Ce travail a été appuyée par la Société de recherche sur le cancer Scholars Grant américaine (RSG-12-148-01-DDC) et la biologie Award CIRM de base (RB4-05779).

Le protocole de la peau humaine a été réalisée en conformité avec les directives de l&#39;Université de Californie, Comité d&#39;éthique de la recherche de San Diego. La peau humaine peut être obtenue à partir d&#39;échantillons chirurgicaux jetés ou achetés auprès des banques de la peau (banque de peau est listé dans la table Matériel / Equipement). L&#39;endroit où la peau est dérivée de ou âge du donneur est pas critique pour l&#39;expérience, tant que les protéines de la zone de la membrane basale (collagène / laminine) dans le derme sont pas dégradées. 1. Préparation de dévitalisées derme humain <ol><li> À la réception de la peau humaine, placer le tissu dans la hotte de culture de tissu à décongeler (~ 3-5 min). Selon la taille de la peau, placez le tissu décongelé dans un tube conique de 50 ml stérile à usage unique ou flacon de 125 ml. La taille typique de la peau à partir de la banque de la peau est de 0,75 pieds carrés. </li><li> Remplissez le réservoir plein à 75% avec 4x pénicilline et de streptomycine (stylo / angine) dans PBS 1x. Agiter vigoureusement pendant5 min et éliminer le liquide. Répétez cette étape 3 fois de plus. </li><li> Après le dernier lavage, transférer le tissu dans un nouveau tube / bouteille et ajouter 4x frais stylo / streptocoque / PBS à combler 75% du récipient. Incuber ce mélange dans un incubateur de culture de tissu à 37 ° C pendant 2 semaines pour permettre la séparation du derme de l&#39;épiderme. </li><li> Dans des conditions stériles, utiliser une pince pour décoller l&#39;épiderme du derme. Le derme est complètement blanc tandis que l&#39;épiderme auront coloration en fonction de la course du donneur (figure 1A). Jeter l&#39;épiderme selon le protocole de l&#39;établissement pour le traitement des tissus humains. </li><li> Placez le derme dans un tube ou le flacon et le laver à 4x stylo / angine dilué dans PBS 1x avec une agitation vigoureuse (lavages de 5 min pour 4 fois). Après le dernier lavage, transférer le derme pour un nouveau tube / bouteille dans 4x stylo / angine dilué dans PBS 1x et conserver à 4 ° C jusqu&#39;au moment de servir. Derme peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu&#39;à un an. </li></ol&gt; 2. modifier génétiquement primaire kératinocytes humains REMARQUE: utiliser des cellules de Phoenix amphotropes cultivées en milieu DMEM complet [DMEM + 10% de sérum fœtal bovin (FBS) + stylo / angine] pour produire des virus pour infecter les kératinocytes humains primaires. Gènes d&#39;encapsidation virale qui codent pour des protéines telles que gag-pol et l&#39;enveloppe sont intégrés de manière stable dans le génome de la cellule Phoenix qui permet la production de virus lorsque transfectée avec un vecteur rétroviral. Phoenix cellules peuvent être transfectées avec un rendement élevé permettant une production élevée de titre viral. Virus produite à partir de cette ligne d&#39;emballage peut également infecter une grande variété de cellules de mammifères y compris l&#39;homme. <ol><li> Jour 1: Le jour avant la transfection, les cellules de Phoenix de semences dans une plaque à 6 puits à une densité de 800.000 cellules par puits dans des milieux DMEM complet. </li><li> Jour 2: Le jour de la transfection, utilisez 3 pg de vecteurs rétroviraux par puits. Aliquote 3 pg de vecteur rétroviral dans un tube de 1,5 ml. Utilisez un mélange de 100 μ; l DMEM plus 6 pi de réactif de transfection pour chaque 3 pg de vecteur. Mélanger 6 ul de réactif de transfection avec 100 ul de DMEM dans un tube de 1,5 ml. (Les vecteurs rétroviraux qui sont utilisés sont listés dans le tableau équipement / matériaux). <ol><li> Incuber pendant 5 min et ajouter le mélange 106 pi dans le tube pré-aliquoté contenant le 3 pg de vecteur retroviral. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 min. Ajouter l&#39;ensemble de ce mélange goutte à goutte dans chaque puits des cellules de Phoenix. </li></ol></li><li> Jour 3: Le jour après la transfection, retirez le support à partir des cellules de Phoenix et ajouter 2 ml de milieu complet frais DMEM. Le même jour, ensemencer les kératinocytes humains primaires dans des plaques 6 puits à une densité de 75.000 cellules par puits. Maintenir les kératinocytes dans un milieu de sérum de kératinocytes libre (KCSFM) avec des antibiotiques (pénicilline / streptomycine). REMARQUE: kératinocytes humains primaires ont été achetés. Les cellules peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs (énumérés dans le tableau Matériel / Equipement). </li><li> Jour 4: Haracquises les médias à partir des cellules transfectées de Phoenix, qui contient maintenant des particules virales. Passez les médias à travers un filtre de 0,45 um en utilisant une seringue (pour enlever les cellules contaminantes Phoenix) et placer 2 ml sur les kératinocytes (étalées à 75.000 cellules / puits la veille: voir l&#39;étape 2.3). Ajouter le bromure de hexadiméthrine (5 ug / ml) aux médias pour aider à la médiation du processus d&#39;infection. Les titres viraux sont ~ 1 x 10 7 TU / ml. <ol><li> Faites tourner les plaques à 6 puits dans une centrifugeuse à 200 xg pendant 1 heure à température ambiante. Après le spin, retirez le support contenant le virus et laver les cellules une fois avec PBS 1x avant d&#39;ajouter KCSFM. </li></ol></li><li> Jour 5: Infect le même lot de kératinocytes de nouveau comme dans l&#39;étape 2.4. REMARQUE: Sélectionnez les kératinocytes en utilisant un médicament si il est un marqueur de sélection sur le vecteur rétroviral et d&#39;étendre pour une utilisation dans l&#39;analyse ou des applications telles que les cultures organotypiques aval. </li></ol> 3. Configuration de cultures de peau organotypiques <ol><li> Construire leCassette organotypique à partir de matières communes trouvées dans le laboratoire ou les cassettes peut être personnalisé grâce à un atelier de fabrication métallique (figure 2A - F). Pour rendre ces cassettes à partir d&#39;une plaque de culture de tissu de 3,5 cm, utiliser un cautère pour enlever un carré 1.0 cm x 1.0 cm du centre du couvercle d&#39;un plat de 3,5 cm (Figure 2A-B). Pour ce faire, dans des conditions stériles. <ol><li> Fixez des chevilles carrées au fond de la cassette (couvercle de 3,5 cm plat) en utilisant vernis à ongles transparent (figure 2C). Laisser 5 min pour le vernis à ongles de sécher et de retourner la cassette au cours de sorte qu&#39;il repose sur les chevilles carrées (figure 2D). Placez la cassette dans un plat de 6 cm. REMARQUE: Square Pegs peuvent être achetés à partir d&#39;une variété de boutiques d&#39;artisanat. </li></ol></li><li> Préparer un milieu de croissance de kératinocytes (KGM) composé de 66% de DMEM, 22% F12 de Ham, 100 unités / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, 10% de FBS, 2,67 pg / ml adenine, 40 ng / ml d&#39;hydrocortisone, 10 toxine ng / ml de choléra, 4,94 pg / ml d&#39;insuline, 5 pg / ml de transferrine, 1,36 ng / ml Triiodo-L-thyronine, 10 ng / ml d&#39;EGF, et 10 ug / ml de chlorhydrate de ciprofloxacine. Filtrez les médias à travers un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C jusqu&#39;au moment de servir. </li><li> Prenez le derme de la plume 4x / streptocoque + solution de PBS et laver 2 fois dans KGM puis incuber dans KGM à 37 ° C pendant deux jours avant de les utiliser. </li><li> Couper le derme à l&#39;aide d&#39;un scalpel à 1,5 cm x 1,5 cm de morceaux de la taille et ensuite placer sur la cassette organotypique. Placez le derme avec la partie supérieure du derme vers le haut. La partie supérieure du derme sera le côté qui vient en contact avec les kératinocytes (figure 1B). </li><li> Placez le derme prédécoupées sur le trou carré de la cassette organotypique avec le côté supérieur du derme vers le haut (figure 3A). </li><li> Retournez la totalité de la cassette contenant organotypique le derme plus de l&#39;aide de pinces (figure 3B). Décongeler la solution de la matrice extracellulaire sur la glace. Utiliser une aiguille et une seringue pour tirer 100 pi de solution de matrice extracellulaire par cassette. Ajouter 5 gouttes au fond du derme (côté brillant) et secouez légèrement pour assurer une distribution uniforme à travers le derme (figure 3B). </li><li> Autoriser 5 min pour la solution de la matrice extra-cellulaire commerciale pour solidifier complètement (figure 3C). Après solidification, utiliser une pince pour retourner la cassette terminée. Ajouter 4 ml de KGM à 6 cm plat. </li><li> Placez 0,5-1 millions de kératinocytes génétiquement modifiés sur les cassettes contenant les organotypiques derme (figure 3D). <ol><li> Trypsiniser les kératinocytes en plaçant 4 ml de trypsine à 0,05% sur plaques de 10 cm pendant 5 minutes et éteindre avec 4 ml de milieu DMEM complet. </li><li> Comptez les kératinocytes en utilisant un hémocytomètre puis centrifuger à 200 g pendant 5 min. Resuspendre les cellules de 0,5 à 1 million (en fonction du nombre de cellules disponibles) dans 90 μl de KGM et placez toutes les cellules sur le derme. Remarque: il est important de placer le même nombre de cellules de derme dans la même expérience pour s&#39;assurer que les différences observées dans épaisseur de l&#39;épiderme régénéré est pas due à des différences dans le nombre de cellules de départ. Placer moins de 0,5 millions de cellules sur le derme peut conduire à une mauvaise stratification et de différenciation. </li></ol></li><li> Changer de support KGM sur les cultures organotypiques tous les autres jours. Récolte tissus 1-14 jours après le placement des kératinocytes sur le derme. Stratification complète et la différenciation de l&#39;épiderme survient généralement après 5 jours. </li></ol>

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We have nothing to disclose.

La manipulation génétique dans la peau humaine cultures organotypiques offrent de nombreux avantages à couramment étudié 2D cellules cultivées ainsi que des modèles de souris. Cultures 2D pas les trois dimensions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire interactions trouvés dans les tissus et organes intacts. Des études récentes ont également trouvé d&#39;énormes différences entre les cellules de cancer de la peau en culture 2D et 3D avec les cellules cultivées en 3D montrant beaucoup plus de si...

L&#39;épiderme humain est un épithélium stratifié qui se connecte au derme sous-jacent à travers une matrice extracellulaire connu comme l&#39;épiderme zone.The de la membrane basale sert non seulement une barrière imperméable pour empêcher la perte d&#39;humidité, mais aussi en tant que première ligne de défense pour protéger le le corps des substances étrangères et toxiques 1. La couche de base, qui est la couche la plus profonde de l&#39;épiderme, les cellules épidermique contient souches et progénitrices qui donnent lieu à la descendance différenciée qui forment le reste de l&#39;épiderme 2. Comme les cellules progénitrices de l&#39;épiderme se différencient de leur migration vers le haut pour former la première couche de cellules différenciées connu que la couche épineuse 3. Dans la couche épineuse, les cellules tournent sur l&#39;expression de kératines 1 et 10, qui fournit alors la force de résister à une contrainte physique pour les couches différenciées de l&#39;épiderme. Comme les cellules de la couche épineuses se différencient en outre, ils se déplacent vers le haut dans l&#39;épiderme à dem la couche granulaire qui est caractérisée par la formation de granules de kératohyaline et lamellaires ainsi que des protéines de structure qui sont assemblés en dessous de la membrane plasmique. Comme les cellules passent dans le processus de différenciation, les protéines sous la membrane de plasma sont réticulés les uns aux autres, tandis que les granulés sont extrudés lamellaires à partir des cellules pour former une barrière lipidique riche appelée stratum corneum 4. Les maladies qui impliquent des altérations de croissance épidermique et de l&#39;impact de la différenciation de ~ 20% de la population 5. Ainsi, la compréhension des mécanismes de ce processus est d&#39;une grande importance. Depuis manifestation de plusieurs de ces maladies est subordonnée à cellule-cellule ou cellule-matrice de contact, cultures organotypiques où l&#39;épiderme humain est reconstitué dans un environnement 3D ont été créés 6-10. Ces procédés impliquent typiquement l&#39;utilisation de kératinocytes primaires ou transformées ensemencées sur la matrice extracellulaire telles que les humains dévitalisésderme, Matrigel, le collagène ou. Pour comprendre les mécanismes de régulation des gènes qui sont importants pour la croissance et la différenciation de l&#39;épiderme, les kératinocytes peuvent être manipulées génétiquement par des vecteurs rétroviraux pour surexprimer des gènes knockdown ou en culture 2D et ensuite reconstitués en 3D. Ces méthodes ont été largement utilisées pour caractériser les gènes impliqués dans l&#39;épiderme souches et cellules progénitrices auto-renouvellement et de différenciation ainsi que la progression de la néoplasie 11-21. Ici, un protocole en profondeur sur la façon de modifier l&#39;expression génique dans des cultures organotypiques épidermiques par l&#39;utilisation de retrovirus est fourni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human skin</td>
			<td>New York Firefighters Skin Bank</td>
			<td><a href="http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN/STREP</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotropic phoenix cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3213</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Media (KCSFM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17005042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11995</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Cambrex</td>
			<td>12-615F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10437-028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-9795</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C-8052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>3896</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-1882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13247-051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0665</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin Hydrochloride</td>
			<td>Serologicals</td>
			<td>89-001-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>PRB-149P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square pegs</td>
			<td>Arts and crafts stores</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human neonatal keratinocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-200-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human neonatal keratinocytes</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>102K-05n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCV retroviral vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LZRS retroviral vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSuper.Retro.Puro Retroviral vector</td>
			<td>Oligoengine</td>
			<td>VEC-PRT-0002&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexadimethrine bromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis

Cultures organotypiques permettent la reconstitution d&#39;un environnement 3D critique pour les interactions de contact cellule-cellule et de cellule-matrice qui imite la fonction et la physiologie de leurs homologues in vivo de tissus. Ceci est illustré par des cultures organotypiques de peau qui récapitule fidèlement la différenciation épidermique et le programme de stratification. Kératinocytes primaires épidermiques humains sont génétiquement manipulable par rétrovirus où les gènes peuvent être facilement surexprimés ou renversé. Ces kératinocytes génétiquement modifiées peuvent ensuite être utilisés pour régénérer l&#39;épiderme humain dans des cultures organotypiques de peau qui fournissent un modèle puissant pour étudier les voies génétiques croissance épidermique d&#39;impact, la différenciation et la progression de la maladie. Les protocoles présentés ici décrivent des procédés pour préparer de derme humains dévitalisés ainsi que pour manipuler génétiquement les kératinocytes humains primaires afin de générer des cultures organotypiques de peau. La peau humaine régénéré peut être utilisé dans downstrEAM applications telles que le profilage de l&#39;expression génique, une immunocoloration, des immunoprécipitations et de chromatine suivie de séquençage à haut débit. Ainsi, la production de ces cultures organotypiques de peau génétiquement modifiés permettra à la détermination des gènes qui sont essentiels pour le maintien de l&#39;homéostasie de la peau.

La première étape dans la génération de la peau humaine organotypique est d&#39;enlever l&#39;épiderme du derme. Le 2 semaines d&#39;incubation de la peau à 37 ° C dans 4 x pen / strep / PBS devrait permettre la séparation du derme de l&#39;épiderme (figure 1A). Si la séparation des épiderme et le derme est difficile puis placez le tissu à 37 ° C en 4x stylo / streptocoque / PBS pendant une semaine et puis essayer de nouveau pelage en utilisant une pince. Une de...

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Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Génération des cultures organotypiques de peau génétiquement modifiées en utilisant Dévitalisées derme humain

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K vues.  UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego. The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. 

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Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Trancher les cultures organotypiques d&#39;études de neurogenèse postnatale

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Recherche

Biologie du développement

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Génération de tissu adipeux humain cellules souches par dédifférenciation des adipocytes matures dans les cultures de plafond

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l&#39;homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D organotypiques Co-culture Modèle Soutenir médullaire thymique des cellules épithéliales prolifération, la différenciation et Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Génération de l&#39;intégration sans anthropiques cellules souches pluripotentes utilisant des kératinocytes cheveux dérivés

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

A Modified Trier Social Stress Test for Vulnerable Mexican American Adolescents

The Trier Social Stress Test (TSST) is a well validated and widely used social stressor that has been shown to induce a 2-4 fold increase in cortisol, the biological output produced by the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) axis in humans. While studies have explored how modifications to the TSST influence stress responsivity, few studies have created a modified TSST appropriate for vulnerable youth that elicits a significant cortisol stress response. Thus, the current study sought to modify or adjust the TSST in a culturally sensitive way for a vulnerable sample of 14 year-old adolescents. The present study took place within the context of a longitudinal birth cohort study of Mexican American families in California called the Center for the Health Assessment of Mothers and Children of Salinas (CHAMACOS). The CHAMACOS sample was optimal to test the effectiveness of a modified culturally appropriate TSST, as it is comprised of Mexican American youth, who are often excluded from research. These youths also have experienced significant early life adversity. Example modifications included timed prompts, alternative math tasks, use of same-ethnicity peers as confederates, debriefing immediately after the conclusion of the TSST, and using an unknown youth examiner to administer the debrief. Saliva samples were collected at baseline (after a resting phase), and then again at 15, 30, and 45 min post-TSST onset to assess cortisol concentration. A pilot study of 50 participants (50% female) have been analyzed for cortisol reaction to the TSST. Results confirmed that this modified version of the TSST was successful at eliciting a significant cortisol reaction, with a wide range of variability likely due to individual differences. Goals for modifications and ethnicity considerations are discussed. This study provides the foundation for future research to utilize a modified TSST with vulnerable youth.

Here, we present a protocol that provoked cortisol reactivity in a vulnerable adolescent Mexican American sample utilizing a modified version of the Trier Social Stress Test (TSST). Saliva samples were collected at baseline, 15, 30, and 45 min post-TSST onset. Future research could utilize this modified TSST with vulnerable youth.

Un test de stress social modifié de Trèves pour les adolescents mexicains mexicains vulnérables

The Trier Social Stress Test (TSST) is a well validated and widely used social stressor that has been shown to induce a 2-4 fold increase in cortisol, the ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d&#39;ovocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

Génération et culture de kératinocytes humains primaires de peau adulte

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Culture organotypique en trois dimensions des organes sensoriels vestibulaires et auditives

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...