עבודה זו הייתה supportedby האמריקאי למלחמה בסרטן אגודת מחקר החוקרים גרנט (RSG-12-148-01-DDC) ופרס CIRM יסוד הביולוגיה (RB4-05779).

פרוטוקול העור האנושי נערך בהתאם להנחיות של אוניברסיטת קליפורניה, ועדת האתיקה של המחקר בסן דייגו. ניתן להשיג עור אדם מדגימות כירורגית שהושלכו או שנרכש מבנקי עור (בנק עור נזכר בטבלת חומר / ציוד). המיקום שבו העור נגזר מאו גיל של התורם אינו קריטי לניסוי עוד חלבוני אזור קרום במרתף (קולגן / laminin) בדרמיס אינם מושפלים. 1. הכנת עור אדם חסר חיוניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קבלת עור אנושי, הנח את הרקמה בשכונה תרביות הרקמה להפשיר (~ 3-5 דקות). בהתאם לגודל של העור, רקמות למקם מופשרים בצינור סטרילי חד פעמי 50 מיליליטר חרוטי או 125 מיליליטר בקבוק. הגודל האופייני של עור מבנק העור הוא 0.75 מ&quot;ר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המכל 75% מלאים עם פניצילין וסטרפטומיצין 4x (עט / סטרפטוקוקוס) ב1x PBS. לנער במרץ לדקות ו -5 להיפטר מהנוזלים. חזור על פעולה זו 3 פעמים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את הרקמה לצינור / בקבוק חדש ולהוסיף 4x הטרי עט / סטרפטוקוקוס / PBS למלא 75% מהמכל. דגירה את התערובת בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות כדי לאפשר את ההפרדה של הדרמיס מהאפידרמיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתנאים סטריליים, להשתמש במלקחיים כדי לקלף את העור מהעור. הדרמיס הוא לבן לחלוטין תוך האפידרמיס יהיה צביעה בהתאם לגזע של התורם (איור 1 א). מחק את האפידרמיס על פי הפרוטוקול של המוסד לטיפול ברקמות אנושיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העור בצינור או בקבוק ולשטוף אותו בעט / סטרפטוקוקוס 4x המדולל ב1x PBS עם טלטול נמרץ (5 שטיפות דקות ל4 פעמים). לאחר השטיפה האחרונה, להעביר את הדרמיס לצינור / בקבוק חדש ב4x העט / סטרפטוקוקוס בדילול המלא 1x PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. ניתן לאחסן הדרמיס על 4 מעלות צלזיוס עד שנה. </li></ol&gt; 2. גנטי שינוי קרטינוציטים הערה: תאי פניקס amphotropic שימוש גדלו בתקשורת DMEM המלאה [DMEM + 10% בסרום שור (FBS) + עט / סטרפטוקוקוס העוברי] לייצר וירוסים להדביק קרטינוציטים אדם עיקריים. גני האריזה ויראלי, מקודדי חלבונים כגון איסור פרסום-Pol ומעטפה משולבים ביציבות לתוך הגנום של תאי הפניקס המאפשר לייצור וירוס כאשר transfected עם וקטור retroviral. ניתן transfected תאי פניקס עם יעילות גבוהה המאפשרת ייצור כייל נגיף גבוה. וירוס המופק מקו אריזה זה יכול להדביק גם מגוון גדול של תאי יונקים, כולל אדם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: היום לפני transfection, תאי זרע פניקס בצלחת 6-גם בצפיפות של 800,000 תאים לכל גם בתקשורת DMEM מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: יום transfection, להשתמש בכל טוב 3 מיקרוגרם של וקטורי retroviral. Aliquot 3 מיקרוגרם של וקטור retroviral לתוך צינור 1.5 מיליליטר. להשתמש בשילוב של 100 μ; L DMEM בתוספת 6 μl של מגיב transfection לכל 3 מיקרוגרם של וקטור. מערבבים 6 μl של מגיב transfection עם 100 DMEM μl בצינור 1.5 מיליליטר. (וקטורי retroviral המשמשים מפורטים בטבלת ציוד / חומרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות ומוסיפים את תערובת 106 μl לתוך הצינור מראש aliquoted המכיל 3 מיקרוגרם של וקטור retroviral. לערבב דגירה על RT למשך 30 דקות. להוסיף כל dropwise את התערובת היטב בכל תאי הפניקס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: היום לאחר transfection, להסיר את המדיה מתאי הפניקס ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת DMEM המלאה הטרי. באותו היום, זרע קרטינוציטים אדם עיקריים ל6-גם צלחות בצפיפות של 75,000 תאים בכל טוב. לשמור על קרטינוציטים במדיום סרום keratinocyte חופשי (KCSFM) עם אנטיביוטיקה (עט / סטרפטוקוקוס). הערה: קרטינוציטים אדם יסודיים נרכשו. ניתן לרכוש תאים ממגוון רחב של ספקים (המפורט בטבלת חומר / ציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4: הריבשילו התקשורת מתאי פניקס transfected, אשר כעת מכילים חלקיקים נגיפיים. להעביר את התקשורת באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר באמצעות מזרק (כדי להסיר את כל תאי פניקס זיהום) ומקום 2 מיליליטר על קרטינוציטים (מצופים ב75,000 תאים / גם היום קודם לכן: ראה שלב 2.3). להוסיף ברומיד hexadimethrine (5 מיקרוגרם / מיליליטר) לתקשורת כדי לעזור לתווך בתהליך ההדבקה. titers ויראלי הם ~ 1 x 10 7 TU / מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין 6 הצלחות גם בצנטריפוגה XG 200 עבור שעה 1 ב RT. אחרי הספין, להסיר את המדיה המכילה וירוס ולשטוף את התאים פעם עם PBS 1x לפני הוספת KCSFM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5: להדביק אותו אצווה של קרטינוציטים שוב כמו בשלב 2.4. הערה: בחר את קרטינוציטים באמצעות תרופה אם יש סמן לבחירה על וקטור retroviral ולהרחיב לשימוש בניתוח או יישומים כגון תרבויות organotypic במורד הזרם. </li></ol> 3. הגדרת תרבויות עור Organotypic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנותקלטת organotypic מחומרים נפוצים שנמצאו במעבדה או הקלטות יכולה להיות מותאמת אישית עשתה דרך חנות ייצור מתכת (איור 2 א - ו). כדי להפוך קלטות אלה מצלחת תרבית רקמת 3.5 סנטימטר, להשתמש כויה להסיר כיכר 1.0 סנטימטרים X 1.0 סנטימטר ממרכז המכסה של צלחת 3.5 סנטימטר (איור 2 א-ב). האם זה בתנאים סטריליים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף יתדות כיכר לחלק התחתון של הקלטת (מכסה של 3.5 מנה סנטימטרים) באמצעות פולני ברור מסמר (איור 2 ג). לאפשר 5 דקות ללק להתייבש ולהפוך את הקלטת על כך שהוא מונח על היתדות מרובעות (איור 2 ד). מניחים את הקלטת לתוך צלחת 6 סנטימטר. הערה: כיכר יתדות ניתן לרכוש ממגוון רחב של אומנויות ומלאכות חנויות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדיום גידול keratinocyte (קג&quot;מ) היווה 66% DMEM, 22% F12 של בשר חזיר, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 10% FBS, 2.67 מיקרוגרם / מיליליטר אדנין, 40 ng / ml הידרוקורטיזון, 10 רעל ng / ml כולרה, 4.94 מיקרוגרם / מיליליטר אינסולין, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin, 1.36 ng / ml Triiodo-L-thyronine, 10 ng / ml EGF, ו -10 מיקרוגרם / מיליליטר hydrochloride ציפרופלוקסצין. סנן את התקשורת דרך מסנן וחנות 0.22 מיקרומטר על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הדרמיס מתוך העט / סטרפטוקוקוס 4x + פתרון PBS ולשטוף 2 פעמים בקג&quot;מ ואז דגירה בקג&quot;מ ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור באמצעות אזמל 1.5 סנטימטרים X 1.5 סנטימטר חתיכות בגודל ולאחר מכן למקם על גבי קלטת organotypic. מניחים את העור עם החלק העליון של הדרמיס פונה כלפי מעלה. חלקיו העליונים של הדרמיס יהיה הצד שבא במגע עם קרטינוציטים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העור החתוך מראש על החור המרובע של קלטת organotypic עם הצד העליון של הדרמיס פונה כלפי מעלה (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הקלטת כל organotypic מכילה הדרמיס על שימוש במלקחיים (איור 3). להפשיר את פתרון מטריקס על קרח. שימוש במחט ומזרק לצייר מתוך פתרון מטריקס לקלטת 100 μl. הוסף 5 טיפות לתחתית של הדרמיס (צד מבריק) ולנער מעט כדי להבטיח אפילו הפצה ברחבי הדרמיס (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 5 דקות לפתרון מטריצה ​​סלולרית נוסף המסחרי לביסוס לחלוטין (איור 3 ג). לאחר התמצקות, להשתמש במלקחיים כדי להעיף את הקלטת בחזרה מעל. הוסף 4 מיליליטר של קג&quot;מ לצלחת 6 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 0.5-1,000,000 קרטינוציטים מהונדסים גנטי על קלטות organotypic מכילות הדרמיס (איור 3D). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize קרטינוציטים על ידי הצבת 4 מיליליטר של 0.05% טריפסין על צלחות 10 סנטימטרים למשך 5 דקות ולהרוות עם 4 מיליליטר של תקשורת DMEM המלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזן קרטינוציטים באמצעות hemocytometer ואז ספין למטה XG 200 במשך 5 דקות. תאי .5-1,000,000 גלולים (תלוי במספר התאים הזמינים) ב -90 μl של קג&quot;מ ולמקם את כל התאים על גבי העור. הערה: חשוב לשים את אותו המספר של תאים בדרמיס באותו הניסוי על מנת להבטיח כי כל הבדלים ראו בעובי של האפידרמיס מחדש הוא לא בשל הבדלים במתחילים מספר תא. הצבה פחות מ -0.5 מיליון תאים בדרמיס יכול להוביל לריבוד ובידול העניים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי תקשורת קג&quot;מ בתרבויות organotypic בכל יום אחר. רקמת קציר 1-14 ימים לאחר ההנפקה של קרטינוציטים בדרמיס. ריבוד ובידול מלא של האפידרמיס מתרחש בדרך כלל לאחר היום 5. </li></ol>

<ol>
	<li>Tadeu, A. M., Horsley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells+in+adult+skin.">Epithelial stem cells in adult skin.</a> Current topics in developmental biology. 107, 107-131 (2014).</li><li>Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+one's+identity:+the+epigenetic+basis+of+stem+cell+fate+decisions.">Remembering one's identity: the epigenetic basis of stem cell fate decisions.</a> FASEB J. 25, 2123-2128 (2011).</li><li>Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+barrier+formation+and+recovery+in+skin+disorders.">Epidermal barrier formation and recovery in skin disorders.</a> J Clin Invest. 116, 1150-1158 (2006).</li><li>Eckert, R. L., Sturniolo, M. T., Broome, A. M., Ruse, M., Rorke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transglutaminase+function+in+epidermis.">Transglutaminase function in epidermis.</a> J Invest Dermatol. 124, 481-492 (2005).</li><li>Lopez-Pajares, V., Yan, K., Zarnegar, B. J., Jameson, K. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+pathways+in+disorders+of+epidermal+differentiation.">Genetic pathways in disorders of epidermal differentiation.</a> Trends Genet. 29, 31-40 (2013).</li><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+differentiation:+the+bare+essentials.">Epidermal differentiation: the bare essentials.</a> J Cell Biol. 111, 2807-2814 (1990).</li><li>Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+cultured+human+epidermal+cells+into+multiple+epithelia+suitable+for+grafting.">Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5665-5668 (1979).</li><li>Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+cancer+in+human+skin+tissue.">Modelling cancer in human skin tissue.</a> Nat Rev Cancer. 6, 270-280 (2006).</li><li>Parenteau, N. L., Bilbo, P., Nolte, C. J., Mason, V. S., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organotypic+culture+of+human+skin+keratinocytes+and+fibroblasts+to+achieve+form+and+function.">The organotypic culture of human skin keratinocytes and fibroblasts to achieve form and function.</a> Cytotechnology. 9, 163-171 (1992).</li><li>Oh, J. W., Hsi, T. C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+skin+culture.">Organotypic skin culture.</a> J Invest Dermatol. 133, e14 (2013).</li><li>Sen, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZNF750+Is+a+p63+Target+Gene+that+Induces+KLF4+to+Drive+Terminal+Epidermal+Differentiation.">ZNF750 Is a p63 Target Gene that Induces KLF4 to Drive Terminal Epidermal Differentiation.</a> Dev Cell. 22, 669-677 (2012).</li><li>Sen, G. L., Webster, D. E., Barragan, D. I., Chang, H. Y., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+differentiation+in+a+self-renewing+mammalian+tissue+by+the+histone+demethylase+JMJD3.">Control of differentiation in a self-renewing mammalian tissue by the histone demethylase JMJD3.</a> Genes Dev. 22, 1865-1870 (2008).</li><li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Zhang, K., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAI2+controls+the+undifferentiated+state+of+human+epidermal+progenitor+cells.">SNAI2 controls the undifferentiated state of human epidermal progenitor cells.</a> Stem Cells. 32, 3209-3218 (2014).</li><li>Truong, A. B., Kretz, M., Ridky, T. W., Kimmel, R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p63+regulates+proliferation+and+differentiation+of+developmentally+mature+keratinocytes.">p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes.</a> Genes Dev. 20, 3185-3197 (2006).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR.">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493, 231-235 (2013).</li><li>Ridky, T. W., Chow, J. M., Wong, D. J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+three-dimensional+organotypic+neoplasia+from+multiple+normal+human+epithelia.">Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia.</a> Nat Med. 16, 1450-1455 (2010).</li><li>Mistry, D. S., Chen, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+function+in+self-renewing+human+epidermis+is+maintained+by+the+exosome.">Progenitor function in self-renewing human epidermis is maintained by the exosome.</a> Cell Stem Cell. 11, 127-135 (2012).</li><li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+progenitor+differentiation+requires+the+long+noncoding+RNA+ANCR.">Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR.</a> Genes Dev. 26, 338-343 (2012).</li><li>Mulder, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+epigenetic+strategies+interact+to+control+epidermal+differentiation.">Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation.</a> Nat Cell Biol. 14, 753-763 (2012).</li><li>Boxer, L. D., Barajas, B., Tao, S., Zhang, J., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZNF750+interacts+with+KLF4+and+RCOR1,+KDM1A,+and+CTBP1/2+chromatin+regulators+to+repress+epidermal+progenitor+genes+and+induce+differentiation+genes.">ZNF750 interacts with KLF4 and RCOR1, KDM1A, and CTBP1/2 chromatin regulators to repress epidermal progenitor genes and induce differentiation genes.</a> Genes Dev. 28, 2013-2026 (2014).</li><li>Jameson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IQGAP1+scaffold-kinase+interaction+blockade+selectively+targets+RAS-MAP+kinase-driven+tumors.">IQGAP1 scaffold-kinase interaction blockade selectively targets RAS-MAP kinase-driven tumors.</a> Nat Med. 19, 626-630 (2013).</li><li>Mistry, D. S., Chen, Y., Wang, Y., Sen, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+SNAI2+regulated+genes+in+primary+human+keratinocytes.">Transcriptional profiling of SNAI2 regulated genes in primary human keratinocytes.</a> Genomics data. 4, 43-46 (2015).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339, 823-826 (2013).</li><li>Doebis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+epithelial+cells+and+keratinocytes+with+improved+adenoviral+gene+transfer+for+the+application+in+skin+tissue+engineering.">Efficient in vitro transduction of epithelial cells and keratinocytes with improved adenoviral gene transfer for the application in skin tissue engineering.</a> Transpl immunol. 9, 323-329 (2002).</li><li>Melo, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+correction+of+junctional+epidermolysis+bullosa+by+a+highly+recombinogenic+AAV+variant.">Somatic correction of junctional epidermolysis bullosa by a highly recombinogenic AAV variant.</a> Mol Ther. 22, 725-733 (2014).</li><li>Nanba, D., Matsushita, N., Toki, F., Higashiyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+expansion+of+human+keratinocyte+stem/progenitor+cells+carrying+a+transgene+with+lentiviral+vector.">Efficient expansion of human keratinocyte stem/progenitor cells carrying a transgene with lentiviral vector.</a> Stem cell res ther. 4, 127 (2013).</li><li>Sen, G. L., Reuter, J. A., Webster, D. E., Zhu, L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNMT1+maintains+progenitor+function+in+self-renewing+somatic+tissue.">DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue.</a> Nature. 463, 563-567 (2010).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).</li><li>Krejci, N. C., Cuono, C. B., Langdon, R. C., McGuire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+of+skin:+fibroblasts+facilitate+keratinocyte+growth+and+differentiation+on+acellular+reticular+dermis.">In vitro reconstitution of skin: fibroblasts facilitate keratinocyte growth and differentiation on acellular reticular dermis.</a> J Invest Dermatol. 97, 843-848 (1991).</li><li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+skin+models+in+drug+development.">The use of skin models in drug development.</a> Adv Drug Deliv Rev. 69-70, 81-102 (2014).</li></ol>

We have nothing to disclose.

מניפולציה גנטית בעור אנושי תרבויות organotypic מציעות יתרונות רבים ללמדה נפוצה 2D תאים בתרבית וכן מודלים של עכברים. תרבויות 2D חסרות שלוש אינטראקציות מטריצת ממדי תא-תא ותא-תאי נמצאות ברקמות ואיברים שלמים. גם מחקרים שנעשו לאחרונה מצאו הבדלים עצומים בין תאי סרטן העור תרבותיי...

האפידרמיס האנושי הוא אפיתל מרובדת המתחבר לדרמיס הבסיס באמצעות מטריקס הידוע כהאפידרמיס zone.The הקרום במרתף לא רק משמש כמחסום בלתי חדיר כדי למנוע אובדן הלחות, אלא גם כקו הגנה ראשון כדי להגן על גוף מחומרים זרים ורעילים 1. שכבת הבסיס, המהווה את השכבה העמוקה ביותר של האפידרמיס, מכילה תאי גזע אפידרמיס ואב שיוצרים צאצאים המובחנים שמהווים את שאר האפידרמיס 2. כתאי אפידרמיס להבדיל הם נודדים כלפי מעלה כדי ליצור את השכבה הראשונה של תאים מובחנים הידועים כשכבת spinous 3. בשכבת spinous, תאים להפעיל את הביטוי של keratins 1 ו -10, אשר לאחר מכן לספק הכוח לעמוד בפני לחץ פיזי לשכבות מובחנות של האפידרמיס. כתאי שכבת spinous נוספים להבדיל, הם עוברים כלפי מעלה באפידרמיס למ &#39;שכבת גרגרים אשר מאופיינת על ידי ההיווצרות של גרגרי keratohyalin ושבשבת כמו גם חלבונים מבניים שהם התאספו מתחת קרום הפלזמה. כמו התאים להמשיך בתהליך ההתמיינות, החלבונים מתחת קרום הפלזמה הם צלב מקושרים זה לזה בזמן שגרגרי שבשבת נמתחים מהתאים ליצירת שומנים מחסום עשיר נקרא השכבה קרנית 4. מחלות שקשורים לשינויים בצמיחת אפידרמיס והשפעת בידול ~ 20% מהאוכלוסייה 5. לפיכך, הבנת המנגנונים של תהליך זה היא בעל חשיבות רבה. מאז גילוים של רבים ממחלות אלה מותנה קשר תאי תאים או תא-מטריקס, תרבויות organotypic בי האפידרמיס האנושי מחדש בסביבת 3D נוצרו 6-10. שיטות אלו בדרך כלל כרוכות בשימוש בקרטינוציטים ראשוניים או הפכו זרע על מטריקס כגון אדם חסר חיוניותדרמיס, Matrigel, או קולגן. כדי להבין את מנגנוני רגולציה גן שהם חשובים בגדילה באפידרמיס ובידול, ניתן להשפיע קרטינוציטים גנטיים באמצעות וקטורי retroviral למציאה או ביטוי יתר הגנים בתרבות 2D ולאחר מכן מחדש ב3D. שיטות אלה היו בשימוש נרחב כדי לאפיין את הגנים מעורבים בגזע אפידרמיס והתחדשות עצמית תא אב ובידול, כמו גם התקדמות לגידולים 11-21. כאן, פרוטוקול מעמיק על איך לשנות ביטוי גנים בתרבויות organotypic אפידרמיס באמצעות רטרווירוסים מסופק.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human skin</td>
			<td>New York Firefighters Skin Bank</td>
			<td><a href="http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html">http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEN/STREP</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amphotropic phoenix cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3213</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE 6 transfection reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2691</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Media (KCSFM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17005042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11995</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F12</td>
			<td>Cambrex</td>
			<td>12-615F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10437-028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-9795</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;C-8052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>3896</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-1882</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13247-051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0665</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin Hydrochloride</td>
			<td>Serologicals</td>
			<td>89-001-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cautery</td>
			<td>Bovie Medical Corporation</td>
			<td>AA01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratin 1 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>PRB-149P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square pegs</td>
			<td>Arts and crafts stores</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human neonatal keratinocytes</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-200-010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human neonatal keratinocytes</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>102K-05n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSCV retroviral vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>634401</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LZRS retroviral vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSuper.Retro.Puro Retroviral vector</td>
			<td>Oligoengine</td>
			<td>VEC-PRT-0002&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexadimethrine bromide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genetically modified organotypic skin cultures using devitalized human dermis

תרבויות organotypic לאפשר הכינון מחדש של סביבת 3D קריטית עבור אינטראקציות מגע תאי תאים ותא-מטריצה ​​אשר מחקה את הפונקציה ופיזיולוגיה של עמיתיהם בvivo רקמה. זה בא לידי ביטוי על ידי תרבויות עור organotypic שנאמנות מסכמת את בידול אפידרמיס ותכנית ריבוד. קרטינוציטים אפידרמיס אנושיים עיקריים הם גנטי מניפולציה באמצעות רטרווירוסים שבו ניתן ביטוי יתר בקלות או הפילו את הגנים. קרטינוציטים מהונדסים גנטי אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להתחדש האפידרמיס אנושי בתרבויות עור organotypic מתן מודל רב עוצמה כדי לחקור מסלולים גנטיים צמיחה להשפיע אפידרמיס, בידול, והתקדמות מחלה. הפרוטוקולים שהוצגו כאן לתאר שיטות להכנת עור אנושי חסר חיוניות, כמו גם לבחינה גנטית לתפעל קרטינוציטים אדם ראשיים, במטרה ליצור תרבויות עור organotypic. עור אדם מחדש ניתן להשתמש בdownstrיישומי EAM כגון פרופיל ביטוי גנים, immunostaining, וimmunoprecipitations הכרומטין אחרי רצף תפוקה גבוה. כך, דור של תרבויות עור organotypic אלה מהונדסים גנטיים יאפשר הקביעה של גנים שהם קריטיים לשמירה על הומאוסטזיס עור.

הצעד הראשון ביצירת העור אנושי organotypic הוא להסיר את העור מהעור. הדגירה של השבועיים של העור על 37 מעלות צלזיוס ב4x העט / סטרפטוקוקוס / PBS צריכה לאפשר ההפרדה של הדרמיס מהאפידרמיס (איור 1 א). אם מפריד את האפידרמיס והדרמיס הוא קשה ואז למקם את הרקמה על 37 מעלות צלזיוס בעט / ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis at JoVE.com

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

generation-genetically-modified-organotypic-skin-cultures-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K Views.  UCSD Stem Cell Program, University of California, San Diego. The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis. 

Video: Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

Transfection, בחירה, ומושבת קטיף של תאי גזע האנושי המושרה pluripotent Talen-ממוקד עם גן GFP לSafe Harbor AAVS1

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

דור של תאי גזע האינטגרציה נטול האדם המושרה pluripotent שימוש קרטינוציטים נגזר שיער

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

A Modified Trier Social Stress Test for Vulnerable Mexican American Adolescents

The Trier Social Stress Test (TSST) is a well validated and widely used social stressor that has been shown to induce a 2-4 fold increase in cortisol, the biological output produced by the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) axis in humans. While studies have explored how modifications to the TSST influence stress responsivity, few studies have created a modified TSST appropriate for vulnerable youth that elicits a significant cortisol stress response. Thus, the current study sought to modify or adjust the TSST in a culturally sensitive way for a vulnerable sample of 14 year-old adolescents. The present study took place within the context of a longitudinal birth cohort study of Mexican American families in California called the Center for the Health Assessment of Mothers and Children of Salinas (CHAMACOS). The CHAMACOS sample was optimal to test the effectiveness of a modified culturally appropriate TSST, as it is comprised of Mexican American youth, who are often excluded from research. These youths also have experienced significant early life adversity. Example modifications included timed prompts, alternative math tasks, use of same-ethnicity peers as confederates, debriefing immediately after the conclusion of the TSST, and using an unknown youth examiner to administer the debrief. Saliva samples were collected at baseline (after a resting phase), and then again at 15, 30, and 45 min post-TSST onset to assess cortisol concentration. A pilot study of 50 participants (50% female) have been analyzed for cortisol reaction to the TSST. Results confirmed that this modified version of the TSST was successful at eliciting a significant cortisol reaction, with a wide range of variability likely due to individual differences. Goals for modifications and ethnicity considerations are discussed. This study provides the foundation for future research to utilize a modified TSST with vulnerable youth.

Here, we present a protocol that provoked cortisol reactivity in a vulnerable adolescent Mexican American sample utilizing a modified version of the Trier Social Stress Test (TSST). Saliva samples were collected at baseline, 15, 30, and 45 min post-TSST onset. Future research could utilize this modified TSST with vulnerable youth.

מבחן שינוי חברתי של טריגר חברתי למבוגרים מתבגרים מקסיקנים אמריקנים פגיעים

The Trier Social Stress Test (TSST) is a well validated and widely used social stressor that has been shown to induce a 2-4 fold increase in cortisol, the ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

דור, Culturing של ראשי Keratinocytes האדם מן העור למבוגרים

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...