Les détails fournis dans ce protocole, traitent de la génération équivalente de peau humaine, qui est souvent techniquement difficile. De nouveaux éléments de protocole équivalents à la peau humaine, tels que la vascularisation et l’imagerie volumétrique, sont inclus. La technique permet la construction simple d’un modèle de peau qui correspond plus étroitement aux tissus in vivo pour l’étude des maladies, du vieillissement et de la médecine personnalisée.
La partie la plus difficile de ce protocole est une transition entre la submersion et l’interface air-liquide. Il faudra probablement quelques essais pour optimiser le calendrier et les niveaux de médias pour des résultats cohérents. Pour commencer, ajoutez 516 microlitres de milieux à un tube à calage froid et ajoutez immédiatement 375 microlitres de collagène froid à l’aide de la pipette à déplacement positif de 1000 microlitres.
Retirez la pointe vide de la pipette et passez à la pipette à déplacement positif de 250 microlitres préparée pour mélanger. Mélanger rapidement, mais doucement pour éviter la formation excessive de bulles. En gardant la pointe dans la solution, mélanger uniformément à partir de différentes positions du tube jusqu’à ce que la solution soit de couleur homogène, ce qui prend généralement environ cinq cycles de pipette ou 10 secondes.
Disperser immédiatement 125 microlitres de collagène acellulaire sur la membrane de l’insert de culture de 12 puits. Pour assurer une couverture uniforme, inclinez la plaque et utilisez la pointe de la pipette pour peindre la membrane en étalant doucement le collagène. Déplacez immédiatement la plaque de 12 puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pour la laisser geler pendant au moins 20 minutes.
Après la période de gélification, sortez la plaque de collagène acellulaire de 12 puits de l’incubateur. Retirez le tube coiffé de 1,7 millilitre de la glace humide, puis retirez le collagène d’origine de la réfrigération et placez-le sur de la glace humide avec le couvercle ouvert. Ajouter 516 microlitres de suspension cellulaire refroidie au tube à calage froid.
Utilisez la pipette de 1000 microlitres pour pipeter immédiatement 375 microlitres de solution de collagène froid directement dans la solution à l’intérieur du tube coiffé. Expulser tout le collagène de la pipette dans le tube et jeter la pointe de la pipette à déplacement positif. Passez immédiatement à la pipette de 250 microlitres et mélangez la solution de collagène Une fois mélangée, transférez 250 microlitres de solution de collagène cellulaire sur les supports de collagène acellulaires dans l’insert de culture à 12 puits, puis déplacez la plaque de 12 puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius.
Après le temps de gel de 30 minutes, inclinez doucement la plaque pour évaluer la gélification et assurez-vous que le collagène s’est solidifié. Ajouter 500 microlitres et 1000 microlitres de mélange à la chambre supérieure et à la chambre inférieure de l’insert, respectivement. Assurez-vous que le gel de collagène est immergé, en ajoutant plus de milieux si nécessaire.
Placez la plaque de puits dans l’incubateur de culture cellulaire pour une incubation de nuit. Le septième jour de submersion, utilisez une pipette manuelle pour recueillir et jeter les médias de la chambre inférieure et supérieure de chaque puits de construction. Pour recueillir les supports coincés directement sous la membrane perméable, placez la pointe de la pipette sous la membrane, en faisant tomber temporairement l’insert.
Ajoutez un millilitre d’équivalent de peau humaine ou de support HSE complété par 5% FPS à la chambre inférieure de chaque puits et 200 microlitres de suspension cellulaire à la chambre supérieure de chaque puits. Ensemencer les kératinocytes directement sur la surface de construction cutanée et laissez-les se déposer pendant deux heures dans l’incubateur. Deux heures après l’ensemencement des kératinocytes, ajoutez soigneusement 300 microlitres de milieux HSE, complétés par 5% FPS à la chambre supérieure de chaque puits de construction.
Après avoir chargé le support, replacez la construction dans l’incubateur. À l’aide d’une pipette manuelle, soulevez chaque construction à leur interface air-liquide, ou ALI, en retirant les déchets de médias de la chambre haute seulement. Essayez de vous rapprocher le plus possible de la couche épidermique sans la toucher ou l’endommager.
Inclinez légèrement les plaques à différents angles pour recueillir le support, puis ajoutez environ deux millilitres d’eau stérile aux puits environnants dans la plaque pour maintenir une humidité constante. Vérifiez la plaque quelques heures plus tard pour vous assurer que les kératinocytes sont toujours à la LAI. Retirez tous les supports de la Chambre haute, en gardant une trace de la quantité de médias qui est retirée de chaque puits.
Les couches épidermiques doivent avoir l’air hydratées, pas sèches, mais il ne doit pas y avoir de milieux regroupés au-dessus de la construction. Pour préparer la construction à la coloration immunofluorescente, tournez un insert à l’envers et placez-le sur son puits sur la plaque du puits. Stabiliser l’insert d’une main tout en utilisant une pince à pointe fine ou un couteau de précision pour couper environ la moitié de la circonférence de la membrane.
Couper le plus près possible du boîtier en plastique. À l’aide de la pince à pointe fine, saisissez le bord du rabat de membrane coupé et décollez doucement la membrane poreuse de l’insert ainsi que la construction VHSE. Si la construction se coince sur le côté de la chambre, utilisez la pince à pointe fine ou une petite pelle pour la déplacer vers le puits.
Une fois que le VHSE est dans le puits, jetez tous les morceaux restants de la membrane d’insertion et gardez le boîtier de l’insert de culture dans chaque puits pour maintenir les VHSE en position immergée pendant la coloration. Deux jours avant l’imagerie, préparer le polydiméthylsiloxane ou PDMS. Placez tout récipient de mélange propre sur une balance de pesée et tarez la balance.
Ajoutez la base, puis ajoutez le réticule. Remuez vigoureusement la solution pendant au moins quatre minutes, en créant de petites bulles. Après un mélange suffisant, versez le PDMS dans une boîte de Pétri de 90 ou 100 millimètres.
Dégaz le PDMS dans une chambre à vide jusqu’à ce que toutes les bulles disparaissent et que le PDMS soit clair. Relâchez le vide lentement et retirez le PDMS. Placez le plat dans un four pour le faire durcir pendant la nuit à 50 à 60 degrés Celsius, en vous assurant que le plat est assis à plat pour que PDMS durcisse uniformément.
Un jour avant l’imagerie, utilisez un poinçon en acier ou un couteau de précision portatif pour poinçonner ou découper un puits circulaire de la feuille PDMS, à peu près de la même taille que la construction VHSE. Coupez une tache carrée autour du puits circulaire pour créer un seul puits PDMS. À l’aide d’un couvercle en verre d’une taille similaire à celle du PDMS, ajoutez de la colle cyanoacrylate à la surface inférieure du PDMS et étalez uniformément une pointe de pipette jetable.
Centrez le verre et appuyez dessus sur le PUITS PDMS tout en laissant une fenêtre en verre transparent dans le cercle perforé. Laissez sécher la colle pendant la nuit avant de l’utiliser. La caractérisation de l’épiderme et du derme montre les marqueurs immunofluorescents appropriés pour la peau humaine dans les constructions VHSE.
Cytokeratin 10 est un marqueur tôt de keratinocyte de différenciation qui marque habituellement toutes les couches suprabasal dans des équivalents de peau. L’involucrine et le filaggrin sont des marqueurs de différenciation tardifs dans les kératinocytes et marquent les couches les plus suprabasales supérieures dans les équivalents cutanés. L’effacement du VHSE a permis une imagerie simple dans un seul arrangement et a éliminé le besoin de réorienter la construction pour imager le derme et l’épiderme séparément.
Les images volumétriques permettent de générer des rendus 3D pour cartographier la vascularisation tout au long de chaque construction. Les piles d’images ont été chargées dans un logiciel de calcul et un algorithme personnalisé a été utilisé pour le rendu et la quantification 3D. Le squelette a déterminé le centre définitif de chaque navire IV-marqué de collagène et les données en résultant ont été employées pour calculer le diamètre de navire aussi bien que la fraction vasculaire.
Après cette procédure, des méthodes de caractérisation telles que l’analyse de barrière, la microscopie électronique à balayage, les profils lipidiques et d’autres peuvent être effectuées pour comprendre comment la vascularisation affecte spécifiquement la maturation et la stabilité épidermiques. Ce protocole permet des études tissu-pertinentes et cellule type-spécifiques dans un modèle vascularisé de peau. Il est particulièrement adapté à la recherche sur le vieillissement et la médecine personnalisée.
