This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.

The authors have nothing to disclose or any conflicts of interest.

Plante-hôte ARNi médiée par le silençage de gènes dans des pathogènes fongiques a été démontré 27,43, cependant, il n&#39;y a pas de publications montrant la faisabilité du contrôle ARNi médiée par l&#39;accumulation de mycotoxines dans les plantes. Un facteur limitant pour ces études à l&#39;arachide était l&#39;absence d&#39;une méthode pour évaluer une accumulation phénotype sans l&#39;aflatoxine dans les plantes individuelles, que les feuilles ne montrent pas de symptômes sur une infection fongique de gousses souterraines. En outre, l&#39;accumulation sans normalement distribué des aflatoxines, et la nécessité pour les grands échantillons pour l&#39;analyse chimique 15,16 ont entravé la quantification de l&#39;effet potentiel sur l&#39;ARNi une seule plante. La méthode présentée ici se compose de 72 expériences de RH en utilisant cinq graines pour effectuer trois prélèvements 24 h-intervalle en trois exemplaires (tableau 1, figure 7). Par rapport à l&#39;analyse des aflatoxines typique qui ne nécessite pas moins de 100 g de graines, notre procédé est particulièrement approprié pour individual d&#39;événements transgéniques de plants d&#39;arachide qui produisent initialement pas plus de deux ou trois gousses. RNA silencing médiée par la synthèse de l&#39;aflatoxine a été démontrée par la transformation génétique Aspergillus flavus et A. parasiticus. Depuis aflR est un régulateur principal de la production d&#39;aflatoxine dans A. flavus et A. 44,45 parasiticus, il devient une cible intéressante pour le silençage de l&#39;ARN à médiation par les plantes. Cependant, les variations génétiques dans aflR a été démontré chez les espèces d&#39;Aspergillus 46, et ces variantes génétiques pourraient échapper taire si il n&#39;y a pas de séquence parfaite correspondant au signal ARNi produite dans la plante hôte. Ainsi, aflR était l&#39;une des cibles pour réduire au silence dans le vecteur p5XCAPD, mais n&#39;a pas été le seul. Répétitions inversées du gène aflR introduits dans A. flavus et A. parasiticus par transformation conduit à taire et peu ou pas de produition des aflatoxines 47 (McDonald et al., 2005b). Aussi, faire taire le gène AFLD a empêché la production d&#39;aflatoxine jusqu&#39;à 98% en A. flavus et A. parasiticus dans la transformation directe 48. Pour augmenter la probabilité de succès dans notre système, l&#39;arachide a été transformé avec des fragments inversées répétées de cinq gènes impliqués dans la production d&#39;aflatoxine dans A. flavus. Ici, il est indiqué que l&#39;utilisation de p5XCAPD qui cible pour faire taire plusieurs gènes dans la voie de synthèse de l&#39;aflatoxine, 90% des niveaux inférieurs à 100% de l&#39;aflatoxine B 1 et B 2 ont été atteints dans la ligne de 288 à 72, et les niveaux 60-100% inférieurs accumulé dans ligne 288 à 74 par rapport à la commande, lorsque les cotylédons et demi ont été inoculés avec A. flavus, les figures 4, 7. Plus important encore, cette méthode a détecté des différences statistiquement significatives dans l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine par des lignes 288-72, 288-74 contre le contrôle tout au long de l&#39;expérience en appliquant statis paramétriquetics, figure 7. Compte tenu de la petite taille de l&#39;échantillon, il est important de souligner la nécessité d&#39;utiliser une méthode puissante pour détecter les aflatoxines, ces expériences ont été analysés par UPLC qui a une haute résolution, cinq fois de meilleures performances et une sensibilité trois fois plus élevé que HPLC 49. Expression de l&#39;ARNi insert dans 288-74 n&#39;a été détectée dans les cotylédons immatures (jaune) à 24 heures d&#39;incubation. L&#39;insert ARNi n&#39;a pas été détecté par RT-PCR sur des cotylédons matures de 288 à 74 à 24 h, ou sur un groupe d&#39;échéance à 48 h, la figure 6. Ce même phénomène a été observé dans d&#39;autres lignes d&#39;arachides transgéniques ARNi (Arias, RS 2015 non publié), où généralement les transcriptions ARNi ont été détectés que sur des cotylédons immatures à 24 h. Des échantillons d&#39;ARN ont été traités par la DNase avant la synthèse d&#39;ADNc, les données ont été normalisées pour le niveau d&#39;expression d&#39;actine et aucun signe de contamination de l&#39;ADN a été observée. Si l&#39;ADN a pu être présente dans les échantillons, il devraitont été détectés dans les échantillons de 48 h aussi, mais de façon constante que fut pas le cas. Expression sous le contrôle de la 35S-promoteur est pas toujours uniforme; il peut être affecté par des conditions environnementales 50, type de tissu et le stade de développement 51,52. Dans le même temps, dans la voie de l&#39;interférence ARN, le taux de dégradation de l&#39;ARNm et le taux de décroissance siRNA peuvent varier considérablement 53. Il est possible que la dégradation rapide de l&#39;ARNm par le mécanisme de l&#39;interférence ARN aurait pu empêcher la détection de l&#39;ARNm et 48 heures d&#39;incubation. Que l&#39;absence d&#39;expression à 48 h était due à de faibles 35S-promoteur entraîné la transcription ou à la dégradation rapide de l&#39;ARN double brin par Dicer reste sans réponse. Ainsi, la détection de petits ARN par séquençage à haut débit donnerait une meilleure idée sur les processus qui se déroulent à travers ARNi 54 dans ces expériences. Cependant, depuis RNA silencing propage systémique, principalement à travers le phloème de photosynthaïr sources au saccharose puits (dans ce cas arachide graines) 55, le musellement de l&#39;aflatoxine-synthèse peut se produire dans les graines sans expression locale de l&#39;ARNi insert. Beaucoup de recherche reste à faire pour déterminer le niveau de petits ARN interférents (siRNA) nécessaires pour empêcher l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine dans les graines de seuil. Il est important de souligner le fait que les deux, expression de l&#39;ARNm de l&#39;ARNi construire (Figure 6), et l&#39;accumulation des aflatoxines B 1 et B 2 (figure 7) a montré des résultats différents pour les immatures (jaune) vs. mature (marron) cotylédons. Plants d&#39;arachide ont une croissance indéterminée, qui est, ils présentent à la récolte d&#39;une gamme de dosettes échéance, la figure 2. En outre, les graines de différents groupes de maturité diffèrent par leur composition chimique, par exemple., 2,4% de saccharose dans les graines immatures, et de 1,9% en graines matures dans les mêmes conditions sur le terrain 56,57. Ainsi, pour comprendre la réelle efficiency de contrôle d&#39;ARN médiée par l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, il est important d&#39;analyser séparément les groupes de maturité. Une défense naturelle de graines d&#39;arachide est la production de phytoalexines, qui varie dans la diversité des composés produits et leurs quantités relatives en fonction de la maturité des graines et des conditions environnementales 58-61, et il est particulièrement élevé dans les embryons comparativement à 62 cotylédons. Les embryons ont également des concentrations significativement plus élevées d&#39;acides nucléiques, aussi bien ADN et l&#39;ARN que les cotylédons (RS Arias, non publié). Comme graines d&#39;arachide mûrissent, les changements dans leur physiologie et leur composition chimique se produisent 63. Antioxydants phénoliques dans les arachides forme de testa tanins condensés avec une activité fongistatique 64; cela est également évidente dans la couleur de la mésocarpe qui reflète les stades de maturité, jaune au noir 35, comme sa teneur en tanins et composés phénoliques augmente avec la maturité 65. Ainsi, la présence de testa ou d&#39;embryons dans l&#39;expérience, compte tenu de leurs propriétés antimicrobiennes, auraient pu limiter la croissance des champignons et donc surestimé l&#39;effet de l&#39;ARNi au silence, par conséquent, ils ont été enlevés. En outre, la suppression de Testa et embryons permet de limiter les sources de variation dans l&#39;analyse, que la moitié des cotylédons qui porte l&#39;embryon aura plus de phytoalexines et plus de contenu de l&#39;ARN. En plus de l&#39;analyse par groupes de maturité et l&#39;élimination des testa et de l&#39;embryon dans ces expériences, il est important de souligner quelques observations: a) si les résultats sont indiqués pour un maximum de 96 heures d&#39;incubation, il est recommandé de ne pas utiliser plus de 72 h pour obtenir des résultats cohérents, que les graines se dégradent de 96 h; et b), tandis que les cotylédons demi de la même graine, bien échantillonné au hasard, ne constituent pas des échantillons parfaitement indépendants, RT-PCR et l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine dans les événements transgéniques ont montré variation minimale entre les graines. En outre, un spores fongiques précise compte, le volume de l&#39;inoculums de 2 pl, et l&#39;application de spores sur la surface des cotylédons évitant dégoulinant sur les côtés de coupe sont importants pour assurer que les spores germées sont exposés à du tissu végétal. L&#39;eau / agar sur les plaques devrait être à 1,5% (p / v), l&#39;agar mou provoque le ruissellement des spores comme indiqué sur la dernière image de la figure 4 (en bas). Si la disponibilité des semences à partir d&#39;un événement transgénique notamment être limité, l&#39;échantillonnage peut être fait en double exemplaire au lieu de triple obtenir des résultats similaires (par exemple, la figure 7); Cependant, les échantillons en triple aideront à réduire l&#39;erreur-type. La seule limitation de cette méthode est qu&#39;elle nécessite un système très sensible (UPLC) pour la détection de l&#39;aflatoxine / quantification, mais en même temps, ce qui réduit la probabilité d&#39;une surestimation de l&#39;effet de l&#39;ARNi doit aflatoxines pas être détecté par des méthodes moins sensibles. En conclusion, cette méthode offre pour la première fois une approche fiable pour étudier laeffet de l&#39;ARNi dans le contrôle des aflatoxines. Réduire le temps pour une expérience de toute une saison de culture à moins d&#39;une semaine, cette méthode sera énormément accélérer la recherche sur l&#39;ARNi arachide / Aspergillus pathosystème vers l&#39;atténuation et / ou de l&#39;élimination des aflatoxines.

Environ 4,5 milliards de personnes sont exposées de façon chronique aux aflatoxines 1, les substances cancérogènes les plus puissantes connues dans la nature 2. Ces mycotoxines contaminent 25% des cultures vivrières dans le monde 3, y compris le maïs, le manioc, le riz, les noix, les céréales et les épices. 4. Les aflatoxines entraînent des retards de croissance chez les enfants de 5, compromettent le système immunitaire 6, sont présents dans 58% des carcinomes hépatocellulaires-en biopsies humaines 7,8, et tuent des centaines de personnes au cours des flambées périodiques de aflatoxicose 9,10. Les aflatoxines sont des mycotoxines polykétide dérivé normalement produites par Aspergillus flavus et A. parasiticus; aflatoxines B 1 et B 2 sont produites par A. flavus, alors que A. parasiticus produit également des G 1 et G 2. La structure chimique de ces composés et un chromatogramme montrant leur séparation par UPLC sont présentées dans la figure 1. </strong&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig1.jpg" /> Figure 1. Les aflatoxines et RNAi insérer Haut:. Structure chimique (à gauche) et l&#39;exemple de chromatogramme (à droite) des quatre aflatoxines polyketides dérivés les plus courants: B 1, B 2, G 1 et G 2, produite par Aspergillus parasiticus, A . flavus produit B 1 et B 2 Bottom: Schéma de fragments de gènes dans l&#39;ARNi construire p5XCAPD utilisé pour la transformation d&#39;arachide, numéros sous les flèches sont les numéros d&#39;accession de gènes fragment dans le génome d&#39;Aspergillus flavus;. PIV2: la pomme de terre intron; paires de bases;: pb RT_5X_1 et RT_5X_2:. En temps réel des sites d&#39;amorce PCR <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Les pertes économiques dans les exportations en raison de aflatoxines dans l&#39;arachide dépassent seuls 450 millions de dollars américains si calculé sur la base de 4 ng. G -1 limite de l&#39;aflatoxine autorisé pour la consommation humaine dans l&#39;Union européenne 11. Les aflatoxines sont connus depuis 60 ans 12; Toutefois, si de nombreuses pratiques agricoles ont été développés pour en atténuer les effets, y compris l&#39;application d&#39;autres souches fongiques 13,14, aucune méthode uniforme de contrôle existe, et les variétés de plantes résistantes ne sont pas disponibles. Test matériel phytogénétique pour la résistance aux aflatoxines est particulièrement difficile, parce que même dans des conditions propices à l&#39;invasion de l&#39;agent pathogène, l&#39;accumulation de mycotoxines est imprévisible et ne suit pas une distribution normale. Ainsi, les expériences nécessitent généralement de vastes zones de plantation, des centaines de graines et de multiples échantillons de 100-1,700 g pour réduire la variabilité de la 15,16 de données. L&#39;interférence ARN étaitdécouvert en 1998 17; et les avantages de &quot;faire taire&quot; sont actuellement explorées dans un certain nombre de nouvelles applications, par exemple., dans les thérapies humaines contre le cancer du sein métastatique 18, le cancer du foie 19, la leucémie myéloïde 20, et dans la protection des plantes contre les insectes 21 et nématodes 22. Dans les usines, les signaux d&#39;interférence d&#39;ARN peuvent voyager cellule en cellule, avec des petits ARN interférents (siRNA) et de l&#39;ARN de haut poids moléculaire étant responsable pour le gène posttranscriptional systémique taire 23,24, même à l&#39;intérieur des agents pathogènes fongiques qui sont en contact étroit avec la plante hôte 25. L&#39;efficacité de l&#39;ARNi sur le silençage des plantes médiée par des gènes fongiques-pathogène a été décrite dans quelques pathosystèmes végétales, pour ces derniers, l&#39;examen visuel des symptômes dans les parties aériennes des plantes (feuilles) a permis la quantification de la maladie, à savoir, oomycète Bremia dans la laitue 26 , Puccinia chez le blé <sup&gt; 27 et Fusarium dans la banane 28. Beaucoup plus difficile est d&#39;évaluer l&#39;efficacité ARNi pour contrôler les mycotoxines dans les plantes, en particulier les aflatoxines dans les arachides que les feuilles ne présentent aucun symptôme d&#39;infection, les organes envahis (graines) sont sous plusieurs pouces du sol, l&#39;apparition de l&#39;infection est imprévisible, et seul produit chimique l&#39;analyse permet de déterminer la présence d&#39;aflatoxines. En outre, chaque événement transgénique arachide produit normalement quelques graines (4-6 par plante); Par conséquent, le test traditionnel pour une accumulation sans trait d&#39;aflatoxine dans les grandes parcelles de terrain, d&#39;une durée saisons de culture entières, et en utilisant des centaines de graines est pas possible. Une méthode est décrite ici pour analyser en moins d&#39;une semaine, l&#39;ARNi graines d&#39;arachide pour présence de transgène et pour une accumulation sans trait d&#39;aflatoxine, en utilisant seulement quelques graines.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="597">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:256px;">Primers, oligonucleotides</td>
			<td style="width:127px;">DNA Technologies, Coralville, IA, USA</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Dneasy Plant Mini Kit</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">69106</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:256px;">Czapek Dox agar medium</td>
			<td style="width:127px;">Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">CM0095</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Agar</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:123px;">BP 1423</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Freezer -80&#176;C</td>
			<td style="width:127px;">n/a</td>
			<td style="width:123px;">n/a</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Aluminum Oxide, Al2O3</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">A941</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:256px;">SPE Reservoirs 1.5 mL</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">210011</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Frits for 1.5 mL SPE reservoir</td>
			<td style="width:127px;">Grace Davison Discovery Scientific</td>
			<td style="width:123px;">211401</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Autosampler vials</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;">186005221</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="150">
			<td height="150" style="height:150px;width:256px;">Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column</td>
			<td style="width:127px;">Waters Corporation, Milford, MA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:256px;">Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software</td>
			<td style="width:127px;">Thermo Electron Corp., San Jose, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">A6636; A9887; A0138; A0263</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Systat Software 12.2</td>
			<td style="width:127px;">SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">15596-018</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11752-050</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:256px;">ABI 7500 Real-Time PCR</td>
			<td style="width:127px;">Lifetechnologies, Grand Island, NY</td>
			<td style="width:123px;">4406984</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">Luria Broth-Miller</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">R453642</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">pENTR1A</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">A10462</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">LR Clonase II enzyme mix</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11791-020</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:256px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:127px;">NEB Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">M0202L</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Gelrite</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">G1919</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:256px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">D134406</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:256px;">QIAcube robot workstation</td>
			<td style="width:127px;">Qiagen, Valencia, CA</td>
			<td style="width:123px;">9001292</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:256px;">Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin</td>
			<td style="width:127px;">Goldbio, St. Louis, MO</td>
			<td style="width:123px;">cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:127px;">Invitrogen, CA</td>
			<td style="width:123px;">11304-029</td>
			<td style="width:92px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rnai-mediated control of aflatoxins in peanut: method to analyze mycotoxin production and transgene expression in the peanut/aspergillus pathosystem

L&#39;Organisation des Nations Unies pour l&#39;alimentation et l&#39;agriculture estime que 25% des cultures vivrières dans le monde sont contaminées par des aflatoxines. Cela représente 100 millions de tonnes de nourriture détruites ou détournées vers la consommation non-humaine chaque année. Les aflatoxines sont cancérigènes puissants normalement accumulées par les champignons Aspergillus flavus et A. parasiticus dans les céréales, les noix, les légumes racines et les autres produits agricoles. Silence de cinq gènes aflatoxine-synthèse par interférence ARN (ARNi) dans les usines d&#39;arachide a été utilisé pour contrôler l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine après inoculation avec A. flavus. Auparavant, aucune méthode existait pour analyser l&#39;efficacité de l&#39;ARNi dans les événements transgéniques d&#39;arachide individu, que ceux-ci produisent généralement peu de graines, et les méthodes traditionnelles de grandes expériences sur le terrain dans des conditions d&#39;aflatoxine ont été propices pas une option. Sur le terrain, la probabilité de trouver des graines naturellement contaminés est souvent 1/100-1/1,000. En outre, la contamination par l&#39;aflatoxine est pas uniformément répartis. Notre méthode utilise quelques graines par événement transgénique, avec de petits morceaux transformés pour PCR en temps réel (RT-PCR) ou petite séquençage de l&#39;ARN, et pour l&#39;analyse de l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine par chromatographie liquide ultra performance (UPLC). Lignes d&#39;arachide ARNi exprimant 288-72 et 288-74, ont montré jusqu&#39;à 100% de réduction (de p≤0.01) en aflatoxine B 1 et B 2 par rapport à la commande qui se sont accumulés jusqu&#39;à 14.000 ng. G -1 de l&#39;aflatoxine B 1 lorsque inoculé avec aflatoxigènes A. flavus. Comme référence, le total maximum d&#39;aflatoxines autorisées pour la consommation humaine aux Etats-Unis est de 20 ng g -1.. Ce protocole décrit l&#39;application du contrôle de l&#39;ARNi médiée par des aflatoxines dans les graines et les méthodes pour l&#39;évaluation des arachides transgéniques. Nous pensons que son application dans l&#39;élevage d&#39;arachide et autres cultures apportera progrès rapides dans ce domaine important de la science, De la médecine et de la nutrition humaine, et contribueront de manière significative à l&#39;effort international visant à contrôler les aflatoxines, et potentiellement d&#39;autres mycotoxines dans les principales cultures vivrières.

Plasmide p5XCAPD a été fait comme un dérivé de pCAPD 29, et l&#39;a utilisé pour transformer des plantes d&#39;arachide; Ce vecteur porte répétitions inversées de cinq petits fragments, 70-80 pb chacun, de gènes de synthèse de l&#39;aflatoxine-A. flavus séparés par un intron (Figure 1). Fragments de AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (AFLS ou aflJ), AFL2G_05027 (aflatoxine pompe d&#39;efflux, aflep), AFL2G_07228 (CATF / pksA / pksL1), et AFL2G_07731 (pes1) ont été utilisés pour la construction, les numéros sur la figure 1 correspondent à une . flavus annotation du génome au Broad Institute, Cambridge, MA, et la littérature 42. Un total de 99 lignes d&#39;arachide ont été régénérés après être passé par le processus de transformation, 50 étaient positifs par PCR pour NPTII détecté par STN-PCR, et 33 lignes étaient PCR positives et les graines produites. Seulement sept lignes positifs PCR ont été propagées par clonage et testés par le présenméthode de t pour l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, tous les sept montré entre 60% et 100% moins d&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine que le contrôle. Ici, nous montrons les résultats de deux de ces sept lignes. Comme les événements transgéniques individuels produisent généralement peu de graines, une méthode a été développée pour utiliser un nombre minimum de graines tout en étant capable de faire l&#39;analyse statistique paramétrique. Un organigramme de la préparation de l&#39;échantillon et montage expérimental est représenté sur la Figure 5 et le Tableau 1. Bien que la première génération de graines transgéniques est généralement hémizygotes, il est prévu que la cellule à cellule et la circulation systémique de petits ARN interférents (siRNA) générés par interférence ARN devrait conférer aflatoxine synthèse silence dans toute la plante. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig5.jpg" /> Figure 5. organigramme schématique de la méthode pour analyser l&#39;efficacité de l&#39;ARNi à faire taire </strong&gt; Aspergillus gènes aflatoxine-synthèse dans les graines d&#39;arachide. Représentation graphique du flux de travail lors du traitement des échantillons d&#39;arachide pour l&#39;expression du gène ou de l&#39;analyse de l&#39;aflatoxine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> ARNi lignes d&#39;arachide 288-72 et 288-74 ont montré la présence de l&#39;sélectionnable fabricant NPTII lorsqu&#39;il est testé par STN-PCR, sections de gel sont présentés dans la figure 6 (en haut), les images originales sont disponibles auprès des auteurs sur demande. Plasmide pCAPD n&#39;a pas été utilisé comme témoin de la transformation car il encode répétitions inversées de deux gènes Cmr (résistance au chloramphénicol) et la CCDB (toxine) de l&#39;effet inconnu sur les plantes. PCR en ligne d&#39;arachide négative 288-9 et d&#39;autres qui sont passés par le processus de régénération et a été cultivé dans les mêmes conditions que les lignes ARNi, ont été utilisés comme con négativecontrôle. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53398/53398fig6.jpg" /> . Figure 6. Détection de transgéniques et d&#39;expression en temps réel de l&#39;ARNi insert Haut: monotube, la détection PCR nichée de lignes d&#39;arachides transgéniques ARNi-288-72 et 288-74 ARNi, plantes positives. Contrôles: W (eau), PP (usine positif), MM (Master Mix), p (plasmide p5XCAPD); Les fractions 1/2 1/4 1/8 1/16 représentent des dilutions de 2 fois de l&#39;ADN de fond. PCR en temps réel détection de l&#39;expression du RNAi insert (jeux d&#39;amorces: RT_5X_1, RT_5X_2, comme sur la figure 1, sur immature ( jaune) et matures (cotylédons) brunes de lignées transgéniques à 24 et 48h d&#39;incubation; ligne grise: C T = 1. Les histogrammes représentent les moyens et les barres d&#39;erreur standard (T) de trois échantillons biologiquesavec trois répétitions techniques. La quantification relative de l&#39;insert ARNi a été normalisée par rapport à la gène de ménage actine comme contrôle interne et comparative fois l&#39;expression du transgène, calculée comme indiqué en 5.2.2 et 5.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Pour tester l&#39;efficacité du contrôle éventuelle des plantes-hôte ARNi médiée de l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine, conidies fraîchement récoltées d&#39;Aspergillus flavus NRRL 3357 ont été appliquées sur la surface de coupe des cotylédons et demi à partir de laquelle avaient été enlevés les embryons et testa (figures 3, 4). A. flavus NRRL 3357, dont le génome a été séquencé et a servi de base pour la conception p5XCAPD, a été aimablement fourni par le Dr Horn USDA-ARS-NPRL. L&#39;invasion fongique résultant de la moitié cotylédons après 24, 48 et 72 heures à 30 ° C est spectacle<html> n sur la figure 4. Des échantillons de cotylédons demi inoculés ont été prélevés à 24, 48, 72, 96 h d&#39;incubation et analysés pour l&#39;essentiel quatre aflatoxines B 1, B 2, G 1 et G 2 en utilisant UPLC et confirmée par LC-MS ; résultats sont présentés sur la figure 6. Les concentrations de l&#39;aflatoxine ont été déterminées en utilisant un procédé publié, avec les adaptations 36. A 96 heures d&#39;incubation, les cotylédons commencent à se désintégrer en raison de l&#39;infection fongique. Ligne ARNi 288-72 exposé baisse significative des niveaux d&#39;aflatoxines que le contrôle à toutes les dates d&#39;échantillonnage dans les cotylédons immatures et à la plupart des dates d&#39;échantillonnage dans les arrivées à maturité. Ligne ARNi 288-74 montré des niveaux significativement plus bas d&#39;aflatoxines dans la plupart des dates d&#39;échantillonnage. Les niveaux de signification du test de Tukey sont indiqués par des astérisques dans le graphique de la figure 7. <html> g7.jpg &quot;/&gt; . Figure 7. aflatoxines B 1 et B 2 dans la moitié cotylédons d&#39;arachide après incubation (24, 48, 72 et 96 h) avec Aspergillus flavus contrôle: graines de ligne 288-9 non transgénique; ARNi: graines de RNAi-288-72 et 288-74 ARNi, transgénique pour ARNi p5XCAPD au silence cinq gènes aflatoxine-synthèse. (A) l&#39;aflatoxine B 1 dans les graines matures (brun); (B) les aflatoxines B 2 graines matures; (C) l&#39;aflatoxine B 1 dans les graines immatures (de jaune) et (D) les aflatoxines B 2 dans les graines immatures. Les valeurs moyennes avec les barres d&#39;erreur standards correspondants (T) d&#39;échantillons biologiques en double sont représentés. Des différences statistiquement significatives test * de Tukey: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Dans l&#39;ensemble, l&#39;ARNi a montré 288-72 long de l&#39;expérience (24 à 96 h d&#39;incubation), une réduction de 94% -100% de l&#39;aflatoxine B 2, et une réduction de 90% -100% de l&#39;aflatoxine B 1 par rapport au témoin. RNAi-288-74 a montré une réduction de 63% -100% de l&#39;aflatoxine B 2 et 60% -100% de réduction dans l&#39;aflatoxine B 1, la figure 7. Amorces utilisées pour la détection par PCR en temps réel de l&#39;expression de l&#39;insert ARNi sont présentés dans la figure 1. Cotylédons arachides semences ont été analysés sans embryons, de retirer leurs défenses naturelles et être capable de détecter l&#39;effet potentiel de l&#39;ARNi sur la zone la plus exposée aux l&#39;invasion fongique, les cotylédons. Expression de l&#39;ARNi insert détecté dans les cotylédons immatures (jaune) de la ligne 288 à 74 par jeu d&#39;amorces RT_5X_1 était quatre fois au cours de la C T </sub&gt; = 1 seuil du contrôle négatif, et en ensemble d&#39;amorces RT_5X_2 était 19 fois au-dessus du seuil, le tout à 24 heures d&#39;incubation. Au moins trois des cinq fragments de gène consécutifs utilisés dans la transformation d&#39;arachide, 5027, 7223 et 7228 (aflep, AFLS / aflJ, et AFLC / pksA, respectivement) ont été détectés par RT-PCR (Figure 1, 6). Expression de l&#39;insert ARNi n&#39;a pas été détecté dans les cotylédons matures à 24 h, ou sur cotylédons matures ou immatures, à 48 heures d&#39;incubation, la figure 6 (en bas). <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="65" rowspan="3" style="height:65px;width:64px;"> Peanut Ligne </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Durée de l&#39;échantillonnage </td><td colspan="3" style="width:192px;"> Les échantillons pour RT-PCR </td><td colspan="3" rowspan="2" style="width:192px;"> Les échantillons destinés à l&#39;analyse des aflatoxines (inoculé) </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> Nombre de semences </td></tr><tr height="22"><td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:192px;"> (non inoculé) </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td><td style="width:64px;"> Rep 1 </td><td style="width:64px;"> Rep 2 </td><td style="width:64px;"> Rep 3 </td></tr><tr height="22"><td height="66" rowspan="3" style="height:66px;width:64px;"> ARNi (jaune) </td><td style="width:64px;"> 24 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 48 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><tdstyle = &quot;width: 64px;&quot;&gt; 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> 72 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> Contrôle </td><td style="width:64px;"> 24 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td rowspan="3" style="width:64px;"> 4.5 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"> (jaune) </td><td style="width:64px;"> 48 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td&gt; <td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:64px;"></td><td style="width:64px;"> 72 h </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td><td style="width:64px;"> 1 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Exemple de montage de petits échantillons pour analyser l&#39;expression des gènes et de l&#39;accumulation de l&#39;aflatoxine dans les ARNi graines d&#39;arachide. L&#39;analyse complète d&#39;expression et d&#39;aflatoxines pour un groupe de maturité (ie., Jaune), avec trois périodes d&#39;échantillonnage (24, 48 et 72 h) , en trois exemplaires, exigerait 4,5 semences, chaque numéro un dans le tableau représente la moitié cotylédons.

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RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

Nous démontrons une méthode pour l&#39;analyse des aflatoxines et l&#39;expression du transgène dans les graines d&#39;arachide qui contiennent des signaux ARN interférence pour réduire au silence des gènes de synthèse de l&#39;aflatoxine dans le champignon Aspergillus flavus. Contrôle de l&#39;ARNi médiée par des mycotoxines dans les plantes n&#39;a pas été signalé précédemment.

Contrôle des aflatoxines dans les arachides ARNi médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et Transgene expression dans la Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystème

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

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Research

JoVE Journal

Environment

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

20.8K vues.  United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service.  Nous démontrons une méthode pour l'analyse des aflatoxines et l'expression du transgène dans les graines d'arachide qui contiennent des signaux ARN interférence pour réduire au silence des gènes de synthèse de l'aflatoxine dans le champignon Aspergillus flavus. Contrôle de l'ARNi médiée par des mycotoxines dans les plantes n'a pas été signalé précédemment. 

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Optimize Flue Gas Settings to Promote Microalgae Growth in Photobioreactors via Computer Simulations

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently than plants3, but also synthesize advanced biofuels2-4. Generally, atmospheric CO2 is not a sufficient source for supporting maximal algal growth5. On the other hand, the high concentrations of CO2 in industrial exhaust gases have adverse effects on algal physiology. Consequently, both cultivation conditions (such as nutrients and light) and the control of the flue gas flow into the photo-bioreactors are important to develop an efficient &ldquo;flue gas to algae&rdquo; system. Researchers have proposed different photobioreactor configurations4,6 and cultivation strategies7,8 with flue gas. Here, we present a protocol that demonstrates how to use models to predict the microalgal growth in response to flue gas settings. We perform both experimental illustration and model simulations to determine the favorable conditions for algal growth with flue gas. We develop a Monod-based model coupled with mass transfer and light intensity equations to simulate the microalgal growth in a homogenous photo-bioreactor. The model simulation compares algal growth and flue gas consumptions under different flue-gas settings. The model illustrates: 1) how algal growth is influenced by different volumetric mass transfer coefficients of CO2; 2) how we can find optimal CO2 concentration for algal growth via the dynamic optimization approach (DOA); 3) how we can design a rectangular on-off flue gas pulse to promote algal biomass growth and to reduce the usage of flue gas. On the experimental side, we present a protocol for growing Chlorella under the flue gas (generated by natural gas combustion). The experimental results qualitatively validate the model predictions that the high frequency flue gas pulses can significantly improve algal cultivation.

Flue gas from power plants is a cheap CO2 source for algal growth. We have built prototype &#34;flue gas to algal cultivation&#34; systems and described how to scale up the algal cultivation process. We have demonstrated the use of a mass-transfer bio-reaction model to simulate and to design the optimal operation of flue gas for the growth of Chlorella sp. in algal photo-bioreactors.

Optimiser les réglages des gaz de combustion pour la promotion de la croissance des microalgues en photobioréacteurs via des simulations informatiques

Flue gas from power plants can promote algal cultivation and reduce greenhouse gas emissions1. Microalgae not only capture solar energy more efficiently ...

Recherche

Environnement

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

A Gusseted Thermogradient Table to Control Soil Temperatures for Evaluating Plant Growth and Monitoring Soil Processes

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a series of incubators. A temperature gradient is passively established across the surface of the table between the heated and cooled ends and is lost quickly at distances above the surface. Since temperature is only controlled on the table surface, experiments are restricted to shallow containers, such as Petri dishes, placed on the table. Welding continuous aluminum vertical strips or gussets perpendicular to the surface of a table enables temperature control in depth via convective heat flow. Soil in the channels between gussets was maintained across a gradient of temperatures allowing a greater diversity of experimentation. The gusseted design was evaluated by germinating oat, lettuce, tomato, and melon seeds. Soil temperatures were monitored using individual, battery-powered dataloggers positioned across the table. LED lights installed in the lids or along the sides of the gradient table create a controlled temperature chamber where seedlings can be grown over a range of temperatures. The gusseted design enabled accurate determination of optimum temperatures for fastest germination rate and the highest percentage germination for each species. Germination information from gradient table experiments can help predict seed germination and seedling growth under the adverse soil conditions often encountered during field crop production. Temperature effects on seed germination, seedling growth, and soil ecology can be tested under controlled conditions in a laboratory using a gusseted thermogradient table.

Traditional thermogradient tables create a range of temperatures across the surface. Welding gussets perpendicular to the surface of a thermogradient table will control temperature in depth increasing possible research applications.

Un tableau Gusseted thermogradient pour contrôler la température du sol pour l&#39;évaluation de la croissance des plantes et de suivi des processus de sol

Thermogradient tables were first developed in the 1950s primarily to test seed germination over a range of temperatures simultaneously without using a ...

Production and Measurement of Organic Particulate Matter in the Harvard Environmental Chamber

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric chemistry and climate. The complex production mechanisms and reaction pathways make this a challenging research topic. To address these issues, an environmental chamber, providing enough residence time and close-to-ambient concentrations of precursors for secondary organic materials, is needed. The Harvard Environmental Chamber (HEC) was built to serve this need, simulating the production of gas and particle phase species from volatile organic compounds (VOCs). The HEC has a volume of 4.7 m3 and a mean residence time of 3.4 h under typical operating conditions. It is operated as a completely mixed flow reactor (CMFR), providing the possibility of indefinite steady-state operation across days for sample collection and data analysis. The operation procedures are described in detail in this article. Several types of instrumentation are used to characterize the produced gas and particles. A High-Resolution Time-of-Fight Aerosol Mass Spectrometer (HR-ToF-AMS) is used to characterize particles. A Proton-Transfer-Reaction Mass Spectrometer (PTR-MS) is used for gaseous analysis. Example results are presented to show the use of the environmental chamber in a wide variety of applications related to the physicochemical properties and reaction mechanisms of organic atmospheric particulate matter.

This paper describes operation procedures for the Harvard Environmental Chamber (HEC) and related instrumentation for measuring gaseous and particle species. The environmental chamber is used to produce and study secondary organic species produced from the organic precursors, especially related to atmospheric organic particulate matter.

Production et mesure des particules organiques dans l’enceinte de Harvard

The production and the evolution of atmospheric organic particulate matter (PM) are insufficiently understood for accurate simulations of atmospheric ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current measures to combat such pathogens have proved too conservative and, thus, not sufficiently effective, and they can potentially pose environmental risks. Therefore, it is extremely necessary to identify host-resistance factors to assist in controlling plant diseases naturally through the identification of resistant germplasm, the isolation and characterization of resistance genes, and the molecular breeding of resistant cultivars. In this regard, there is need to establish an accurate, rapid, and large-scale inoculation method to breed and develop plant resistance genes. The rice blast fungal pathogen Magnaporthe grisea causes severe disease symptoms and yield losses. Recently, M. grisea has emerged as a model organism for studying the mechanisms of plant-fungal pathogen interactions. Hence, we report the development of a plant virulence test method that is specific for M. grisea. This method provides for both spray inoculation with a conidial suspension and wounding inoculation with mycelium cubes or droplets of conidial suspension. The key step of the wounding inoculation method for detached rice leaves is to make wounds on plant leaves, which avoids any interference caused by host penetration resistance. This spray/wounding protocol contributes to the rapid, accurate, and large-scale screening of the pathotypes of M. grisea isolates. This integrated and systematic plant infection method will serve as an excellent starting point for gaining a broad perspective of issues in plant pathology.

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Here, we present a protocol to test plant virulence with the plant pathogen Magnaporthe grisea. This report will contribute to the large-scale screening of the pathotypes of fungi isolates and serve as an excellent starting point for understanding the resistant mechanisms of plants during molecular breeding.

Le Test de Infection de plantes : Spray et induite par la plaie de l’Inoculation avec la plante pathogène Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Assessing the Particulate Matter Removal Abilities of Tree Leaves

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on collecting various sized particulate matter (PM) retained on leaf surfaces. We further characterized the retention efficiency of leaves to various sized PM, which will help to assess the abilities of urban trees to remove PM from ambient air quantitatively. 
Taking three broadleaf tree species (Ginkgo biloba, Sophora japonica, and Salix babylonica) and two needleleaf tree species (Pinus tabuliformis and Sabina chinensis) as the research objects, leaf samples were collected 4 days (short PM retention period) and 14 days (long PM retention period) after the latest rainfall. PM retained on the leaf surfaces was collected by means of WC, BC, and UC in sequence. Then, retention efficiencies of leaves (AEleaf) to three types of the various sized PM, including easily removable PM (ERP), difficult-to-remove PM (DRP), and totally removable PM (TRP), were calculated. Only around 23%-45% of the total PM retained on leaves could be cleaned off and collected by WC. When the leaves were cleaned through WC+BC, the underestimation of the PM retention capacity of different tree species was in the range of 29%-46% for various sized PM. Almost all PM retained on leaves could be removed if UC was supplemented to WC+BC. 
In conclusion, if the UC was complemented after the conventional cleaning methods, more PM on leaf surfaces could be eluted and collected. The procedure developed in this study can be used for assessing the PM removal abilities of different tree species.

The ultrasonic cleaning method was applied to elute the particulate matter (PM) retained on leaf surfaces after PM was eluted by the conventional cleaning methods (water cleaning only or water cleaning plus brush cleaning). The methodology can help to improve the estimation accuracy for PM retention capacity of leaves.

Évaluer les capacités d’enlèvement de matière particulaire d’arbre feuilles

Based on the conventional cleaning methods (water cleaning (WC) + brush cleaning (BC)), this study evaluated the influence of ultrasonic cleaning (UC) on ...

Visualizing Efficacy of Pesticides Against Disease Vector Mosquitoes in the Field

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform across ecological zones. To best protect public and veterinary health from these insects, the environmental limitations of pesticides need to be investigated to inform effective use of the most appropriate pesticide formulations and techniques. We have developed a research program to evaluate combinations of pesticides, pesticide application equipment, and application techniques in hot-arid desert, hot-humid tropical, warm and cool temperate, and urban locations to derive pesticide use guidelines specific to target insect and environment. To these ends we designed a system of protocols to support efficient, cost-effective, portable, and standardized evaluation of a diverse range of pesticides and equipment across multiple environments. At the core of these protocols is the use of an array of small cages with colony-reared sentinel mosquitoes (adults and immatures) and sand flies (adults), strategically arranged in natural habitats and exposed to pesticide spray. Spatial and temporal patterns of pesticide efficacy are derived from percent mortality in sentinel cages, then mapped and visualized in a geographic information system. Maps of sentinel mortality data may be statistically compared to evaluate relative efficacy of a pesticide across multiple environments, or to study multiple pesticides in a single environment. Protocols may be modified to accommodate a variety of scenarios, including, for example, the vertical orientation of sentinels in canopy habitats or simultaneous testing of ground and aerial application methods.

The efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects is not uniform across different ecological zones. Here we present a system of techniques using captive vector insects as sentinels for pesticide efficacy to derive electronic maps supporting the standard evaluation of pesticides across multiple environments.

Visualisation de l’efficacité des Pesticides contre les moustiques vecteur de maladie dans le domaine

Efficacy of public health pesticides targeting nuisance and disease-vector insects such as mosquitoes, sand flies, and filth-breeding flies is not uniform ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composition et analyse de la Distribution des bioaérosols sous différentes Conditions environnementales

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&ndash;Environment Interactions

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating a knowledge gap. To meet the challenge of improving crops to feed the growing global population, this gap must be bridged.
Physiological traits are considered key functional traits in the context of responsiveness or sensitivity to environmental conditions. Many recently introduced high-throughput (HTP) phenotyping techniques are based on remote sensing or imaging and are capable of directly measuring morphological traits, but measure physiological parameters mainly indirectly.
This paper describes a method for direct physiological phenotyping that has several advantages for the functional phenotyping of plant&#8211;environment interactions. It helps users overcome the many challenges encountered in the use of load-cell gravimetric systems and pot experiments. The suggested techniques will enable users to distinguish between soil weight, plant weight and soil water content, providing a method for the continuous and simultaneous measurement of dynamic soil, plant and atmosphere conditions, alongside the measurement of key physiological traits. This method allows researchers to closely mimic field stress scenarios while taking into consideration the environment&#8217;s effects on the plants&#8217; physiology. This method also minimizes pot effects, which are one of the major problems in pre-field phenotyping. It includes a feed-back fertigation system that enables a truly randomized experimental design at a field-like plant density. This system detects the soil-water-content limiting threshold (&#952;) and allows for the translation of data into knowledge through the use of a real-time analytic tool and an online statistical resource. This method for the rapid and direct measurement of the physiological responses of multiple plants to a dynamic environment has great potential for use in screening for beneficial traits associated with responses to abiotic stress, in the context of pre-field breeding and crop improvement.

A Telemetric, Gravimetric Platform for Real-Time Physiological Phenotyping of Plant&amp;#8211;Environment Interactions

This high-throughput, telemetric, whole-plant water relations gravimetric phenotyping method enables direct and simultaneous real-time measurements, as well as the analysis of multiple yield-related physiological traits involved in dynamic plant&#8211;environment interactions.

Une plate-forme télémétrique et gravimétrique pour le phénotypage physiologique en temps réel des interactions plante-environnement

Food security for the growing global population is a major concern. The data provided by genomic tools far exceeds the supply of phenotypic data, creating ...

Mistletoe Eradicator - A Novel Tool for Simultaneous Mechanical and Chemical Control of Mistletoe

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic and topic associations with various organisms and at the same time acting as biological pirates, exhausting the host trees by stealing water and nutrients via the haustorium. Many crop and timber trees are attacked by mistletoes, for example, dwarf mistletoes parasitize conifers, representatives of genus Tapinanthus target guava, and Phoradendron mistletoe target pecans. Recently, an increasing infestation of the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) in monoculture stands of common walnuts (Juglans regia L.)&#160;was recorded for the first time during 2018 in different regions of Kashmir Valley, India. The common chemical approach based on the spraying of mistletoe exophytes with the growth regulators, ethephon and glyphosate, was not efficient since V. album resprouted in the next vegetation season. Hand pruning of mistletoe was time-consuming, and a polyethylene covering resulted in the localized rotting of host tissues. The most efficient approach to eradicate mistletoe was the use of a novel tool called Mistletoe Eradicator, which allows to use mechanical and chemical means of mistletoe control simultaneously. It consists of a manipulating pole with the terminal pruning saw having a container filled with the growth regulator, from which the liquid slowly drops onto the saw blade through the nozzle. It allows working both from the ground and in the tree canopy. After the targeted application of 5%-10% ethephon or glyphosate to the base of the just pruned V. album stems (stubs), exophyte resprouting was significantly reduced 9 months after the pruning as compared to the only pruned or sprayed exophytes. An alternative variant of Mistletoe Eradicator was constructed in Ukraine filled just with a food color additive to track the liquid dropping and was successfully tested.

The protocol describes an easy-to-handle tool called Mistletoe Eradicator which combines mechanical and chemical approaches and is efficient in the control of mistletoe infestation on the host trees. The manuscript uses the European mistletoe (Viscum album subsp. album L.) as an example.

Éradicateur de gui - Un nouvel outil pour le contrôle mécanique et chimique simultané du gui

Some species of mistletoes, an aerial plant hemiparasites, play a Janus-like role in ecosystems by being rich biodiversity hotspots due to their trophic ...