We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).

1. FUCCI transduction et culture cellulaire <ol><li> FUCCI transduction <ol><li> Créer des lignées cellulaires exprimant de manière stable le FUCCI construit mKO2-hCdt1 (30-120) et GAM-hGem (1-100) 15 en utilisant la co-transduction lentivirus 7 comme décrit précédemment. Remarque: Le système FUCCI est maintenant disponible dans le commerce. </li><li> Générer sous-clones avec une vive fluorescence par tri seule cellule. Trier simples cellules positives pour les deux AG et KO (jaune) par fluorescence tri cellulaire activé dans une plaque de 96 puits tel que décrit précédemment 7,16. </li></ol></li><li> Culture de cellules de mélanome <ol><li> C8161 Culture des cellules de mélanome humain tels que décrits précédemment 7,17. </li></ol></li></ol> 2. Formation 3D Spheroid (comme décrit précédemment 3,9) <ol><li> La préparation des plaques d&#39;agarose <ol><li> Dissoudre 1,5% d&#39;agarose (gélose noble ou) dans 100 ml de sel équilibré la solution de Hank (HBSS) ou phosphate Buffèred saline (PBS) par ebullition dans le micro-ondes pendant 3 à 5 min en agitant. Assurez-vous que l&#39;agarose est complètement dissous. </li><li> Répartir immédiatement 100 pi de la solution d&#39;agarose par puits à une plaque de 96 puits de culture de tissu à fond plat avec une pipette multi-canal. Remarque: Agarose peut se solidifier dans les conseils après une courte période de temps, pour surmonter ce problème conseils doivent être changés entre les plaques se faisant plus d&#39;une plaque d&#39;agarose. </li><li> Laissez plaque de 96 puits sur une surface plane à durcir agarose pendant au moins 1 h. </li></ol></li><li> La préparation des cellules et la superposition sur agarose <ol><li> Cultiver les cellules à environ 80% de confluence dans un flacon T75. Laver avec 10 ml de HBSS. </li><li> Détacher les cellules en utilisant 1,5 ml de trypsine à 0,05% d&#39;acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et remettre en suspension dans 10 ml de milieu normal. </li><li> Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre 18 ou une autre méthode de comptage automatisé. </li><li> Remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 25.000 cellules / ml dans la normemoyen al. </li><li> Superposez puits agarose avec 200 pi de la suspension de cellules pour un nombre final de 5000 cellules par puits. </li><li> Plaques de retour à l&#39;incubateur de culture cellulaire (5% de CO 2 et 37 ° C) pour former des sphéroïdes plus environ 3 jours. Remarque: Le temps nécessaire pour former un sphéroïde varie entre différentes lignées cellulaires. Certaines lignées cellulaires ne forment pas des sphéroïdes en utilisant cette méthode à tous. </li><li> Image en morphologie sphéroïde avec un microscope inversé en utilisant un objectif de 4X et un filtre à contraste de phase. Une lignée de cellules qui forme avec succès sphéroïdes produiront agrégats cellulaires compacts, plus ou moins sphériques, et il devrait y avoir qu&#39;un seul sphéroïde par puits. Note: Facultatif: Une fois sphéroïdes ont formé, ils peuvent être transplantées dans du collagène ou une autre matrice pour une analyse approfondie de la croissance et de l&#39;invasion 3,7,17. Pour supprimer sphéroïdes à partir de collagène, traiter avec 500 pi de 2 mg / ml de collagénase à 37 ° C jusqu&#39;à ce que le collagène est dissous assez pour le SpherOID à venir librement dans les médias (environ 30 min). Retirez délicatement sphéroïdes utilisant une pipette de 1 ml. </li><li> Pour sectionnement / imagerie sphéroïdes fixes (soit isolés à partir de collagène ou cultivées pendant 3-5 jours sur agarose) à 10% du formol tamponné neutre (ATTENTION: formol doit être utilisé dans une sorbonne) pendant au moins 2 heures à la température ambiante (RT) , ou toute la nuit (O / N) à 4 ° C. Sphéroïdes peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours. </li></ol></li></ol> 3. Spheroid Vibratome sectionnement <ol><li> Dissoudre 5 g d&#39;agarose à faible point de fusion dans 100 ml de HBSS dans un flacon en verre de 500 ml dans un four micro-ondes. Utilisez un réglage de feu moyen en remuant. ATTENTION: Gardez le couvercle lâche lors de l&#39;ébullition de la solution ainsi que la pression peut être libérée. Utilisez des gants de protection résistant à la chaleur pour protéger les mains contre les brûlures lors de la manipulation de la bouteille de verre chaud. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que l&#39;agarose refroidit légèrement - de sorte que la bouteille peut être touché sans brûler les mains. </li><li> Verser approximationron 2 ml d&#39;agarose dans le fond d&#39;un compteur Coulter tasse ou un moule plastique analogue. Aspirer immédiatement un sphéroïde fixe (voir section 2.2.8) en utilisant une pipette de 1 ml dans le plus petit volume de liquide possible. Ajouter à la sphéroïde agarose. Quelques sphéroïdes (jusqu&#39;à 10) peuvent être ajoutés par tasse. </li><li> Couvrir les sphéroïdes avec 2 ml plus d&#39;agarose. Pour ce faire rapidement pour éviter le durcissement agarose avant la deuxième couche est ajouté. </li><li> Laisser la gélose à durcir à température ambiante dans l&#39;obscurité pendant au moins 3 h. A ce point les tasses peuvent être stockés pendant une courte période à 4 ° C avec 2-3 ml de HBSS superposées pour éviter la déshydratation. </li><li> Retirer agarose de la tasse. Coupez le agarose contenant les sphéroïdes afin qu&#39;il tienne sur le bloc de métal vibratome et sphéroïdes sont à proximité du sommet de la gélose. Sphéroïdes peuvent être considérés comme de petits objets blancs à l&#39;intérieur de l&#39;agarose. Super Glue l&#39;agarose au bloc. </li><li> Remplissez le vibratome avec de l&#39;eau distillée et monter le bloc dans la vibratome. Met levibratome pour couper 100 um sections à vitesse lente (réglage 2) et de fortes vibrations (réglage 8). Réglez l&#39;angle de lame de coupe à 16 °. Tournez sur vibratome, allumer la lumière vibratome et couper des sections du haut de l&#39;agarose jusqu&#39;à 100 um sections sphéroïde sont coupés. Placez sections sphéroïde couper en HBSS dans une plaque de 24 puits. </li><li> Choisissez sections intermédiaires pour l&#39;analyse d&#39;image. Sections de montage sur diapositives en transférant la section à plat sur la diapositive à l&#39;aide des pinces. Remplir une seringue de 10 ml baril avec de la graisse à vide; ajoutez une fine ligne de graisse à vide sur les bords de la section afin d&#39;empêcher les médias de montage de courir sur les bords de la diapositive et aider à sceller la section sous la lamelle. Couvrir la section avec un milieu de montage et une lamelle. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Magasin glisse à 4 ° C avant l&#39;imagerie. </li></ol> 4. confocale Image Acquisition <ol><li> Prenez une image z-tranche d&#39;une section de sphéroïde milieu de FUCCI utilisant un 10Xou un objectif 20X comme décrit précédemment 7. Assurez-vous pas de chevauchement ou de la diaphonie se produit entre les Kusabira Orange2 et Azami vert. Si l&#39;on compare l&#39;analyse d&#39;image entre les sections de sphéroïde multiples, maintenir la puissance du laser et d&#39;autres paramètres de la même entre les échantillons. </li></ol> 5. Hoechst Dye Diffusion Essai de débit Tri <ol><li> Transfert sphéroïdes vivants (3-5 jours après l&#39;ensemencement) d&#39;agarose dans un tube de 15 ml. Soit sphéroïdes gravité se déposent au fond du tube. Plusieurs sphéroïdes peuvent être colorées par tube. Environ 20 sphéroïdes sont nécessaires pour obtenir le nombre de cellules suffisant pour cytométrie de flux. </li><li> Retirer moyen excès et ajouter 1 ml de 10 um Hoechst diluées dans le milieu normal. Incuber sphéroïdes à 37 ° C pendant environ 1 heure. Utilisez pichenette douce pour remettre en suspension les sphéroïdes une ou deux fois pendant l&#39;incubation. Remarque: Le temps d&#39;incubation peut être modifiée pour modifier la façon dont loin le colorant Hoechst pénètre dans les sphéroïdes. Cela varie en fonction dela taille de l&#39;ellipsoïde, de la densité et de la lignée cellulaire. Pour certains grands sphéroïdes denses / il peut y avoir une pénétration de colorant maximale qui est inférieure à 100%. </li><li> Laver les sphéroïdes doucement avec 5 ml de HBSS utilisant gravité décantation. <ol><li> Facultatif: Pour l&#39;imagerie de la pénétration de colorant: Fix sphéroïdes avec 10% du formol tamponné neutre pendant au moins 2 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. Préparer vibratome sections, monter sur des lames et de l&#39;image sur le confocale comme décrit dans les étapes 3 et 4 ci-dessus. </li></ol></li><li> Pour préparer les cellules pour cytométrie de flux, Trypsiniser sphéroïdes avec 1 ml de trypsine à 0,05% / EDTA à 37 ° C pendant environ 30 min avec effleurant toutes les 10 min pour briser les sphéroïdes de l&#39;autre. Remarque: Sphéroïdes sont difficiles à obtenir en suspension de cellule unique, les conditions peuvent avoir besoin d&#39;être optimisé. Viabilité de C8161 4 jours anciens sphéroïdes après ce processus est d&#39;environ 95%. </li><li> Cellules tache avec une tache de vivre proche infrarouge / morts selon le protocole des fabricants. Laver avec de l&#39;HBSS puis fixer avec 1ml de 10% de formaline tamponnée neutre pendant environ 30 min. Les cellules peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours avant l&#39;analyse de flux. </li></ol> 6. cytométrie de flux de Hoechst Stained FUCCI Sphéroïdes <ol><li> Assurer cellules ne sont pas agglutinés en les faisant passer à travers un tamis cellulaire. Reprendre le Hoechst tachée sphéroïdes FUCCI dans la glace froide lavage de FACS (PBS avec 5% de sérum de veau foetal) à une concentration de 1-5 x 10 6 cellules / ml. Transférer 200 ul d&#39;échantillon de 5 ml rondes tubes inférieurs. </li><li> Préparer les échantillons uniques de contrôle des couleurs suivantes comme décrit dans 6.1: cellules de mélanome de l&#39;ONU teinté; les cellules de mélanome adhérentes colorées avec 10 uM Hoechst pendant 1 h; Azami Vert exprimant seulement des cellules de mélanome; Kusabira orange et exprimant uniquement des cellules de mélanome. Remarque: simples contrôles de couleur peuvent être fixés dans du formol et entreposés dans FACS laver avec 0,1% d&#39;azoture de sodium à 4 ° C pendant des semaines, voire des mois. </li><li> Suspensions cellulaires seul passage ona cytométrie en flux analyseur avec des lasers appropriés et couleur unique / contrôles non colorées comme décrit précédemment 7,16. </li><li> Utilisez un logiciel de cytométrie commercial comme FlowJo d&#39;analyser l&#39;intérieure vs cellules sphéroïdes extérieures comme suit: <ol><li> Enlever les débris gating sur la principale population de cellules dans l&#39;avenir lumière diffusée (FSC) vs. Side lumière diffusée (SSC). </li><li> Retirer doublets par gating des cellules uniques en utilisant FSC (Région) vs. FSC (Hauteur) </li><li> Porte pour les cellules vivantes par fenêtrage morts la population en direct / faible. </li><li> Définir Hoechst cellules élevés, gated sur la base du signal positif à partir des cellules adhérentes colorés avec Hoechst, que les cellules «extérieur». </li><li> Définir Hoechst cellules faibles ou négatifs, gated basé sur le signal de la commande de non souillé, que les cellules «internes». </li><li> Après déclenchement pour les populations intérieures et extérieures, les cellules peuvent en outre être déclenchés pour FUCCI rouge (G1), jaune (début S), vert (S / G2 / M) ou négative (G1 début). Remarque: CÉMUNÉRATION en utilisant les commandes d&#39;une seule couleur peut être nécessaire de bien définir les populations rouges, jaunes, verts et négatifs FUCCI. </li></ol></li><li> Une fois que le test a été optimisé et la pénétration Hoechst validé par microscopie confocale, les cellules de fonctionner sans fixer sur un trieur de cellules de flux comme décrit précédemment 7,16 pour une analyse approfondie des sous-populations de cellules vivantes. </li></ol> Analyse 7. Image FUCCI sphéroïdes Sections <ol><li> Ouvrir le logiciel, par exemple. Volocity, choisir la configuration SEULEMENT quantification. </li><li> Créer une nouvelle bibliothèque. Importez le FUCCI sphéroïde fichier image confocale dans le logiciel en faisant glisser le fichier de données brutes du confocale dans la bibliothèque. Sinon, utilisez la commande Fichier&gt; Importer. </li><li> Allez à l&#39;onglet des mesures pour construire un protocole d&#39;analyse d&#39;image. Le Protocole est construit en faisant glisser les commandes appropriées dans le bon ordre comme suit dans la fenêtre de protocole. </li><li> Trouver objECTS dans le canal vert: Faites glisser le trouver des objets commande (trouvé dans &quot;constatation&quot;) dans la fenêtre de protocole, sélectionner le canal correct dans les objets de trouvaille protocol.Add une commande d&#39;ouverture (qui se trouve dans le «traitement»), puis un toucher les objets séparés commande (trouvé dans &quot;transformation&quot; - cela va séparer les cellules). Exclure les objets de taille &lt;50 pm (trouvé dans «filtrage» - cela va exclure les petits objets non-cellulaires). Remarque: Les variables telles que le seuil trouver des objets, ouvertes nombre d&#39;itérations, la taille des objets à séparer et la taille des objets à exclure doit être optimisé manuellement jusqu&#39;à ce que les masques d&#39;objet correspondant à l&#39;image. </li><li> Trouvez des objets dans le canal rouge: Répétez trouver des objets comme ci-dessus pour le canal rouge. Peuvent avoir besoin d&#39;être ajustée séparément protocoles verts et rouges. Remarque: En raison de noyaux étant en G2, noyaux verts sont souvent légèrement plus grande. </li><li> Confirmez objets trouvés sont exacts: Confirmation du rouge et objets verts correspondent à lanoyaux rouges et verts dans l&#39;image en éteignant et sur les canaux vert et rouge (en utilisant le masquer ou afficher la commande de canal) tout en affichant les masques rouges et verts trouvés par le protocole. Options de rétroaction (Mesures&gt; options de retour) peuvent être utilisés pour modifier l&#39;apparence des masques d&#39;objets. </li><li> Trouvez des objets jaunes (cellules en phase S précoce): Pour trouver des cellules jaunes, ajouter une intersection rouge avec cellules vertes commande (dans «La combinaison &#39;). Exclure les objets par taille (&lt;50 um, trouvés dans «filtrage») d&#39;exclure les petits objets non-cellulaires. </li><li> Trouvez des objets exclusivement rouges (cellules en phase G1): Pour trouver noyaux exclusivement rouges, soustraire les cellules jaunes de globules rouges (trouvés dans &#39;La combinaison&#39;). Exclure les objets par taille &lt;50 um, (qui se trouve dans «filtrage») pour enlever tous les petits objets non-cellulaires créées. </li><li> Trouvez des objets exclusivement vertes (cellules en phase S / G2 / M): Répétez l&#39;opération pour le canal vert pour trouver exclusivement verte. Nonte: Si il ya encore des objets non-cellulaires restants, une commande de la population de filtre peut être ajouté à des protocoles rouges ou verts Exclusif (trouvés dans «filtrage») pour ne retenir que les objets avec un facteur de forme supérieur à 0,25. Cela permettra d&#39;éliminer les objets non-circulaires. </li><li> Trouver le contour sphéroïde: Trouver le contour de l&#39;aide d&#39;un sphéroïde trouver des objets commande (trouvé dans &quot;constatation&quot;) avec le canal vert ou rouge (selon celui qui a plus de cellules sur le bord du sphéroïde). Un seuil beaucoup plus bas (qui se trouve dans le Trouvez des objets de variables) devra être utilisé pour trouver le contour sphéroïde par rapport à des cellules individuelles. <ol><li> Utilisez une commande proche de rejoindre objets trouvés dans (&#39;Traitement&#39;), puis remplir les trous dans les objets trouvés dans (&#39;Traitement&#39;), puis utiliser un filtre fin (trouvé dans «filtrage») pour supprimer le bruit à partir d&#39;objets. Enfin, exclure des objets de la taille d&#39;enlever des objets plus petits &lt;30 000 um (en fonction de la taille de sphéroïde). Note: Ce protocole devra être optimisée manuellement jusqu&#39;à ce que le contour sphéroïde est exacte. Une image en fond clair peut également être utilisé - mais cela est généralement moins précis avec une section sphéroïde, et une commande Inverser (trouvé dans &#39;La combinaison&#39;) devra être utilisé. </li></ol></li><li> Mesurer les distances de noyaux d&#39;esquisser sphéroïde: Mesurer les distances (trouvés dans «relative») des populations jaunes, exclusivement vertes et exclusivement rouges du centre de gravité de la cellule au bord du sphéroïde outline.To visualiser les distances minimales, qui devrait être de la cellule au bord sphéroïde plus proche, activer l&#39;option Afficher les distances dans l&#39;onglet relations dans les options de rétroaction (Mesures&gt; Options&gt; Rapports de rétroaction). </li><li> Enregistrez le protocole. Ce protocole peut être ré-appliquer à d&#39;autres images en utilisant les mesures&gt; Restaurer commande de protocole. </li><li> Créer un élément de mesure (Mesures&gt; Faire Mesure Point). Les données peuvent être analysées en utilisant l&#39;analysefonctions. <ol><li> Allez à l&#39;onglet d&#39;analyse par le produit des mesures. Allez dans le menu Analyse (Analyse&gt; Analyser) et d&#39;analyser la distance minimale entre le centre de gravité de la cellule (rouge, vert ou jaune) au bord sphéroïde, résumée par le comte et organisée par la population. </li><li> Pour compter le nombre de cellules qui se trouvent à une certaine distance du bord créer un filtre (Analyse&gt; Filtre). Le filtre de distance minimale à la figure 2 est basé sur la pénétration Hoechst (par exemple, la distance minimale est inférieure à 80 donne la population «externe»). Alternativement, l&#39;exportation des données brutes vers un tableur pour une analyse ultérieure. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Hoechst+33342+for+cell+selection+from+multicell+systems.">Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).</li><li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D.">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73 (2013).</li><li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors.">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li><li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent.">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li><li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique.">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li></ol>

PerkinElmer contributed to the costs of publication.

Semi-automatisé d&#39;analyse d&#39;image identifié la région intérieure sphéroïde G1 arrêté, et la prolifération des couches externes. Ce procédé peut être utilisé sur des sphéroïdes sous tension au moyen d&#39;un article optique, ou dans des sections de sphéroïdes fixes, afin d&#39;identifier des changements dans non seulement du cycle cellulaire, mais l&#39;expression du marqueur (par immunofluorescence), la mort cellulaire, ou la morphologie des cellules dans les différentes régions. Motilité cel...

Sphéroïdes multicellulaires 3D ont été connu comme un modèle de tumeur pendant des décennies, mais il est seulement récemment qu&#39;ils sont venus dans l&#39;usage plus fréquent comme un modèle in vitro pour de nombreux cancers solides. Ils sont de plus en plus utilisés dans les écrans de découverte de médicaments à haut débit comme un intermédiaire entre complexe, coûteux et chronophage de modèles in vivo et le simple, le modèle monocouche faible coût 2D 1-6. Études en culture 2D sont souvent incapables de répliquer in vivo. Modèles sphéroïde nombreux types de cancer sont capables d&#39;imiter les caractéristiques de croissance, la sensibilité de la drogue, la pénétration du médicament, interactions cellule-cellule, la disponibilité restreinte du oxygène et de nutriments et le développement de la nécrose qui est vu dans vivo dans les tumeurs solides 6-11. Sphéroïdes développent un coeur nécrotique, une région de repos ou G1 arrêté entourant le noyau, et les cellules en prolifération, à la périphérie de la sphéroïde 7. Le développement de ces régionspeut varier en fonction de la densité cellulaire, le taux de prolifération et la taille de l&#39;ellipsoïde 12. Il a été émis l&#39;hypothèse que l&#39;hétérogénéité cellulaire vu dans ces différentes sous-régions peut contribuer au cancer résistance au traitement 13,14. Par conséquent, la capacité d&#39;analyser les cellules dans ces régions est cruciale séparément réponse aux médicaments compréhension tumorales. Le système d&#39;indicateurs du cycle cellulaire par fluorescence d&#39;ubiquitination (FUCCI) est basé sur le rouge (Kusabira Orange - KO) et vert (Azami Vert - AG) marquage fluorescent de CDT1 et Geminin, qui sont dégradés dans les différentes phases du cycle cellulaire 15. Ainsi les noyaux cellulaires apparaissent en rouge dans le G1, jaune au début de S et vert dans S / phase G2 / M. Nous décrivons ici deux méthodes complémentaires à la fois à l&#39;aide FUCCI pour identifier le cycle cellulaire, de même que l&#39;utilisation d&#39;un logiciel d&#39;imagerie ou d&#39;un flux de diffusion de colorant cytométrie essai pour déterminer si les cellules se trouvent dans le centre de la G1 arrêté ou externe proliferating bague, et la distance des cellules individuelles à partir du bord de la sphéroïde. Ces méthodes ont été développées dans notre publication précédente, où nous avons démontré que les cellules de mélanome dans les régions hypoxiques dans le centre du sphéroïde ou / et en présence de thérapies ciblées sont en mesure de rester dans G1 arrestation pendant de longues périodes de temps, et peut re- entrer dans le cycle cellulaire lorsque des conditions plus favorables proviennent 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose low melting point</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16520-050</td>
			<td>For sectioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>noble agar&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5431</td>
			<td>For making spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose for spheroids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td>For making spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.05% trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT5014-1CS</td>
			<td>CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do &#160;not breath fumes (open in a fume cupboard).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live/dead near IR</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibratome</td>
			<td>Technical Products International, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coulture cup</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>SIE936</td>
			<td>Mold for sectioning spheroids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture plate</td>
			<td>Invitro</td>
			<td>FAL353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer analyser</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>volocity</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flowjo</td>
			<td>Tree Star</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccuum grease</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUCCI (commercial constructs)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36238</td>
			<td>Transient transfection only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 um</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom 5 mL tubes (sterile)</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom 5 mL tubes (non-sterile)</td>
			<td>In Vitro</td>
			<td>FAL352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3d melanoma spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

Il existe plusieurs procédés de production de sphéroïdes de tumeur, ce protocole utilise la méthode de croissance non-adhérente, où les cellules sont mises en culture sur de la gélose ou agarose 3,7,9. La figure 1 montre un exemple d&#39;un sphéroïde C8161 de mélanome dans les 3 jours sur de la gélose. Sphéroïdes C8161 forment sphéroïdes de taille régulière avec un diamètre de 500 - 600 um (moyenne = 565, SD = 19, n = 3) après 3 jours. D&#39;autres lignée...

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

imaging-flow-cytometry-based-analysis-cell-position-cell-cycle-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

12.9K vues.  The Centenary Institute. We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids. 

Vidéo: Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-photon imagerie de l&#39;invasion des cellules tumorales dans un modèle de souris orthotopique du carcinome épidermoïde oral

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Recherche

Médecine

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

Modélisation et Imagerie en 3 dimensions l&#39;invasion des cellules collectives

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

Processing of Primary Brain Tumor Tissue for Stem Cell Assays and Flow Sorting

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction of cells in the tumor with stem cell properties, termed brain tumor initiating cells (BTICs), possess an ability to differentiate along multiple lineages, self-renew, and initiate tumors in vivo. We applied culture conditions originally used for normal neural stem cells (NSCs) to a variety of human brain tumors and found that this culture method specifically selects for stem-like populations. Serum-free medium (NSC) allows for the maintenance of an undifferentiated stem cell state, and the addition of bFGF and EGF allows for the proliferation of multi-potent, self-renewing, and expandable tumorspheres.
To further characterize each tumor's BTIC population, we evaluate cell surface markers by flow cytometry. We may also sort populations of interest for more specific characterization. Self-renewal assays are performed on single BTICs sorted into 96 well plates; the formation of tumorspheres following incubation at 37 &deg;C indicates the presence of a stem or progenitor cell. Multiple cell numbers of a particular population can also be sorted in different wells for limiting dilution analysis, to analyze self-renewal capacity. We can also study differential gene expression within a particular cell population by using single cell RT-PCR.
The following protocols describe our procedures for the dissociation and culturing of primary human samples to enrich for BTIC populations, as well as the dissociation of tumorspheres. Also included are protocols for staining for flow cytometry analysis or sorting, self-renewal assays, and single cell RT-PCR.

The identification of brain tumor initiating cells (BTICs), the rare cells within a heterogeneous tumor possessing stem cell properties, provides new insights into human brain tumor pathogenesis. We have refined specific culture conditions to enrich for BTICs, and we routinely use flow cytometry to further enrich these populations. Self-renewal assays and transcript analysis by single cell RT-PCR can subsequently be performed on these isolated cells.

Traitement des tissus de tumeur cérébrale primaire pour les essais sur les cellules souches et les flux de tri

Brain tumors are typically comprised of morphologically diverse cells that express a variety of neural lineage markers. Only a relatively small fraction ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Patient Culture cellulaire dérivée et isolement de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putatifs cellules souches du cancer du mélanome

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Haut-débit cytométrie en flux test cellulaire pour détecter les anticorps de la N-méthyl-D-aspartate Receptor ou récepteur de la dopamine-2 dans le sérum humain

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Adaptation des semi-automatique de circulation des cellules tumorales (CTC) Essais pour les applications cliniques et précliniques de recherche

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengale Photothrombosis par imagerie optique confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle de l&#39;unité des maladies du navire

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment elevated myocardial infarction. However, reperfusion per se can result in further cardiomyocyte death, a phenomenon known as reperfusion injury. The opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), with the decrease of the mitochondrial membrane potential (MMP), or mitochondrial depolarization, is universally recognized as the final step of reperfusion injury and is responsible for mitochondrial and cardiomyocyte death. JC-1 is a lipophilic cationic dye that accumulates in mitochondria depending on the value of MMP. The higher the MMP is, the more JC-1 accumulates in the mitochondria. The increasing amounts of JC-1 in mitochondria can be reflected by a fluorescence emission shift from green (~530 nm) to red (~590 nm). Therefore, the reduction of the red/green fluorescence intensity ratio can indicate the depolarization of mitochondria. Here, we take advantage of JC-1 to measure MMP, or the opening of mPTP in human cardiac myocytes after hypoxia/reoxygenation, detected by flow cytometry.

Here, we present a protocol that uses JC-1 dye to assess the mitochondrial membrane potential of cells after being exposed to hypoxia/reoxygenation with or without a protective agent.

Un test Flow Cytometry pour mesurer le potentiel de Membrane Mitochondrial dans les Myocytes cardiaques après l’hypoxie/réoxygénation

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.

Here, we describe a detailed and reproducible flow cytometry protocol to identify monocyte/macrophage and T-cell subsets using both extra- and intracellular staining assays within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue, utilizing an established surgical model of murine osteoarthritis.

Analyse de cytométrie de flux des sous-ensembles de cellules immunitaires dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial dans un modèle d’arthrose

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for atherosclerosis research. They are used to study the impact of a various genetic factors and different cell types on atherosclerotic lesion formation and as well as test the development of new therapies. Isolation, excision of the whole aorta, and quantification of Oil Red O-stained atherosclerotic lesions are basic morphometric methods used to evaluate atherosclerotic burden. The goal of this protocol is to describe an optimized, step-by-step surgical method to dissect, perfuse-fix, isolate, stain, image and analyze atherosclerotic lesions in mouse aortas with Oil Red O. Because atherosclerotic lesions can form anywhere in the entire aortic tree, this whole aorta Oil Red O staining method has the advantage of evaluating lipid-laden plaques in the entire aorta and all branches in a single mouse. In addition to Oil Red O staining, fresh isolated whole aortas can be used for variety of in vitro and in vivo experiments and cell isolations.

This protocol provides a step-by-step procedure to analyze atherosclerotic burden in mice. Investigators can use this protocol to compare the abundance, location, and size of atherosclerotic lesions in different animals.