au chercheur d&#39;effectuer une multitude d&#39;autres expériences avec le reste du tissu de muscle squelettique (par exemple., des Western blots, RT-PCR, des essais enzymatiques, etc.), ce qui est souvent une lutte avec ce modèle animal. En conclusion, les méthodes présentées ici fournissent des instructions étape-par-étape pour la performance d&#39;une collection de microplaques basé dosages respirométriques utilisant des quantités minimales de muscle squelettique de souris. Surtout, les méthodes présentées nécessitent des quantités minimes de tissus et les mitochondries. Une fois maîtrisé, les techniques décrites ici permettront aux chercheurs de déterminer un mécanisme potentiel d&#39;un produit composé ou d&#39;un gène sur la consommation mitochondriale d&#39;oxygène dans un modèle animal couramment utilisé.

Le principal rôle physiologique des mitochondries du muscle squelettique est de produire de l&#39;ATP à partir de la phosphorylation oxydative 1. Surtout, les mitochondries des muscles squelettiques jouent un rôle spécifique dans l&#39;exercice capacité de 2, 3 vieillissement diabète, maladie dégénérative 4 et 5 de type II. Comme une société vieillissante, et du diabète de type II étant la 7 ème cause de décès aux États-Unis 6, le besoin de méthodes qui permettent d&#39;évaluer la fonction mitochondriale est devenu de plus en plus répandue dans la recherche biomédicale 7,8. Plus précisément, la mesure de la consommation d&#39;oxygène a une utilité exceptionnelle pour l&#39;évaluation de la fonction mitochondriale, car elle représente la fonction coordonnée entre les génomes mitochondriaux et nucléaires pour exprimer les composants fonctionnels de la phosphorylation oxydative 9. Plusieurs technologies existent qui permettent la mesure de la consommation d&#39;oxygène dans les cellules intactes et isolentd mitochondries 7-10. En outre, des essais ont été développés pour plusieurs types de cellules et de tissus, et dans une variété d&#39;espèces qui permettent la mesure des voies respiratoires mitochondriaux et contrôle 9,11,12. Toutefois, il existe actuellement un vide dans la littérature en ce qui concerne la compilation de tous ces tests utilisant des mitochondries isolées de muscle squelettique de souris pour une utilisation dans les technologies de la consommation d&#39;oxygène de microplaques base. Surtout, l&#39;utilisation de microplaques basé dosages respirométriques se développe parmi les biologistes mitochondriales et permet des mesures à haut débit en utilisant des quantités minimales de mitochondries isolées 9. Par conséquent, une collection de microplaques basé dosages respirométriques ont été développés qui permettent de repérer où des anomalies et / ou adaptations peuvent se produire dans la chaîne de transport d&#39;électrons (ETC). En outre, deux essais respirométriques sur microplaques supplémentaires ont été élaborés afin de permettre l&#39;évaluation de la coordination between l&#39;acide (TCA) le cycle tricarboxylique et l&#39;ETC, et entre la ß-oxydation et la ETC. Surtout, les méthodes présentées fournissent une manière claire et concise pour mesurer les changements dans la fonction mitochondriale mécanistes dans un modèle animal couramment utilisé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63559</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5379</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essentially Fatty&#160;</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A6003</td>
			<td rowspan="2">Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Free- BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic Acid, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>107360</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &#8805;95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">L-Glutamic acid</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">G1251</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">T7394</td>
			<td rowspan="2">Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99%, powder [TMPD]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P1645</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin A, &#8805; 95% (HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75351</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td>
			<td rowspan="3">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="3">C2920</td>
			<td rowspan="3">Store at 2-8&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylhydrazone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8805;98% (TLC), powder [FCCP]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Adenosine 5&#8242;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td>
			<td rowspan="2">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2">A5285</td>
			<td rowspan="2">Store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

Figure 1 représente les taux de consommation d&#39;oxygène (OCR) pour la pyruvate / malate, succinate / roténone, palmitoyl carnitine / malate, et du glutamate / malate dosages (couplage dosages). Ces tracés d&#39;analyse sont affichés sous forme de consommation d&#39;oxygène Rate, ou OCR, en fonction du temps, sont correceted fond, et sont affichés sous forme de taux de point à point. Chaque panneau représente la consommation d&#39;oxygène dans les différents Etats mitochondriales telles que décrites par Chance et Williams 14. Le premier panneau représente la consommation de base d&#39;oxygène, ou de l&#39;État 2. Le deuxième panel, après l&#39;injection de l&#39;ADP, représente maximale couplée respiration, ou de l&#39;État 3. Le troisième panel, après l&#39;injection de oligomycine A (un inhibiteur du complexe V), représente la respiration due de fuite de protons, ou de l&#39;État 4o. Le quatrième panneau, après l&#39;injection de FCCP, représente maximale respiration découplé ou 3U de l&#39;Etat. Enfin, le cinquième panneau, après injection de antimycine A, représente l&#39;inhibition de la respiration oxydative. Notamment, all états mitochondriales ont écart minime. Cela est dû à un mélange complet du stock mitochondrial et les mélanges mitochondries / substrat, et la réalisation d&#39;une monocouche de mitochondries après le spin de l&#39;adhésion (étape 2.6). D&#39;autre part, le chargement mitochondries inégales dans chaque puits et ne pas atteindre une monocouche des mitochondries dans le puits de la microplaque entraîne une augmentation de l&#39;écart-type dans chaque Etat comme affiché dans la figure 2. Les tracés de la figure 1 affichage plateaux pour chaque état ​​mitochondrial et pour chaque substrat. Le plateau atteint après deux cycles de mesure indique une bonne qualité mitochondrial et que les mitochondries restent collées à la même pendant toute la durée de l&#39;essai. En outre, la réalisation des taux maximum plafonné peut être plus souhaitable car cela permet au chercheur de prendre l&#39;OCR moyenne à ces états mitochondriales, réduisant ainsi biais qui peuvent se produireen sélectionnant arbitrairement un point. La quantité de mitochondries par puits a été déterminée par des essais d&#39;optimisation. La quantité optimale de mitochondries par puits devrait se traduire par État 2 taux entre 100-200 pmol / min / puits et l&#39;état 3 taux &lt;1,500 pmol / min / puits, puisque ces valeurs sont dans la gamme de détection d&#39;oxygène dynamique de l&#39;oxygène multi-puits machine de mesure de la consommation. Chargement trop de protéine mitochondriale par puits peut entraîner des OCR au-delà de la plage dynamique de l&#39;instrument (figure 3A). La figure 3 illustre le chargement de 3,5 ug de protéine mitochondriale par puits (de traçage bleu) par rapport à une charge de 2,5 ug de protéine mitochondriale par puits (rouge le traçage) pour le dosage succinate / roténone. Chargement trop de protéine mitochondriale par puits peut aussi conduire à l&#39;épuisement de l&#39;oxygène dans le microchambre du puits, empêchant ainsi une mesure précise de l&#39;OCR pour chaque mesure successive 9 (figure 3B &lt;/ strong&gt;). Le point-à-point OCR est le taux de variation instantané de la reconnaissance optique de caractères. Si plat, l&#39;OCR est stable / stable, mais si la baisse, alors il peut être un problème biologique ou technique. La forte baisse des OCR dans l&#39;État de 3 et de l&#39;État 3U respiration (figure 3A) est causée par les mitochondries épuiser les réserves d&#39;oxygène avant la fin de la mesure (figure 3B). La figure 4 représente en fonction du temps OCR pour le dosage de flux d&#39;électrons. Le tracé est corrigée et affichée comme décrit pour la figure 1. Le premier panneau dans cet essai représente État 3U respiration sur pyruvate / malate via complexe I. Le deuxième panel, après l&#39;injection de la roténone, représente l&#39;inhibition du complexe I respiration médiation. Le troisième panel, après l&#39;injection de succinate, représente substrat stimulé 3U de l&#39;Etat avec des électrons entrant dans le ETC au Complexe II (complexe II de la respiration médiation). Le quatrième panneau, après l&#39;injection de Antimycin A, représente l&#39;inhibition de la respiration complexe III et donc totale. Enfin, le cinquième panneau, après l&#39;injection de l&#39;ascorbate / TMPD, représente Complexe IV respiration médiation. Comme pour les tracés de la figure 1, tous les États ont mitochondriales écart minime, et chaque taux a ou presque a atteint un plateau. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig1.jpg" /> Figure 1. Accouplement dosages. (A) mM de pyruvate 10 / mM malate 5, (B) succinate 10 mM / 2 uM roténone, (C) 40 uM de palmitoyl carnitine / 1 mM malate, et (D) 10 mM de glutamate / 10 mM malate couplé mitochondriales tracés d&#39;analyse de la respiration, comme déterminé par mesure de la consommation d&#39;oxygène à puits multiples. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SD. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 3,5 ng pour tous les essais, sauf succinate / roténone, qui utilise 2,5 pg de protéine mitochondriale par puits. Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés. OCR = Taux de consommation d&#39;oxygène; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 - (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A; PYR = pyruvate; SUCC = succinate; ROT = roténone; PAL-C = palmitoyl carnitine; GLUT = glutamate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig1large.png" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig2.jpg" /> Figure 2. très variable pyruvate / Malate Assay. 10 mM pyruvate / 5 mM dosage malate Très variable causée par le mélange incomplètement mitochondries du stock mitochondrial dans le substrat / MAS mélange, conduisant ainsi à pro mitochondrial variablesprotéine chargement dans chaque puits. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 3,5 pg. Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés. OCR = Taux de consommation d&#39;oxygène; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 - (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A; PYR = pyruvate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig3.jpg" /> Figure 3. La surcharge mitochondriale protéines pour le succinate / roténone Assay. (A) les taux de consommation d&#39;oxygène en dehors de la plage dynamique de la machine de mesure de la consommation d&#39;oxygène multi-puits causé par le chargement de 3,5 ug de protéine mitochondriale par puits (de traçage bleu) par rapport à une charge de 2,5 ug de protéine mitochondriale par puits (de traçage rouge). (B ) OxyGen tension proche de zéro et des injections suivantes ADP FCCP provoqué par un chargement excessif protéine mitochondriale (3,5 ug) par puits (tracé bleu), comparativement à charger une quantité optimale (2,5 ug) de la protéine mitochondriale par puits (de traçage rouge). Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés par quantité de protéine mitochondriale. OCR = Taux de consommation d&#39;oxygène; ADP = adénosine diphosphate; Oligo = oligomycine A; FCCP = carbonyle cyanure 4 - (trifluorométhoxy) phénylhydrazone; Anti-A = antimycine A; SUCC = succinate; ROT = roténone; 2 O = oxygène; mm Hg = millimètres de mercure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig4.jpg" /> Figure 4. Essai de débit Electron. 5 mM de pyruvate / 1 mM + malate 4 uM FCCP, électrons ffaible dosage de respiration mitochondriale traçage tel que déterminé par la mesure de la consommation d&#39;oxygène multi-puits. Les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± SD. Protéine mitochondriale chargé par puits était de 3,5 pg. Les données représentent n = 3 répétitions biologiques appariés. OCR = Taux de consommation d&#39;oxygène; Anti-A = antimycine A; Asc = ascorbate; TMPD = N, N, N &#39;, N&#39; tétraméthyl- p-phénylènediamine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="0"><tbody><tr><td> Réactif </td><td> Stock Concentration </td><td> MW </td><td> Volume final </td><td> Masse ajoutée </td><td> Commentaires / Description </td></tr><tr><td></td><td> (M) </td><td> (g / mole) </td><td> (ml) </strong&gt; </td><td> (g ou ml) </td><td></td></tr><tr><td> EGTA, pH 7,2 </td><td> 0,1 </td><td> 380,35 </td><td> 100 ml de 1M Tris base </td><td> 3.801 g </td><td> Conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 238,3 </td><td> 250 ml de Dih 2 O </td><td> 59. 57 g </td><td> Conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> MgCl 2, hexahydrate </td><td> 1 </td><td> 203,31 </td><td> 250 ml de Dih 2 O </td><td> 50,82 g </td><td> Conserver à 4 ° C </td></tr><tr><td> Pyruvate pH 7,4 </td><td> 0,1 </td><td> 88.06 (Livré que 14.11 M solution) </td><td> 40 ml de Dih 2 O </td><td> 0.283 ml d&#39;acide pyruvique </td><td> Assurez aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C, effectuer frais toutes les deux semaines </td></tr><tr><td> Succinate pH 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 118.09 </td><td> 100 ml de Dih 2 O </td><td> 9,4 g de sul&#39;acide ccinic </td><td> Assurez aliquotes de 1 ml et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Malate, pH 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 134.09 </td><td> 100 ml d&#39;éthanol à 95% </td><td> 6,7 g d&#39;acide malique </td><td> Assurez aliquotes de 200 pi et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> TMPD </td><td> 0,01 </td><td> 164.25 </td><td> 10 ml </td><td> 0,0164 g </td><td> Faire 300 aliquotes et conserver à -20 ° C; Mélanger avec une quantité équimolaire d&#39;ascorbate de garder TMPD réduite </td></tr><tr><td> Palmitoyl chlorure de L-carnitine </td><td> 0,01 </td><td> 436,07 </td><td> 1,14 ml d&#39;éthanol à 95% </td><td> 0,005 g </td><td> Faire 40 aliquotes et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Un oligomycine </td><td> 0,006 </td><td> 791,06 </td><td> 0,987 ml d&#39;éthanol à 95% </td><td> 0,005 g </td><td> Faire 20 aliquotes et conserver à -20 ° C </td></tr&gt; <tr><td> FCCP </td><td> 0,01 </td><td> 254,17 </td><td> 3,9 ml d&#39;éthanol à 95% </td><td> 0,01 g </td><td> Faire 40 aliquotes et conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Roténone </td><td> 0,001 </td><td> 394,4 </td><td> 10 ml d&#39;éthanol à 95% </td><td> 0,0039 g </td><td> Conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> Antimycine A </td><td> 0,005 </td><td> 548,63 </td><td> 9,12 ml d&#39;éthanol à 95% </td><td> 0,025 g </td><td> Conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> K + ADP </td><td> 0,5 </td><td> 501,32 </td><td> 3,9 ml de Dih 2 O </td><td> 1,0 g </td><td> Conserver à -20 ° C </td></tr><tr><td> L&#39;acide malique, pH 7,4 </td><td> 0,5 </td><td> 134.09 </td><td> 40 ml </td><td> 2,68 g </td><td> Assurez aliquotes de 200 pi et conserver à -20 ° C </td></tr></tbody></table><strong&gt; Tableau 1. Image Solutions <table border="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Réactif </td><td> Stock Concentration </td><td> Masse ajoutée </td><td rowspan="2"> Molarité finale / Pourcentage </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (g ou ml) </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> - </td><td> 11,98 g </td><td> 70 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> - </td><td> 20.04 g </td><td> 220 mm </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique </td><td> - </td><td> 0,34 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2, hexahydrate </td><td> 1 </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 1,0 ml </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,1 </td><td> 5,0 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Essentiellement Fatty Acid Free-BSA </td><td> - </td><td> 1,0 g </td><td> 0,20% </td></tr></tbody></table> . Tableau 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: 25 ml aliquotes et conserver à -20 ºC * Note: Exclure BSA pour MAS mélange utilisé pour les injections de dosage. <table border="0"><tbody><tr><td> Substrat moyen </td><td> Concentration finale </td><td> Montant de stock (ul) </td><td> Montant du MAS * (ml) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Pyruvate / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mM / 5 mM </td><td> Pyruvate: 1000 </td><td rowspan="2"> 9 </td></tr><tr><td> Malate: 100 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Succicinate / roténone </td><td rowspan="2"> 10 mm / 2 pM </td><td> Succinate: 200 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Roténone 20 </td></tr><tr><td rowspan="3"> * Pyruvate / Malate + FCCP </td><td rowspan="3"> 5 mM / 1 mM / 4 pM </td><td> Pyruvate: 500 </td><td rowspan="3"> 10 </td></tr><tr><td> FCCP: 4 </td></tr><tr><td> Malate: 20 </td></tr><tr><td> Palmitoyl L-carnitine / Malate </td><td> 40 uM / 1 mM </td><td> Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Glutamate / malate </td><td rowspan="2"> 10 mM / 10 mM </td><td> Glutamate: 400 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Malate: 200 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Solutions Substrat pH 7.4: Faire fraîches le jour de l&#39;expérience. * Electron solution d&#39;analyse de flux. <table border="0"><tbody><tr><td> Injection moyen </td><td> Concentration </td><td> Montant de stock (ul) </td> &lt;td&gt; Montant de la MAS (ml) </td><td> Montant injecté dans la cartouche </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> (Après injecté dans la plaque) </td></tr><tr><td> ADP </td><td> 50 mM </td><td> 300 ul </td><td> 3 </td><td> 50 ul </td><td> 5,0 mm </td></tr><tr><td> Un oligomycine </td><td> 20 pM </td><td> 10 ul </td><td> 3 </td><td> 55 pi </td><td> 2,0 pM </td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 40 pM </td><td> 12 pi </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 pm </td></tr><tr><td> Antimycine A </td><td> 40 pM </td><td> 24 pi </td><td> 3 </td><td> 65 pi </td><td> 4,0 pm </td></tr></tbody></table> T4. capables injections pour les dosages couplés de pH 7,4:. Assurez frais le jour de l&#39;expérience. * Des analyses de couplage comprennent (mais ne sont pas limités à) un pyruvate / malate, le succinate / roténone, palmitoyl carnitine / malate, glutamate et / malate. <table border="0"><tbody><tr><td> Injection moyen </td><td> Concentration </td><td> Montant de stock (g ou ul) </td><td> Montant de la MAS (ml) </td><td> Montant injecté dans la cartouche </td><td> Concentration finale (après injecté dans la plaque) </td></tr><tr><td> Roténone </td><td> 20 pM </td><td> 60 ul </td><td> 3 </td><td> 50 ul </td><td> 2,0 pM </td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 50 mM </td><td> 300 ul </td><td> 3 </td><td> 55 pi </td><td> 5,0 mm </td></tr><tr><td> Antimycine A </td><td> 40 pM </td><td> 24 μ; l </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 pm </td></tr><tr><td> TMPD / Ascorabte </td><td> 1 mM, 100 mM </td><td> TMPD: 300 ul </td><td> 3 </td><td> 65 pi </td><td> 100 uM, 10 mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ascorbate: 0,059 g </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 5. Les injections de flux d&#39;électrons dosage de pH 7,4. Faire frais le jour de l&#39;expérience <table border="0"><tbody><tr><td> Commande </td><td> Temps (min) </td><td> Nombre de cycles </td></tr><tr><td> Étalonner </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Attendez </td><td> 10 min (pour permettre à la plaque pour réchauffer de l&#39;étape de l&#39;adhésion) </td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1 min </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> MoiAsure </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injecter A </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1 min </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injecter B </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1 min </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injecter C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1 min </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injecter D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mélanger </td><td> 1 min </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Mesure </td><td> 2 min </td></tr></tbody></table> Tableau 6. Instrument Protocole Exécuter.

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Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Utilisation de mitochondries isolées à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour microplaques à haut débit respiratoire mesurée

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K vues.  Virginia Tech. The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

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Recherche

Biologie du développement

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

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Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Induction de aiguë Skeletal Muscle Régénération par cardiotoxine Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Préparation et culture de cellules Myogenic Précurseurs / myoblastes primaires de muscle squelettique des adultes et les humains âgés

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at least two pericyte subpopulations (called type I and type II), which express different molecular markers and have distinct differentiation capabilities. Using NG2-DsRed and Nestin-GFP double-transgenic mice, type I (NG2-DsRed+Nestin-GFP-) and type II (NG2-DsRed+Nestin-GFP+) pericytes have been successfully isolated. However, the availability of these double-transgenic mice prevents the widespread use of this purification method. This work describes an alternative protocol that allows for the easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles. This protocol utilizes the fluorescence-activated cell sorting (FACS) technique and targets PDGFR&#946;, rather than NG2, together with the Nestin-GFP signal. Following isolation, type I and type II pericytes show distinct morphologies. In addition, type I and type II pericytes isolated with this new method, like those isolated from the double-transgenic mice, are adipogenic and myogenic, respectively. These results suggest that this protocol can be used to isolate pericyte subpopulations from skeletal muscles and possibly from other tissues.

This work describes a FACS-based protocol that allows for easy and simultaneous isolation of type I and type II pericytes from skeletal muscles.

Isolation des Pericytes de Type I et de Type II des Muscles Squelets de la Souris

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Application d’une Stimulation chronique pour étudier les Rat d’induite par l’activité Contractile du Muscle squelettique phénotypique Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Identification des cellules satellites musculaires squelettiques par Immunofluorescence avec des anticorps de laminine et Pax7

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal muscle. Mouse skeletal muscle has been shown to produce high quality X-ray diffraction patterns on third generation synchrotron beamlines providing an opportunity to link changes at the level of the genotype to functional phenotypes in health and disease by determining the structural consequences of genetic changes. We present detailed protocols for preparation of specimens, collecting the X-ray patterns and extracting relevant structural parameters from the X-ray patterns that may help guide experimenters wishing to perform such experiments for themselves.

We present detailed protocols for performing small-angle X-ray diffraction experiments using intact mouse skeletal muscles. With the wide availability of transgenic mouse models for human diseases, this experimental platform can form a useful test bed for elucidating the structural basis of genetic muscle diseases

Diffraction de rayon X du muscle squelettique intact de Murine comme outil pour étudier la base structurale de la maladie de muscle

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle regenerative process. There are recognized challenges to working with human primary adult stem cells, particularly human muscle progenitor cells (hMPCs) derived from skeletal muscle biopsies, including low cell yield from collected tissue and a large degree of donor heterogeneity of growth and death parameters among cultures. While incorporating heterogeneity into experimental design requires a larger sample size to detect significant effects, it also allows us to identify mechanisms that underlie variability in hMPC&#160;expansion capacity, and thus allows us to better understand heterogeneity in skeletal muscle regeneration. Novel mechanisms that distinguish the expansion capacity of cultures have the potential to lead to the development of therapies to improve skeletal muscle regeneration.

We present techniques for isolating, culturing, characterizing, and differentiating human primary muscle progenitor cells (hMPCs) obtained from skeletal muscle biopsy tissue. hMPCs obtained and characterized through these methods can be used to subsequently address research questions related to human myogenesis and skeletal muscle regeneration.

Isolement, culture, caractérisation et différenciation des cellules de l'ancêtre musculaire humain de la procédure de biopsie musculaire squelettique

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

Exécution des xénogreffes de muscle squelettique humain dans les souris immunodéficientes

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...